謝元，胡燁燁，李甫，胡衛(wèi)成，張跡，楊曉君，楊猛

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）（2.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安223300）（3.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所天然產(chǎn)物研究中心，四川成都 610041）（4.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223300)

帕金森?。≒arkinsons Disease，PD）是一種常見于老年人的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征是中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能（Dopaminergic，DA）神經(jīng)元的退化及病變性死亡[1,2]。迄今為止，帕金森病仍然是世界上第二大的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率在60 歲以上的人群中呈上升趨勢(shì)，隨著世界人口老齡化狀況日趨嚴(yán)重，PD 發(fā)病率的增加，已嚴(yán)重威脅人類健康與生活質(zhì)量[3]。目前對(duì)于PD 的治療多集中于藥物治療上，如：左旋多巴、多巴胺受體激動(dòng)劑和單胺氧化酶B（MAO-B）抑制劑等，但這類藥物的毒副作用尚未得到解決[4]。天然植物有效成分具有結(jié)構(gòu)和生物活性多樣性等優(yōu)點(diǎn)，為設(shè)計(jì)理想的新藥或功能因子提供了獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性。

積雪草（Centella asiatica(L.) Urban）為傘形科（Apiaceae）多年生匍匐植物，廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶的沼澤地區(qū)，在我國(guó)則主要分布于華東、華南、中南及西南等地[5]。積雪草具有清熱利濕、解毒消腫的功效，臨床上多用于治療跌打損傷、皮膚病等[6]。這種藥用植物的制劑傳統(tǒng)上用于治療各種皮膚疾病或加速皮膚傷口愈合。因其安全性和有效性，積雪草被廣泛用于制作蔬菜沙拉、香料和飲料[7]。在一些國(guó)家，積雪草經(jīng)常被用作一種商業(yè)膳食補(bǔ)充劑[8]。除了其傳統(tǒng)作用之外，近些年的研究發(fā)現(xiàn)積雪草具有抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、抗腫瘤、抗菌、抗炎等多種作用。研究表明積雪草的主要活性成分為三萜皂苷類，目前在積雪草的眾多藥理活性中，其神經(jīng)保護(hù)作用頗為引人注目[9]。如：Xu[10]發(fā)現(xiàn)積雪草苷可以維持多巴胺代謝平衡、提高Bcl-2/Bax 比值起到神經(jīng)保護(hù)作用，可有效逆轉(zhuǎn)MPTP 誘導(dǎo)小鼠的帕金森病；羥基積雪草苷對(duì)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和炎癥因子的生成具有抑制作用，其作用機(jī)制與抑制TLR-4 和NF-κB 表達(dá)、改變細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[11]；并有學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)了積雪草苷的高跨血腦屏障能力[12]，揭示了積雪草有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。但大多研究局限于積雪草苷、羥基積雪草苷、積雪草酸、羥基積雪草酸和積雪草提取物等，積雪草中其它微量成分的神經(jīng)保護(hù)作用鮮見報(bào)道[13]。本研究從積雪草中發(fā)現(xiàn)一種含量很低的積雪草三萜皂苷（CA-1），并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了初步研究，豐富了積雪草的活性化合物資源庫(kù)，可為全面理解積雪草生物活性和相關(guān)藥物的開發(fā)提供有效的理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CA-1 為本課題組從積雪草中分離獲得，積雪草苷和羥基積雪草苷為成都至純本草生物科技有限公司提供；神經(jīng)元分化型大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞PC12，美國(guó)菌種保藏中心ATCC；DMEM 培養(yǎng)基、青-鏈霉素，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；0.25%胰酶-EDTA、二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），美國(guó)Gibco 公司；p-Akt、Akt、PDK1、p-PDK1、GSK-3β、p-GSK-3β等相關(guān)蛋白抗體，美國(guó)Cell Slignaling Technolog 公司；脫脂奶粉，美國(guó)BD 公司；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒、微量蛋白BCA 定量試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR Green（ROX），瑞士Roche 公司；6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine Hydrobromide，6-OHDA）、臺(tái)盼藍(lán)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、甲氮甲唑藍(lán)（3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-diphenyl Tetrazolium Bromide，MTT）、Trizol Reagent，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙醇、甲醛、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉、三氯甲烷、異丙醇等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HERACELL I50i CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher公司；M200 Pro 酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；IX71 倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；T100 Thermal Cycle PCR 儀、CPX connect 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、PowerPacTMHC 電泳槽，美國(guó)Bio-Rad 公司；5200multi化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技公司；5414R低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；Vion IMS Qtof高分辨質(zhì)譜儀，英國(guó)Waters 公司；LC6000N 型制備液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 積雪草次生代謝產(chǎn)物CA-1 的分離

