張姣姣，吐克孜·吾守爾，黃偉偉，李艷紅

（新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室，新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調(diào)控實驗室，新疆師范大學生命科學學院，新疆烏魯木齊 830054）

目前我國的超重率和肥胖率均呈不斷上升趨勢，已成為對我國國民健康影響最大的多因素疾病之一[1]。這正是由于機體肥胖導致機體全身慢性炎癥、脂肪因子失調(diào)、糖脂毒性增加、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及氧化應激增加等原因?qū)е碌?，其中這種影響在肝臟表現(xiàn)尤為明顯，這些因素之間的相互作用導致脂質(zhì)代謝的改變和肝細胞中脂質(zhì)的過度積累，且隨著時間的推移并不會明顯消退，致使疾病復雜化[2,3]。大量研究表明，多酚類化合物是自然產(chǎn)生的一類復雜的生物活性分子，具有較強的抗炎活性和抗氧化能力，能有效預防和改善高糖高脂飲食誘導的肝臟炎癥和氧化應激[4-7]。多酚是植物中廣泛存在的一類次生代謝產(chǎn)物，包括黃酮類、酚酸類、花色苷類等。不同種類植物中多酚的組成和含量不同，同種植物不同基因型多酚的組成和含量也不同，這決定了不同植物來源的多酚的功能可能不同。

櫻桃李（Prunus cerasiferaEhr.）為薔薇科李屬，在我國主要分布于新疆伊犁霍城縣，果實主要有紫紅、黃色、紫黑色，果實營養(yǎng)成分豐富[8,9]，每到采摘季節(jié)，當?shù)厣贁?shù)民族居民大量采集食用[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，櫻桃李果汁對高脂膳食誘導肥胖小鼠具有預防作用[11]。櫻桃李果實中多酚含量為多少？是否對肥胖小鼠具有一定的影響？目前尚不清楚。本研究以前期醇提法獲得紫果櫻桃李多酚提取物為材料，在測定提取物總多酚及總多酚中黃酮、黃烷醇、酚酸含量基礎(chǔ)上，體外分別采用DPPH、ABTS、氧自由基吸收能力法（FRAP）測定總多酚提取物的抗氧化能力；體內(nèi)以肥胖小鼠為模型，測定提取物對肝臟甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影響及對炎癥相關(guān)因子表達的影響，確定櫻桃李多酚提取物對肝臟保護作用，為櫻桃李果實及其多酚的開發(fā)利用提供一定的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸、咖啡酸標準品，北京索萊寶科技有限公司；福林-酚試劑，美國Sigma 公司；DPPH，合肥博美生物科技有限責任公司；蘆丁標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；兒茶酸標準品、DMACA，上海源葉生物公司；FRAP、ABTS、甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；無水乙醇、甲醇、甲酸、鹽酸，國產(chǎn)分析純；Trizol、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒，天根生化科技北京有限公司。

櫻桃李紫果購自新疆伊犁霍城縣大西溝。果實多酚提取物由本實驗室采用醇（甲醇:水:甲酸=90:9:1）提取，AB-8 大孔樹脂60%乙醇洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，冷凍干燥獲得。

1.2 動物性小鼠

60 只5～6 周齡C57BL/6 雄性小鼠，購自南京君科生物公司，動物合格證號：SCXK（蘇）2016-0010。

1.3 櫻桃李多酚提取物中多酚含量及體外抗氧化活性的測定

1.3.1 總多酚含量的測定

參照文獻方法[12]，分別以沒食子酸為標準品，760 nm 測定吸光度值，得到濃度與吸光度的標準曲線。根據(jù)標準曲線算出相應的含量。

1.3.2 總多酚中成分總黃酮、總酚酸、總黃烷醇含量的測定

參照文獻方法[13-16]，分別以蘆丁、咖啡酸、兒茶素為標準品，410、768、640 nm 測定吸光度值，得到濃度與吸光度的標準曲線。根據(jù)標準曲線算出相應的含量。

1.3.3 DPPH 清除率測定

將1.0 mL 不同濃度（0.24、0.48、0.72、0.96、1.20 mg/mL）的樣品溶液加入3.0 mL DPPH 溶液中，室溫避光30 min，空白對照加1.0 mL 無水乙醇，測定517 nm 處的吸光度值，根據(jù)公式（1）計算DPPH 自由基清除率[17]。

