文明明，畢潔，賀艷萍，戴煌，張威，舒在習(xí)，肖安紅

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

在現(xiàn)代食品工業(yè)中，糖被添加到各種食品中。添加糖指非自然存在于食物中的糖，即在食品生產(chǎn)和制備過(guò)程中添加的糖，包括原糖、白糖和紅糖、蜂蜜和糖漿[1]。食品中添加糖具有多種功能，如發(fā)酵、保鮮等作用，同時(shí)還可以滿足消費(fèi)者對(duì)甜味的偏好[2]。遺憾的是，糖的過(guò)多攝入是導(dǎo)致多種疾病的主要原因之一。高糖攝入對(duì)健康的影響一直是大眾關(guān)注的重點(diǎn)。過(guò)量攝入糖分可能導(dǎo)致能量攝入過(guò)高，從而增加肥胖、心血管疾病和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。此外，高糖飲食也可能影響發(fā)育、壽命和生育力，有文獻(xiàn)表明，高糖飲食損傷了機(jī)體的抗氧化能力，造成了氧化應(yīng)激異常[6]。而相關(guān)研究表明，活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）的產(chǎn)生與壽命和生育力呈負(fù)相關(guān)。Ku等[7]比較7種哺乳動(dòng)物的超氧化物和過(guò)氧化氫生成率，發(fā)現(xiàn)ROS 生成率與壽命之間存在反比關(guān)系。Gallo 等[8]研究?jī)煞N海洋無(wú)脊椎動(dòng)物和一種哺乳動(dòng)物的精子氧化狀態(tài)、線粒體功能和活力，結(jié)果表明在三個(gè)被檢測(cè)的物種中，精子活力與ROS 水平和過(guò)氧化脂（LPO）呈負(fù)相關(guān)，ROS 通過(guò)膜脂的氧化損傷導(dǎo)致精子活力下降。上述研究提示，高糖飲食對(duì)生物體的育性可能具有潛在的影響。因此，探究高糖飲食對(duì)生物體的育性具有一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也提供了一個(gè)新的視角來(lái)闡釋糖分?jǐn)z入過(guò)多的危害。

模式生物黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）具有如下優(yōu)勢(shì)：遺傳背景清晰、與人類70%的致病基因在進(jìn)化上高度保守、生存周期短、繁殖量大、飼養(yǎng)成本低等[9]。此外，果蠅精子發(fā)生包括精原細(xì)胞的有絲分裂和精母細(xì)胞的減數(shù)分裂等過(guò)程，這些過(guò)程與哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生過(guò)程十分相似[10]。因此，選用黑腹果蠅作為研究對(duì)象，來(lái)研究高糖飲食對(duì)后代育性的影響。

目前，研究者大多采用DAPI 染精核、透射電鏡超薄切片、免疫組化原位雜交和Western blot 分析等方法研究精子發(fā)生過(guò)程[11,12]。近年來(lái)，拉曼光譜分析由于能快速實(shí)現(xiàn)對(duì)成分和結(jié)構(gòu)的分析和定位、不受樣品水分的干擾、可以獲得骨架結(jié)構(gòu)方面的信息而日益受到重視。此外，拉曼分析具有無(wú)破壞性和無(wú)內(nèi)源性標(biāo)簽及外源性染色的優(yōu)勢(shì)[13]。生物組織中普遍存在C-H、C-N、C＝O、N-H 和O-H 等各種基團(tuán)，而拉曼光譜能檢測(cè)出樣品不同的化學(xué)鍵的分子振動(dòng)的信息[14]。因此，拉曼光譜在生物體系的研究中具有很大的優(yōu)勢(shì)。研究表明，采用共焦拉曼光譜研究鎘（Cd）暴露對(duì)小鼠腎臟影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有生物學(xué)結(jié)果都與拉曼光譜檢測(cè)一致[15]。然而，拉曼光譜在果蠅精子發(fā)生過(guò)程方面的應(yīng)用尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文研究了親代果蠅高糖飲食對(duì)后代雄性黑腹果蠅的壽命和育性的影響，通過(guò)給親代果蠅喂養(yǎng)高蔗糖培養(yǎng)基來(lái)構(gòu)建高糖果蠅模型，測(cè)定后代果蠅壽命和運(yùn)動(dòng)能力。重點(diǎn)研究了高糖飲食對(duì)后代雄蠅育性的影響，通過(guò)統(tǒng)計(jì)后代胚胎孵化率初探親代高糖飲食對(duì)后代雄蠅育性的影響效果，并借助DAPI 染精核和共焦拉曼光譜來(lái)探究其育性的影響機(jī)制。最后本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序嘗試從基因水平上探明親代果蠅高糖飲食后影響后代果蠅壽命和育性的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黑腹果蠅品系（W1118）由清華大學(xué)果蠅中心提供，并在本單位糧油儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)，培養(yǎng)于恒溫光照培養(yǎng)箱中，（25±1）℃、光照12 h：黑暗12 h，濕度70%的條件下。