干燥的積雪草（5.0 kg）粉碎后置于50 L 圓底燒瓶中，加入20 Lφ=80%乙醇水溶液（m/V，1:4）在60 ℃水浴鍋中提取3 次，每次提取24 h，合并提取液，在60 ℃下減壓濃縮至濃縮液無(wú)醇味，濃縮液中添加 5 L純水，充分混合攪拌得懸浮液。該懸浮液以二氯甲烷萃取3 次，每次5 L，除去脂溶性成分；再以正丁醇萃取3 次，每次5 L，合并正丁醇萃取液，在60 ℃下減壓濃縮至干得正丁醇萃取物（172.6 g）。將正丁醇萃取物進(jìn)行硅膠柱層析，以甲醇-二氯甲烷（1:8→1:3，V/V）的水飽和溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過薄層色譜合并得8 個(gè)組分。組分7 先以φ=55%甲醇水溶液反相制備得組分7-1，7-2 和7-3，其中組分7-2 繼續(xù)以φ=25%乙腈水溶液制備得CA-1（2.3 mg）[14]。

1.3.2 CA-1 的高分辨質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI），四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（Qtof），毛細(xì)管電壓3 000 V（正、負(fù)離子模式），錐孔電壓80 V，脫溶劑氣體溫度500 ℃，脫溶劑氣體流速800 L/h，數(shù)據(jù)采集范圍m/z200～2 000。

1.3.3 分化型PC12 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞存活率測(cè)定

分化型PC12 細(xì)胞[15]用高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素），無(wú)菌條件下，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，以每孔3×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)16～24 h，約貼壁80%時(shí)，不同樣品以不同濃度預(yù)處理細(xì)胞30 min，然后暴露于250 μmol/L 6-OHDA中24 h后用傳統(tǒng)MTT法[16]測(cè)定細(xì)胞存活率：吸走細(xì)胞培養(yǎng)基后，加入終濃度為0.5 mg/mL 的MTT工作液100 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，加入等體積的MTT 終止液過夜后在550 nm 處測(cè)定吸光值，按下式計(jì)算。

式中：

C——細(xì)胞存活率，%；

A實(shí)驗(yàn)組——實(shí)驗(yàn)組吸光值；

A空白組——空白組吸光值；

A對(duì)照組——對(duì)照組吸光值。

1.3.4 CA-1、積雪草苷和羥基積雪草苷對(duì)6-OHDA 損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用

細(xì)胞以每孔3×104個(gè)接種于96 孔板，培養(yǎng)16～24 h，分別用終濃度為6.25、12.5、25、50、100 μmol/L 的CA-1 和100 μmol/L 積雪草苷、羥基積雪草苷先預(yù)處理30 min后加入250 μmol/L的6-OHDA共同處理 24 h，MTT 法測(cè)定其細(xì)胞存活率[17]。

1.3.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞以每孔6×105個(gè)接種于6 孔板，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h 后加入終濃度50、100 μmol/L 的CA-1預(yù)處理30 min 后，加入250 μmol/L 的6-OHDA 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS 漂洗后加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，IX71 倒置顯微鏡[18]觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）檢測(cè)

采用DCFH-DA 熒光染色法[19]檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧。經(jīng)不同藥物處理和4%多聚甲醛的細(xì)胞用PBS 洗兩遍后，加入最終濃度為10 μmol/L 的DCFH 的染料避光染色20 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3 次后在熒光顯微鏡下觀察分析。