式中：

F——DPPH 自由基清除率，%；

Ao——水+DPPH 樣品的吸光值；

As——待測提取物溶液+DPPH 樣品的吸光值；

Ac——待測提取物溶液+乙醇樣品的吸光值。

1.3.4 FRAP 測定

按照FRAP 試劑盒說明書操作方法，測定多酚提取物抗氧化活性。以FeSO4為標準品，制作標準曲線，回歸方程為：

總抗氧化能力用FeSO4標準溶液的濃度表示（單位mmol/mL）。

1.3.5 ABTS 測定

按照ABTS 試劑盒說明書操作方法，測定多酚提取物抗氧化活性。以Trolox 為標準品，制作標準曲線，回歸方程為：

總抗氧化能力用Trolox 相比的倍數(shù)表示（單位mmoL/mL Trolox）。

1.4 櫻桃李多酚對小鼠肝臟保護作用

1.4.1 肥胖小鼠模型的建立及實驗分組與給藥

60 只5～6 周齡C57BL/6 雄性小鼠，適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為2 組，一組15 只（空白對照組）喂養(yǎng)常規(guī)普通飼料，另一組52 只（高脂對照組）改為喂養(yǎng)高脂飼料，建立高脂飲食肥胖小鼠模型。8 周后，肥胖度≥20%確定建模成功。實驗分為5 組：空白對照組（NC）、高脂對照組（HFD）、多酚低劑量組（HFD+L，500 mg/kg）、多酚高劑量組（HFD+H，200 mg/kg）、奧利司他組（HFD+O，15.6 mg/kg）。每組8 只。采用灌胃方式給藥，每天1 次，實驗進行8 周。

1.4.2 小鼠肝臟指數(shù)計算

最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h，頸椎脫臼處死，取肝臟稱其質(zhì)量，根據(jù)公式（2）計算肝臟指數(shù)后，置于-80 ℃冰箱凍存。

式中：

Z——肝臟指數(shù)，%；

m——小鼠處死前質(zhì)量，g；

m1——肝臟質(zhì)量，g。

1.4.3 小鼠肝臟TG、T-CHO 濃度測定

將小鼠肝臟樣品放無水乙醇中進行冷凍研磨，然后按照南京建成試劑盒說明書操作檢測肝臟TG、T-CHO 濃度。

1.4.4 小鼠肝臟SOD 活性和MDA 濃度測定

將小鼠肝樣品放在生理鹽水中進行冷凍研磨，然后按照南京建成試劑盒說明書操作檢測肝臟MDA 濃度和SOD 活性。

1.4.5 熒光定量PCR 檢測小鼠肝臟炎癥相關(guān)基因的表達

用Trizol 法提取肝臟總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物,引物序列見表1。采用實時熒光定量PCR 法以β-actin 為內(nèi)參基因，檢測小鼠肝臟組織炎癥因子相關(guān)基因IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達水平?；蛳鄬Ρ磉_量計算采用2-△△Ct法。

表1 檢測基因引物Table 1 Sequence of primers used in quantitative real-time PCR

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 進行分析，用（x±s）表示。組間比較采用ANVOVA 分析，兩組對比采用獨立樣本t檢驗。采用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 櫻桃李提取物中多酚含量及體外抗氧化活性的測定

測定櫻桃李多酚提取物中總多酚含量為439.17 mg/g，提取率為68.54%，總多酚成分中黃酮類含量為186.37 mg/g，酚酸類含量為168.27 mg/g，黃烷醇含量為68.86 mg/g（表2）。說明，櫻桃李醇提物中總多酚含量豐富，櫻桃李多酚中黃酮類含量最高。

表2 櫻桃李提取物中總多酚、總黃酮、總酚酸、總黃烷醇含量Table 2 The content of total polyphenols,total flavonoids,total phenolic acids and total flavanols in Prunus cerasifera extract

采用DPPH 法、FRAP 法、ABTS 法，測定多酚提取物體外抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DPPH 自由基清除率最高可達97.42%（圖1），F(xiàn)RAP 法、ABTS 法測得抗氧化活性分別為4.36 mmol/mL、0.48 mmol/mL Trolox（表3）。說明，櫻桃李多酚提取物體外具有較強的抗氧化活性。

圖1 不同濃度提取物的DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of extracts with different concentrations

表3 櫻桃李多酚體外抗氧化活性測定結(jié)果Table 3 In vitro antioxidant activity test results of Prunus cerasifera polyphenols

沈靜等[18]測定了4 種不同品種櫻桃李果肉中總黃酮的含量和抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃色品種中黃酮的含量最高達到2.97 mg/g，栽培品種的DPPH 自由基清除率達到95.43%。劉曉等[19]發(fā)現(xiàn)不同顏色的果皮多酚含量也存在明顯的差異，紫黑色果皮多酚含量和抗氧化能力遠高于其他顏色果皮，達到128.17 mg/g 和1 495.79 μmol Vc/g。Gunduz 等[20]發(fā)現(xiàn)土耳其的18 個不同品種、顏色野生櫻桃李果實多酚含量存在顯著性差異，總多酚最高達到583.1 mg GAE/kg Fw。與已有的研究結(jié)果比較，本研究用醇提取，60%乙醇洗脫獲得提取物中多酚含量較高，且具有較強的抗氧化能力。