玉米粉、紅糖、安琪酵母和0.9%生理鹽水來(lái)源于市售?？偟鞍祝═otal protein，TP）測(cè)定試劑盒（A045-2-2）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（A003-1-2）、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）測(cè)試盒（A001-1-2）和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）測(cè)定試劑盒（A007-1-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。蔗糖、丙酸（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）和冰醋酸（分析純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。PBS 緩沖液、4%多聚甲醛組織固定液、10 μg/mL DAPI 染色液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自Biosharp公司。Triton X-100 購(gòu)自源葉生物?？篃晒獯銣绶馄瑒┵?gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

SPL-450 生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；Kimble 749540-0000 微量電動(dòng)組織勻漿器，美國(guó)Kimble；SCILOGEX D3024R 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽洛捷克；Enspire 多功能酶標(biāo)儀，新加坡Perkin Elmer 公司。PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)和CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)伯樂(lè)（BIO-RAD）公司。LS-1200CP 超凈工作臺(tái)，深圳市藍(lán)思凈化科技有限公司；DMI 3000B 倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica 公司；inVia Qontor 共焦顯微拉曼光譜成像系統(tǒng)，雷尼紹（上海）貿(mào)易公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

普通培養(yǎng)基的配制[16]：30 g 玉米粉，30 g 紅糖，2 g 酵母，2 g 瓊脂，300 mL 的蒸餾水，加熱配制。冷卻后，加入2 mL 丙酸，以防止霉菌生長(zhǎng)。

高糖培養(yǎng)基的配制，蔗糖濃度參照張曉月[17]的實(shí)驗(yàn)方法：100 g 蔗糖，21 g 玉米粉，5 g 酵母，2 g 瓊脂，300 mL 蒸餾水，加熱攪拌均勻后煮沸三次。

胚胎收集盤的配制：首先稱取4.2 g 瓊脂，6.6 g蔗糖，溶于300 mL 蒸餾水中，劇烈攪拌，攪拌均勻后在微波爐中煮沸兩次，使瓊脂和蔗糖充分溶解。將培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃，加入3 mL 無(wú)水乙醇和1.5 mL 冰醋酸，攪拌均勻。最后加入30 mL 葡萄汁，攪拌成透明狀。將配制好的培養(yǎng)基倒入滅好菌的圓形胚胎收集盤中（紫外滅菌30 min），待培養(yǎng)基凝固，蓋上蓋子，用塑料袋密封，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高糖模型的構(gòu)建

將親代果蠅持續(xù)進(jìn)行高糖飲食處理直至羽化出子一代果蠅，收集子一代果蠅即為高糖果蠅。具體操作為：將普通培養(yǎng)基中羽化的2～3 d 果蠅轉(zhuǎn)入高糖培養(yǎng)基中適應(yīng)3 d（親代），任其交配，待第4 天換瓶轉(zhuǎn)入新的高糖培養(yǎng)基中（連續(xù)換瓶?jī)纱魏鬁绲粲H代成蠅），收集第4 天后產(chǎn)下的卵，卵羽化至成蠅（后代）即為高糖果蠅。為了保證果蠅的處理效果相同，每批果蠅控制收集前兩瓶的卵。操作示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 高糖果蠅模型構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of high-sucrose D.melanogaster model construction

1.3.3 生存實(shí)驗(yàn)

收集普通和高糖培養(yǎng)基中羽化8 h 內(nèi)的雄蠅，分別轉(zhuǎn)入含有對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，每管20 頭，每組3 管，普通培養(yǎng)基為對(duì)照組。記錄并觀察果蠅的生存時(shí)間。

1.3.4 攀爬能力的測(cè)定

對(duì)羽化8 h 內(nèi)的雄蠅進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試。每管雄蠅20 頭，適應(yīng)3 min 后，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)管，使果蠅落在底部，果蠅會(huì)自發(fā)向上爬，記錄10 s到達(dá)培養(yǎng)管7 cm刻度及以上果蠅的數(shù)目（A），每管果蠅至少測(cè)試5 次，兩次測(cè)試間隔至少1 min，確保每次晃動(dòng)的力度相同。普通培養(yǎng)基為對(duì)照組。攀爬指數(shù)（Climbing Index，CI）計(jì)算公式為：