1.3.7 半定量PCR 和RT-qPCR

細(xì)胞以每孔6×105個(gè)接種于6 孔板，培養(yǎng)16～24 h后，用終濃度為50、100 μmol/L的CA-1預(yù)處理30 min，然后加入250 μmol/L 的6-OHDA，6 h 后，加入PBS清洗，然后加入1 mL Trizol 試劑將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中吹下，移入離心管中進(jìn)行總RNA 的提取[20]。反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA，以GAPDH 內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各個(gè)目的基因的mRNA 表達(dá)量。半定量PCR 使用2×Taq Master Mix 通過PCR 擴(kuò)增后在2%的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)基因表達(dá)水平。本文所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，相關(guān)序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.8 細(xì)胞全蛋白提取與蛋白印跡

按上述方法[20]處理細(xì)胞，經(jīng)PBS 清洗后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞全蛋白提取試劑盒說明書，提取PC12 細(xì)胞全蛋白，用于蛋白印跡分析。采用BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，取蛋白樣品30 μg，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，隨后轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，加w=5%的BSA 室溫封閉2 h，清洗三遍后加入1:1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，清洗三遍，加入1:2 000稀釋的二抗孵育后通過Tannon 5200 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光和拍照分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用至少3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析，p＜0.05 表示存在顯著性差異。其中#表示模型組與對(duì)照組存在顯著性差異，*表示模型組與藥物處理組存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 CA-1 的結(jié)構(gòu)鑒定

采用高分辨質(zhì)譜對(duì)CA-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析鑒定。CA-1 的高分辨質(zhì)譜圖如圖1 所示，其中圖1a 和圖1b分別為CA-1 在負(fù)離子和正離子模式下的高分辨質(zhì)譜圖，綜合分析可知該化合物在負(fù)離子模式下顯示了[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰m/z=1 119.556 0，在正離子模式下顯示了[M+Na]+準(zhǔn)分子離子峰m/z=1 143.555 8，推測(cè)其分子式為C54H88O24。CA-1 的分子量比積雪草中2 個(gè)主要成分積雪草苷和羥基積雪草苷的分子量分別大162 和146，提示CA-1 的結(jié)構(gòu)可能是在積雪草苷結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上多了一個(gè)葡萄糖殘基，或是在羥基積雪草苷結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上多了一個(gè)鼠李糖殘基。積雪草中皂苷的一個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是苷元的28 位碳原子普遍通過酯苷鍵連接一個(gè)“葡萄糖-葡糖糖-鼠李糖”結(jié)構(gòu)單元，而以前的研究發(fā)現(xiàn)該類皂苷在二級(jí)質(zhì)譜中極易發(fā)生特征性的酯苷鍵裂解，生成一對(duì)互補(bǔ)離子，有助于通過多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)解析其化學(xué)結(jié)構(gòu)[14]。圖1c 為CA-1 在負(fù)離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜圖，其中碎片離子峰m/z=649.394 9和碎片離子峰m/z=469.155 9 為互補(bǔ)離子。碎片離子峰m/z=469.155 9的出現(xiàn)說明CA-1的28位也是通過酯苷鍵鏈接了一個(gè)“葡萄糖-葡糖糖-鼠李糖”結(jié)構(gòu)單元；碎片離子峰m/z=487.341 8 對(duì)應(yīng)皂苷元碎片離子，其與碎片離子峰m/z=649.394 9 數(shù)值相差162，提示皂苷元的某個(gè)羥基可能連接了一個(gè)葡萄糖分子。積雪草中皂苷的另一個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是2、3 和23 位碳原子分別連接羥基，區(qū)別在于6 位碳原子是否連接羥基，考慮CA-1苷元的分子量為488，提示其6 位碳原子未連接羥基。到目前為止，僅報(bào)道了 2 個(gè)積雪草皂苷（Centellasaponin G 和Centellasaponin H）含有4 個(gè)糖基，均有一個(gè)葡萄糖殘基連接于苷元的23 位碳原子[21]。因此，推測(cè)CA-1 中一個(gè)葡萄糖殘基可能也是連接于苷元的23 位碳原子?？紤]到積雪草中普遍存在烏蘇烷型和齊墩果烷型皂苷同分異構(gòu)體，而電噴霧質(zhì)譜暫時(shí)不能有效地區(qū)分這2 種異構(gòu)體，CA-1 的結(jié)構(gòu)就存在2 種可能性。CA-1 的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解途徑如圖2所示。