2.2 多酚提取物對肥胖小鼠肝臟指數(shù)的影響

小鼠解剖后，稱重，計算肝臟指數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，HFD 組小鼠肝臟臟指數(shù)顯著增加了1.01%（p＜0.05），出現(xiàn)了肝臟腫大現(xiàn)象。與HFD組小鼠相比，櫻桃李不同劑量干預后，小鼠肝臟指數(shù)顯著降低了1.11%、1.21%、0.97%（圖2）。說明櫻桃李多酚能夠保護高脂引起的小鼠肝臟腫大。這主要是櫻桃李多酚可以促進糖脂代謝，抑制脂肪在肝臟累積，進而有效抑制脂肪肝的形成。因此，櫻桃李多酚對防止肝臟脂肪累積和脂肪肝的發(fā)生具有重要意義。

圖2 櫻桃李多酚對小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig.2 Effect of Prunus cerasifera fruit on liver index in mice

2.3 多酚提取物對肥胖小鼠肝臟中TG、T-CHO 濃度的影響

檢測肝臟中TG、T-CHO 濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD組小鼠肝臟中TG 濃度為1.08 mmoL/L 分別顯著高于NC 組0.61 mmoL/L、HFD+L 組0.91 mmoL/L、HFD+H組0.74 mmoL/L、HFD+O 組0.62 mmoL/L。HFD 組小鼠肝臟T-CHO 濃度為2.83 mmoL/L 分別高于NC 組0.67 mmoL/L、HFD+L 組1.17 mmoL/L、HFD+H 組0.99 mmoL/L、HFD+O 組0.90 mmoL/L。與HFD 組相比，多酚低、高劑量組均能顯著降低高脂膳食小鼠肝臟TG、T-CHO 含量（p＜0.05）（圖3、圖4）。結(jié)果表明，櫻桃李多酚可減少肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，防止肝臟功能異常。

圖3 櫻桃李多酚對小鼠肝臟TG 濃度的影響Fig.3 Effect of Prunus cerasifera fruit on TG concentration in liver of mice

圖4 櫻桃李多酚對小鼠肝臟T-CHO 濃度的影響Fig.4 Effect of Prunus cerasifera fruit on T-CHO concentration in liver of mice

2.4 多酚提取物對肥胖小鼠肝臟中SOD 活性和MDA 濃度的影響

檢測肝臟中SOD 活性和MDA 濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD 組小鼠肝臟SOD 活性為10.90 U/mL 分別顯著低于NC 組12.47 U/mL、HFD+L 組12.16 U/mL、HFD+H組12.342 U/mL、HFD+O 組13.11 U/mL，與HFD 組相比，多酚低、高劑量組均能顯著增強高脂膳食小鼠肝臟SOD 活性（p＜0.05）（圖5）。HFD 組小鼠肝臟MDA 濃度為7.79 nmol/mL 分別高于NC 組3.78 nmol/mL、HFD+L 組5.85 nmol/mL、HFD+H 組4.48 nmol/mL、HFD+O 組3.98 nmol/mL。與HFD 組相比，多酚低、高劑量組均能顯著降低高脂膳食小鼠肝臟MDA 濃度（p＜0.05）（圖6）。表明，櫻桃李多酚可通過提高小鼠肝臟SOD 活力和降低小鼠肝臟MDA 濃度提高肝臟的抗氧化能力，進而對肥胖小鼠肝臟起到一定的保護作用。

圖5 櫻桃李多酚對小鼠肝臟中SOD 活性的影響Fig.5 Effect of Prunus cerasifera on the SOD activity in the liver of mice

圖6 櫻桃李多酚對小鼠肝臟中MDA 濃度的影響Fig.6 Effect of Prunus cerasifera on the MDA concentration in the liver of mice

SOD 在維持機體的氧化-抗氧化平衡中起重要的作用，提高體內(nèi)SOD 活性，有助于提高抗氧化能力[21]。MDA 作為脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生的有害物質(zhì)之一，會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，降低酶活性，減少其含量可以有效保證組織功能正常[22]。研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚可以提高肝臟的抗氧化活性。李峰等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與胰島素抵抗模型相比，滸苔多酚干預能提高SOD 活性達到25.04%，降低MDA 濃度達42.92%，滸苔多酚能提高肝臟抗氧化能力。郭苗等[24]發(fā)現(xiàn)，酒花多酚可以改變資質(zhì)過氧化酶的活性，與高血脂小鼠組相比，不同劑量的多酚干預均能顯著降低MDA 濃度，增加SOD 活力，提高肝臟的抗氧化活性。本研究對肥胖小鼠肝臟內(nèi)的MDA 濃度和SOD 活性進行測定，發(fā)現(xiàn)櫻桃李多酚提取物可以提高肝臟SOD 活性，降低MDA 濃度，說明櫻桃李多酚能夠提高肝臟抗氧化能力，對肝臟具有保護作用。