式中：

A——果蠅向上爬的數(shù)量，頭；

B——果蠅總數(shù)量，頭。

1.3.5 果蠅體內(nèi)抗氧化酶的活力及丙二醛含量的測(cè)定

選取1 d 雄蠅，普通組為對(duì)照組，高糖組為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行樣品前處理，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，測(cè)定指標(biāo)有T-SOD 和CAT 活力以及MDA 含量。

1.3.6 果蠅產(chǎn)卵總數(shù)和胚胎孵化率的統(tǒng)計(jì)

將1 d 高糖雄蠅（40 頭），與3～5 d 的普通雌性處女蠅（40 頭），在葡萄汁收集盤中進(jìn)行交配，在葡萄汁收集盤中央放置一些酵母粉。24 h 后去除雄蠅，更換胚胎收集盤。每個(gè)重復(fù)每天更換一次新的胚胎收集盤，連續(xù)更換4 d，更換胚胎收集盤的時(shí)候數(shù)換下的胚胎收集盤中的總胚胎數(shù)，24～36 h 后，重新數(shù)此收集盤中已孵化的胚胎數(shù)，得出胚胎孵化率。解剖鏡下可觀察到已經(jīng)孵化的胚胎只剩下干癟的卵殼，而未孵化的則呈飽滿的米粒狀。對(duì)照組為1 d 普通雄蠅（40 頭）與3～5 d 普通雌性處女蠅（40 頭）交配。每個(gè)交配做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。胚胎孵化率計(jì)算公式為：

式中：

C——胚胎孵化率，%；

D——已孵化的胚胎數(shù)；

D0——收集的胚胎總數(shù)。

1.3.7 果蠅精巢DAPI 染色

1.3.7.1 精巢的解剖

取高糖培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）和普通培養(yǎng)基（對(duì)照組）中羽化的1 d 雄蠅于解剖鏡下解剖，在滴加w=0.9%的生理鹽水的解剖盤上解剖雄蠅精巢約30 對(duì)，為了避免清洗和染色過(guò)程中精巢遺失，解剖時(shí)需要保留一點(diǎn)黑色的尾端。

1.3.7.2 DAPI 染色步驟

在離心管中加入適量w=4%多聚甲醛溶液，將解剖后的果蠅精巢放入w=4%多聚甲醛溶液中，在室溫下固定30 min；隨后用PBS 緩沖液沖洗數(shù)次，沖洗過(guò)程將離心管緩慢來(lái)回晃動(dòng)，每次5 min；小心移去液體，緊接著將PBT 溶液（φ=0.1% Triton X-100+1x PBS）加入離心管中，在室溫下固定30 min；同樣地，移去多余液體，用1× PBS 沖洗2 次，5 min/次；接下來(lái)，加入少量（約50 μL）DAPI（10 μg/mL）對(duì)精巢進(jìn)行染色，染色時(shí)間為5～10 min。最后，進(jìn)行壓片，在清洗干凈的載玻片上滴一滴封片液，將200 μL 黃色槍頭的尖端剪去，小心吸取2～3 對(duì)精巢放于封片液上，用解剖鑷和解剖針去除多余組織，將精巢小心擺放好，用濾紙吸去多余的PBS，蓋上蓋玻片。將制好的玻片放于倒置熒光顯微鏡下拍照，選用10×物鏡。

1.3.8 拉曼光譜的獲取及預(yù)處理

1.3.8.1 拉曼光譜測(cè)量和拉曼成像

選用532 nm 激光的固體激光器對(duì)果蠅精巢進(jìn)行拉曼成像，以減少可能的熒光信號(hào)干擾，其輸出功率為50 MW，掃描樣品的激光功率為20 MW。激光束以5×物鏡聚焦在樣品上。在測(cè)試之前，首先進(jìn)行硅片校正，出峰位置為520.5 cm-1處。對(duì)精巢進(jìn)行單譜掃描，光譜采集的范圍為0～4 000 cm-1，曝光時(shí)間為10 s。每組樣品測(cè)試三個(gè)，每個(gè)樣品測(cè)試三個(gè)不同的點(diǎn)。此外，選取儲(chǔ)精囊200 μm×200 μm 區(qū)域進(jìn)行面掃描拉曼成像，曝光時(shí)間為0.01 s，激光功率為50%。