圖1 CA-1 的一級(jí)和二級(jí)高分辨質(zhì)譜圖Fig.1 The HR-ESI-MS and MS/MS spectra of CA-1

圖2 CA-1 的結(jié)構(gòu)及其質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 The chemical structure of CA-1 and its proposed fragmentation pathway

2.2 CA-1 對(duì)PC12 細(xì)胞活力的影響和神經(jīng)保護(hù)作用

積雪草苷和羥基積雪草苷是積雪草中有神經(jīng)保護(hù)作用的皂苷，也是積雪草中大多數(shù)學(xué)者研究的主要化合物。已有明確證據(jù)表明積雪草中三萜皂苷類化合物可用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前研究最多的是改善阿爾茲海默癥[22]（AD）和帕金森病[23]（PD）。為研究CA-1 的神經(jīng)保護(hù)作用，本文首先評(píng)價(jià)了CA-1 對(duì)PC12細(xì)胞的毒性，結(jié)果如圖3 所示，濃度在6.25 μmol/L～100 μmol/L 之間時(shí)，CA-1 對(duì)PC12 細(xì)胞沒有毒性，也沒有明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。本文對(duì)比了AS、MS 和CA-1 抵御6-OHDA 損傷，保護(hù)PC12 細(xì)胞的作用，結(jié)果如圖4 所示，250 μmol/L 6-OHDA 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的存活率為56.83%，加入AS、MS 和CA-1 處理后存活率顯著提升（p＜0.05），分別為74.37%、73.52%和85.46%，且CA-1 組存活率與AS、MS 也有顯著性差異（p＜0.05）。表明在此模型中CA-1 的神經(jīng)保護(hù)作用強(qiáng)于AS、MS。為進(jìn)一步研究CA-1 神經(jīng)保護(hù)作用的劑量效應(yīng)，本文也考察了一系列濃度CA-1 預(yù)處理對(duì)PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用，如圖4 所示，隨著濃度的提高，CA-1 的神經(jīng)保護(hù)作用呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)，表明CA-1 的神經(jīng)保護(hù)作用具有劑量依賴性，在預(yù)處理濃度超過25 μmol/L 時(shí)，CA-1 即具有顯著的神經(jīng)保護(hù)效果（p＜0.05）。

圖3 CA-1 的對(duì)PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of CA-1 on cell viability PC12

圖4 CA-1、AS、MS 對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effect of CA-1 on 6-OHDA-induced PC12 cell viablilty

2.3 CA-1 對(duì)6-OHDA 損傷PC12 細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)作用

為從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上研究CA-1 對(duì)6-OHDA 損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用，本文在顯微鏡下觀察分析經(jīng)不同濃度CA-1 預(yù)處理的6-OHDA 損傷PC12 細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示對(duì)照組可以明顯看到細(xì)胞數(shù)量多，分化型PC12 細(xì)胞突觸相互交集，連接緊密（圖5a）；模型組細(xì)胞數(shù)目少，細(xì)胞突觸并無(wú)交集，不連接（圖5b）；使用50 μmol/L 的CA-1 預(yù)處理30 min 后細(xì)胞數(shù)目明顯變多，細(xì)胞突觸之間有一定交集（圖5c）；使用100 μmol/L 的CA-1 預(yù)處理30 min 后恢復(fù)效果明顯，細(xì)胞形態(tài)幾乎接近于正常細(xì)胞（圖5d）。該細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明CA-1 處理對(duì)6-OHDA 損傷PC12 細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，能保護(hù)細(xì)胞維持正常形態(tài)和突觸交聯(lián)。印度學(xué)者M(jìn)argabandhu 等[24]報(bào)道10 μmol/L AS 能夠顯著抵御魚藤酮誘導(dǎo)的經(jīng)過藥物分化的PC12細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞存活率和改善細(xì)胞形態(tài)，其結(jié)果與本研究不謀而合。更加充分的說明了積雪草的藥用價(jià)值，揭示了積雪草皂苷對(duì)不同藥物損傷細(xì)胞都有一定保護(hù)作用。