2.4 多酚提取物抑制小鼠炎癥相關(guān)基因的表達

熒光定量PCR 檢測肝臟炎癥相關(guān)因子IL-1β、TNF-α、IL-6 基因的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，櫻桃李多酚對小鼠肝組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的釋放有明顯的抑制作用。與NC 組相比，HFD 組小鼠炎癥因子的釋放明顯增多，IL-1β、TNF-α、IL-6 的基因表達量分別上升了1.0、2.61、3.11（p＜0.05），引起了小鼠的炎癥反應。經(jīng)過櫻桃李多酚低高劑量和奧利司他干預后，IL-1β基因的表達量相比于HFD 組分別下降了0.33、0.94、1.07（p＜0.05）（圖7），TNF-α基因的表達量相比于HFD 組分別下降了0.98、1.6、1.71（p＜0.05）（圖8），IL-6 基因的表達量相比于HFD組分別下降了1.47、2.72、3.09（p＜0.05）（圖9）。結(jié)果表明，櫻桃李多酚能夠通過下調(diào)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6 基因的表達，對肝臟起到一定保護作用。

圖7 櫻桃李多酚對小鼠肝臟炎癥因子IL-Iβ 表達的影響Fig.7 Effect of Prunus cerasifera on the expression of inflammatory factors IL-Iβ in the liver of mice

圖8 櫻桃李多酚對小鼠肝臟炎癥因子TNF-α 表達的影響Fig.8 Effect of Prunus cerasifera on the expression of inflammatory factors TNF-α in the liver of mice

圖9 櫻桃李多酚對小鼠肝臟炎癥因子IL-6 表達的影響Fig.9 Effect of Prunus cerasifera on the expression of inflammatory factors IL-6 in the liver of mice

肝臟損傷通常都伴隨著炎癥反應的發(fā)生。此時炎癥因子釋放量增多，與肝細胞膜表面的受體結(jié)合，就會引起肝臟細胞的凋亡或壞死，引起肝臟損傷。因此，控制炎癥因子的釋放可以減輕炎癥反應進而保護肝臟免受損傷。目前，很多研究證實植物多酚具有很好的抗炎及對肝臟保護作用[25,26]。韓笑[27]通過研究發(fā)現(xiàn)山楂果皮多酚可以有效改善脂質(zhì)異常小鼠體內(nèi)的炎癥反應，經(jīng)過果皮多酚干預后，與模型組相比，IL-6、TNF-α基因表達量下降了14.91%、18.06%，顯著抑制了炎癥因子的釋放。潘妍霓[28]發(fā)現(xiàn)，與急型肝損傷模型相比，大葉苦丁茶多酚能下調(diào)炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達，減輕四氯化碳導致的小鼠肝臟的損失。本實驗測定了促炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6 在肝臟中的表達量，發(fā)現(xiàn)櫻桃李多酚可有效降低肝臟促炎因子基因表達，表明櫻桃李多酚可以通過減輕肥胖小鼠肝臟中炎癥因子含量，有效保護肝臟功能。

3 結(jié)論

本研究對野生紫果櫻桃李中總多酚及其成分總黃酮、總酚酸、總黃烷醇含量測定，發(fā)現(xiàn)提取物中總多酚、總黃酮、總酚酸、總黃烷醇含量分別為439.17、186.37、168.27、68.86 mg/g。對多酚提取物體外抗氧化活性測定，發(fā)現(xiàn)多酚提取物體外對DPPH 自由基的清除率最高達到97.42%，F(xiàn)RAP 法、ABTS 法測的抗氧化能力分別為4.36、0.48 mmol/mL Trolox。結(jié)果表明，紫果櫻桃李提取物中總多酚含量高，其中總黃酮和總酚酸為提取總多酚中主要成分，提取物體外具有強的抗氧化能力。同時測定了櫻桃李多酚提取物體內(nèi)對肥胖小鼠肝臟相關(guān)指標的影響，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)可降低肥胖小鼠肝臟中TG、T-CHO、MDA 濃度，提高肥胖小鼠肝臟SOD 活性，降低炎癥相關(guān)因子表達，結(jié)果表明櫻桃李多酚提取物對肥胖小鼠肝臟具有一定的保護作用。櫻桃李多酚對肥胖小鼠具體的作用還有待于進一步深入研究。