1.3.8.2 光譜預(yù)處理

使用WIRE 4.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行拉曼光譜預(yù)處理，包括扣除宇宙射線、背底和噪聲濾波等。Origin 2017 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)光譜進(jìn)行歸一化處理并分析各樣品的平均拉曼光譜。

1.3.9 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

基于Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)對(duì)1 d 對(duì)照組和高糖組雄蠅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序?qū)嶒?yàn)采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit 方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，其操作流程圖如圖2 所示。

圖2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程圖Fig.2 Flow chart of transcriptome sequencing

1.3.10 熒光定量

將提取的總RNA 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)合成cDNA。將合成的cDNA 稀釋8 倍，待用。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 為2 μL，上、下游引物分別為0.3 μL，SYBR Green qPCR Mix 為10 μL，RNase-Free ddH2O為7.4 μL。采用兩步法PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)1 次；隨后95 ℃變性10 s，52～58 ℃退火延伸數(shù)據(jù)采集30 s，循環(huán)40 次（具體基因引物見(jiàn)表1）。目的基因與內(nèi)參基因（Rp49）之間的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)2-ΔCT 公式計(jì)算，ΔCT=CT 目的基因-CTRp49，用Student′st檢驗(yàn)來(lái)統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)量之間的差異性。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 7.0 軟件對(duì)所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖，并進(jìn)行Student’st-檢驗(yàn)。生存試驗(yàn)采用Log-rank 檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估壽命的顯著性。以p＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖飲食對(duì)雄蠅壽命的影響

通過(guò)連續(xù)給雄蠅喂養(yǎng)高糖飲食，結(jié)果表明，雄蠅的中位生存期由34 d 縮短到29 d，高糖組生存曲線與對(duì)照組生存曲線相比極顯著縮短（圖3，p＜0.000 1）。結(jié)合之前的研究，猜測(cè)果蠅壽命的縮短可能是由于糖分?jǐn)z入量過(guò)高損傷了果蠅體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)[6]。

圖3 高糖對(duì)果蠅生存曲線的影響Fig.3 Effect of high sucrose on the survival curveof D.melanogaster

2.2 高糖飲食對(duì)雄蠅攀爬能力的影響

果蠅具有反趨地性行為，即在一個(gè)垂直的空間內(nèi)果蠅會(huì)自發(fā)向上運(yùn)動(dòng)[18]。利用果蠅的這種特性，測(cè)定了果蠅的攀爬能力用來(lái)反映果蠅的運(yùn)動(dòng)能力。攀爬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖飲食極顯著降低了雄蠅的攀爬能力，損傷了雄蠅的運(yùn)動(dòng)能力。高糖組果蠅的攀爬指數(shù)由77%降低到 35.67%，約為對(duì)照組的 46.32%（圖4，p＜0.000 1）。

圖4 果蠅運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定Fig.4 Exercise ability of D.melanogaster

2.3 高糖飲食對(duì)雄蠅抗氧化能力的影響

高糖對(duì)雄蠅的抗氧化能力有顯著的抑制效果。與對(duì)照組相比，高糖組T-SOD 和CAT 活性顯著降低，說(shuō)明高糖飲食降低了雄蠅清除氧自由基的能力；MDA含量極顯著增加，說(shuō)明雄蠅抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的能力降低。高糖組T-SOD 活性由32.72 U/mg prot 降低到27.31 U/mg prot，活性為對(duì)照組的83.47%（圖5a，p＜0.001）；CAT 活性由8.72 U/mg prot 降低到6.93 U/mg prot，活性為對(duì)照組的79.47%（圖5b，p＜0.01）；MDA 含量由13.33 nmol/mg prot 增加到20.18 nmol/mg prot，為對(duì)照組含量的1.51 倍（圖5c，p＜0.000 1）。

圖5 高糖飲食對(duì)雄蠅抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of high-sucrose diet on antioxidant capacity of male flies

2.4 高糖飲食對(duì)雄蠅繁殖力的影響

按照表2 的交配方法，統(tǒng)計(jì)后代的胚胎孵化率。與對(duì)照組相比，高糖組果蠅胚胎孵化率顯著降低，由88.08%降低到70.77%，說(shuō)明了高糖飲食損傷了雄蠅的育性。

表2 雄性果蠅繁殖力實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The fertility test of male D.melanogaster