圖5 CA-1 對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）Fig.5 Effects of CA-1 on the morphology of 6-OHDA-induced PC12 cells (×200)

2.4 CA-1 緩解ROS 的產(chǎn)生

6-OHDA 能夠引起PC12 細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS即氧化應(yīng)激使細(xì)胞損傷甚至凋亡[14]，在CA-1 沒有細(xì)胞增殖的作用情況下，CA-1 可能通過減輕細(xì)胞體內(nèi)的ROS，從而減輕6-OHDA 對(duì)PC12 細(xì)胞的損傷和凋亡。DCFH-DA 探針能被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解為DCFH，而沒有熒光的DCFH 能被活性氧氧化成含有與FITC 類似熒光的DCF，因而能通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量。為驗(yàn)證上述猜測(cè)，本文使用該熒光探針進(jìn)行了活性氧檢測(cè)。如圖6 所示，在模型組（圖6b）中檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，說明細(xì)胞內(nèi)有大量的活性氧產(chǎn)生；在CA-1 終濃度為50 μmol/L（圖6c）和100 μmol/L（圖6d）的預(yù)處理中，熒光信號(hào)明顯減少，表明細(xì)胞內(nèi)活性氧減少，Image J 分析相對(duì)熒光強(qiáng)度可知，根據(jù)對(duì)照組歸一后，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著增加至對(duì)照組的12.4 倍，50 μmol/L 處理后降低至4.5 倍，100 μmol/L 處理后接近對(duì)照組。揭示了CA-1 能夠顯著減少受損細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。一定程度上說明CA-1 通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS 表達(dá)水平，起到抑制6-OHDA 損傷的作用。

圖6 DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平（×200）Fig.6 ROS levels in PC12 cells were detected by DCFH-DA fluorescent probe (×200)

2.5 CA-1 對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)基因及凋亡因子表達(dá)水平的影響

本文分別采用半定量PCR（圖7）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（圖8）法檢測(cè)了PC12 細(xì)胞中Cat、Sod1和Bcl2的mRNA 表達(dá)水平。6-OHDA 使細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，致使細(xì)胞損傷甚至死亡。使得轉(zhuǎn)錄水平中抗氧化相關(guān)酶系和凋亡相關(guān)酶系異常表達(dá)[25]。在用CA-1處理后顯著提高了受損PC12 細(xì)胞抗氧化酶及抗凋亡相關(guān)因子的相對(duì)表達(dá)水平，在CA-1 濃度為100 μmol/L時(shí)Sod1、Cat、Bcl2均提高到與正常組一致。Cat和Sod1的上調(diào)說明了PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的減少是通過抗氧化酶的表達(dá)增多從而減少氧化應(yīng)激來(lái)實(shí)現(xiàn)的，Bcl2上調(diào)說明可能通過促進(jìn)抗凋亡因子的表達(dá)使得細(xì)胞凋亡減少。結(jié)果與其它有抗PD 活性的天然化合物類似，如黃芩素、莨菪堿、人參皂苷Rg1、姜黃素等[1,26,27]。

圖7 半定量PCR 測(cè)定CA-1 對(duì)Sod1、Sod2、Cat、Bcl2 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of CA-1 on the relative expression levels of Sod1,Sod2, Cat, Bcl2 genes by Semi-Quantitative RT-PCR

圖8 QPCR 測(cè)定CA-1 對(duì)Sod1、Cat、Bcl2 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of CA-1 on the relative expression levels of Sod1,Cat and Bcl2 genes were determined by qPCR