2.5 高糖飲食對(duì)雄蠅生殖細(xì)胞的影響

為了探明高糖飲食影響雄蠅育性的機(jī)理，探究是否影響果蠅精子的發(fā)生過(guò)程，對(duì)雄蠅精巢進(jìn)行了DAPI染色，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，高糖組果蠅精巢整體膨大異常，精巢末端精子細(xì)胞核數(shù)量減少（圖6a、6c）；高糖組精巢儲(chǔ)精囊中不存在精子束，而對(duì)照組儲(chǔ)精囊中存在明顯的精子束圖（圖6b、6d）。

圖6 對(duì)照組和高糖組果蠅精巢的DAPI 染色Fig.6 DAPI staining of fly testis in control group and high sucrose group

2.6 高糖飲食對(duì)雄蠅精巢組織生化成分的影響

對(duì)果蠅精巢進(jìn)行平均拉曼光譜掃描，兩組的平均拉曼光譜如圖7 所示，可以看出對(duì)照組和高糖組出現(xiàn)多個(gè)峰值變化，反映出了明顯差異。對(duì)照組和高糖組峰位信號(hào)強(qiáng)度變化的主要峰值在573、813、996、1 100、1 450、1 520、1 558 和1 720 cm-1處。光譜中拉曼峰所代表的生化成分如表3 所示。高糖組精巢的拉曼光譜中代表蛋白質(zhì)條帶（1 100、1 450、1 558 和1 720 cm-1），核酸條帶和膠原帶（481、573、813 和996 cm-1）的拉曼峰強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。通過(guò)觀察拉曼組織成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組精巢573 cm-1（色氨酸、核酸），813 cm-1（膠原蛋白、RNA），1 100 cm-1（DNA、蛋白質(zhì)），1 450 cm-1（蛋白質(zhì)、磷脂）和1 720 cm-1（天冬氨酸、谷氨酸）處的生物成分分布均勻，而高糖組精巢的物質(zhì)分布不規(guī)則（圖8）。

圖7 兩組處理后平均拉曼光譜（200～1 800 cm-1）Fig.7 Average Raman spectra of the two groups after treatment(200～1 800 cm-1)

表3 各個(gè)拉曼峰位代表的生化成分Table 3 Biochemical components of Raman peak

圖8 對(duì)照組精巢（Ctrl）和高糖組精巢（Hgcr）在200 μm×200 μm 區(qū)域面掃描的拉曼成像Fig.8 Raman imaging of testis of control group (Ctrl) and high-sucrose group (Hgcr) in 200 μm×200 μm region

2.7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與熒光定量

利用Illumina 測(cè)序平臺(tái)對(duì)對(duì)照組和高糖組雄蠅進(jìn)行測(cè)序，篩選出表達(dá)量大于1 的基因，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)照組雄蠅特有159 個(gè)基因，高糖組雄蠅特有574 個(gè)基因，兩組共有基因?yàn)?2 037 個(gè)（圖9a）。采用edgeR 差異分析軟件篩選出差異表達(dá)量基因，篩選閾值為：差異倍數(shù)|log2FC|≥1 和p＜0.05，并對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行多次檢測(cè)和分析。結(jié)果表明，對(duì)照組與高糖組雄蠅差異表達(dá)基因共739 個(gè)（圖9b）。隨后，通過(guò)GO 功能注釋分析比較基因的功能，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因參與生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分。在生物學(xué)過(guò)程分類中，245 個(gè)基因參與代謝過(guò)程、89 個(gè)基因參與應(yīng)激反應(yīng)、50 個(gè)基因參與發(fā)育過(guò)程、29 個(gè)基因參與繁殖過(guò)程、12 個(gè)基因與昆蟲(chóng)行為相關(guān)（圖10）。GO 富集分析差異表達(dá)基因主要具有哪些功能，結(jié)果表明差異表達(dá)基因主要涉及氧化還原過(guò)程和氧化還原酶活性（圖11）。進(jìn)一步，通過(guò)熒光定量PCR 驗(yàn)證了部分差異基因的表達(dá)量（表4），結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一致（圖12）。與糖代謝相關(guān)的基因Pepck1和谷胱甘肽合成相關(guān)的基因GstD2表達(dá)上調(diào)，與成蟲(chóng)壽命相關(guān)的基因mthl2、參與凋亡細(xì)胞清除的基因NimC4、與早期胚胎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因vkg、參與雄性求偶行為的基因CheB42a表達(dá)下調(diào)。

圖9 對(duì)照組和高糖組雄蠅基因表達(dá)差異圖Fig.9 Differences in gene expression between male flies in the control group and the high-sucrose group

圖10 對(duì)照組和高糖組果蠅差異基因的GO功能注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.10 Statistical diagram of GO functional annotation classification of differential expression genes in flies

圖11 對(duì)照組和高糖組果蠅差異基因的GO 富集分析圖Fig.11 GO enrichment analysis of differential expression genes

圖12 對(duì)照組和高糖組果蠅差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.12 qRT-PCR validation of differential expression genes in flies

表4 熒光定量驗(yàn)證的基因Table 4 Genes verified by fluorescence quantification

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，高含糖飲食會(huì)造成后代雄性果蠅壽命、運(yùn)動(dòng)能力、抗氧化能力和生育能力降低。胚胎孵化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，高糖組果蠅的胚胎孵化率降低，說(shuō)明高糖飲食對(duì)雄蠅的育性產(chǎn)生了不利影響。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可能在糖尿病及其誘發(fā)相關(guān)男性生殖功能障礙和異常的病理生理學(xué)中都起重要作用[29]。因此，高糖飲食誘導(dǎo)雄蠅抗氧化能力損傷，可能是導(dǎo)致雄蠅生育能力降低的原因之一，這些改變會(huì)影響睪丸細(xì)胞的糖代謝[30,31]。此外，精子的細(xì)胞膜由大量的不飽和脂肪酸構(gòu)成，容易被氧化（脂質(zhì)過(guò)氧化）；另一方面，細(xì)胞質(zhì)中含有的能夠中和ROS 的酶又很少量，所以精子特別容易受到ROS 的破壞作用[32]。

為了進(jìn)一步探究影響雄性育性的機(jī)理，我們通過(guò)DAPI 精核染色發(fā)現(xiàn)，高糖飲食組果蠅精巢整體膨大異常，儲(chǔ)精囊中沒(méi)有明顯的精子束。在大鼠中的研究也有相似結(jié)果，與正常組大鼠附睪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)相比，高脂高糖組附睪結(jié)構(gòu)受損，管腔內(nèi)精子數(shù)目極少[33]。激光顯微共焦拉曼成像結(jié)果與生物學(xué)測(cè)定結(jié)果一致，高糖組精巢的拉曼光譜中代表蛋白質(zhì)條帶（1 100、1 450、1 558 和1 720 cm-1），核酸條帶和膠原帶（481、573、813 和996 cm-1）的拉曼峰強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。在1 520 cm-1代表的類胡蘿卜素處，對(duì)照組的拉曼峰強(qiáng)度明顯高于高糖組。而類胡蘿卜素在抗氧化方面具有重要的功效，不僅能直接作為抗氧化劑來(lái)清除自由基，還能增加體內(nèi)SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和CAT 等抗氧化酶的含量，進(jìn)而強(qiáng)化機(jī)體自身的抗氧化能力[34]，進(jìn)一步聯(lián)系了氧化損傷與生育力的關(guān)系。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及熒光定量驗(yàn)證結(jié)果表明，與糖代謝相關(guān)的基因Pepck1和谷胱甘肽合成相關(guān)的基因GstD2出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明高糖組果蠅可能是由于糖代謝異常和氧化應(yīng)激異常導(dǎo)致果蠅發(fā)育和育性受到影響。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)了與成蟲(chóng)壽命相關(guān)的基因mthl2、參與凋亡細(xì)胞清除的基因NimC4表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，進(jìn)一步解釋了高糖飲食導(dǎo)致雄蠅壽命縮短的原因。Park等研究發(fā)現(xiàn)CheB42a突變雄性果蠅比對(duì)照組雄性果蠅更早、更頻繁地嘗試與雌性交配，表明CheB42a能調(diào)節(jié)雄性的求偶行為[35]。同樣地，本研究中與早期胚胎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因vkg、參與雄性求偶行為的基因CheB42a表達(dá)量也出現(xiàn)了下調(diào)，說(shuō)明這些基因可能影響著果蠅的育性。

4 結(jié)論

綜上，高糖飲食抑制了雄性黑腹果蠅發(fā)育，同時(shí)對(duì)果蠅的生育能力造成了損傷，DAPI 精核染色和共焦拉曼光譜均說(shuō)明了高糖飲食對(duì)精巢造成了損傷。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)高糖組果蠅的差異表達(dá)基因富集在果蠅發(fā)育過(guò)程、機(jī)體代謝活動(dòng)調(diào)控及應(yīng)激反應(yīng)等方面，從而縮短果蠅壽命和損傷果蠅育性。