2.6 CA-1 的對(duì)PI3K、PDK1、Akt 和GSK3-β等蛋白表達(dá)及活化的影響

既往研究表明細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、凋亡與PI3K/Akt 通路相關(guān)[28]。PI3K/Akt 通路能夠調(diào)控凋亡基因Bax、NF-κB 等下游基因，調(diào)控細(xì)胞凋亡從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用[29]。PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶能夠催化脂質(zhì)第二信使的生成[30]。磷脂酰肌醇二磷酸（Phospyl-diphosphate Inositol，PIP2）是一種多肽激素和膜受體的第二信使，活化后可磷酸化為肌醇三磷酸（Inositol Triphosphate，PIP3），PIP3 與細(xì)胞內(nèi)含有PH 結(jié)構(gòu)域（Pleckstrin Homolgy Domain）的信號(hào)蛋白Akt 和PDK1 結(jié)合[31]。一旦Akt473 磷酸化位點(diǎn)被激活，會(huì)將下游基因環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response Element Binding Protein，CREB）轉(zhuǎn)換為磷酸化的CREB，而磷酸化的CREB 參與細(xì)胞分化、增殖、存活和凋亡[32]。越來(lái)越多的證據(jù)表明PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞變性的預(yù)防和治療的主導(dǎo)作用[33,34]。

使用Image J 分析了蛋白印跡調(diào)條帶磷酸化/非零酸化比值結(jié)果顯示6-OHDA處理12 h后模型組相比于對(duì)照組P85、Akt 表達(dá)明顯減少、PDK1 表達(dá)增多，CA-1預(yù)處理30 min 后增加了磷酸化的P85 和磷酸化的Akt的表達(dá)，磷酸化的PDK1 略有增加但PDK1 表達(dá)減少。表明CA-1 的神經(jīng)保護(hù)作用可能是基于PI3K/Akt 通路。PI3K/PDK1/Akt 通路可以調(diào)控下游Bcl-2 的表達(dá)，因此Bcl-2 在轉(zhuǎn)錄水平的變化可能是由該通路引起。

綜上所述，CA-1 相比其他積雪草皂苷具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用，在功能性食品或藥品開發(fā)中有重要潛力。然而，CA-1 在川產(chǎn)積雪草中含量太低，限制了對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)利用?？梢酝ㄟ^以下兩種途徑解決CA-1的來(lái)源問題：1）以CA-1 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)全國(guó)不同產(chǎn)地的積雪草進(jìn)行皂苷含量分析，篩選CA-1 含量較高的積雪草資源；2）采用生物合成的方法選擇性對(duì)積雪草中主要成分積雪草苷的23 位羥基葡萄糖基化，實(shí)現(xiàn)CA-1 的量產(chǎn)。

圖9 CA-1 對(duì)6-OHDA 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞PI3K/PDK1/Akt/GSK-3β通路的影響Fig.9 Effects of CA-1 on PI3K/PDK1/Akt/GSK-3β pathway in 6-OHDA-induced PC12 cells

3 結(jié)論

本文的研究對(duì)四川產(chǎn)積雪草的總皂苷進(jìn)行了硅膠柱層析分離和反相制備色譜分離，并采用高分辨質(zhì)譜鑒定出了一個(gè)微量稀有皂苷 C A-1（收率為0.001 15‰）。25 μmol/L 的CA-1 能對(duì)細(xì)胞起到顯著性的保護(hù)作用。相對(duì)于同濃度的積雪草苷和羥基積雪草苷，CA-1 對(duì)6-OHDA 損傷的分化型PC12 細(xì)胞有更強(qiáng)的保護(hù)作用，100 μmol/L 時(shí)CA-1 能提高28.63%的細(xì)胞存活率，而積雪草苷和羥基積雪草苷分別只能提高16.69%、17.54%。100 μmol/L 的CA-1 預(yù)處理后細(xì)胞ROS 水平能恢復(fù)到與對(duì)照組相同并且Sod1、Cat、Bcl2基因的表達(dá)也能恢復(fù)到正常組水平，50 μmol/L 的CA-1 預(yù)處理后，仍能夠有效改善6-OHDA 對(duì)細(xì)胞的損傷。CA-1 的神經(jīng)保護(hù)作用可能是基于PI3K/Akt 通路。未來(lái)將進(jìn)一步驗(yàn)證一系列凋亡有關(guān)蛋白的表達(dá)如Caspase 家族等；還將進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞核內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白如NRF2/OH-1 和p65 的表達(dá)以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。