賴(lài)幸菲，王瓊，黎秋華，孫伶俐，陳若虹，文帥，張鎮(zhèn)標(biāo)，劉曉慧*，孫世利*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東省茶樹(shù)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）（2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，云南昆明 650201）

急性酒精中毒（Acute Alcoholic Intoxication，AAI），即醉酒，是指短時(shí)間內(nèi)攝入大量酒精，體內(nèi)酒精的吸收大于代謝，被吸收的酒精進(jìn)入到血液循環(huán)，通過(guò)血腦屏障入腦而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，造成肝臟、心臟、腎臟等器官及消化、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)的損傷的病理過(guò)程[1]。急性酒精中毒造成機(jī)體損傷的作用機(jī)制很復(fù)雜，多種途徑參與損傷的發(fā)生，主要的機(jī)制有大量的乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)肝臟的損傷機(jī)制、氧化應(yīng)激、炎癥機(jī)制等[2,3]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人際交往的增加，酒精的消費(fèi)量日益增加，WHO 發(fā)布的2018 年全球酒精與健康狀況報(bào)告中指出，2016 年約300 萬(wàn)人死于飲酒，占全球總死亡人數(shù)的5.3%，而中國(guó)是全球飲酒致死人數(shù)最多的國(guó)家，酗酒、酒精依賴(lài)已經(jīng)是當(dāng)今我國(guó)乃至全世界日益嚴(yán)重的公共健康[4]。因此，安全、有效、無(wú)副作用的天然解酒產(chǎn)品的研發(fā)一直是當(dāng)今世界持續(xù)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

茶在中國(guó)最早是因其藥用價(jià)值而出現(xiàn)的，早在三國(guó)（魏）張揖《廣雅》和唐代《采茶錄》中就有記載茶能“醒酒”，宋代楊士瀛《仁齋直指方》稱(chēng)茶能“解酒食之毒”，明代李士材《本草圖解》稱(chēng)茶能治“酒毒”[5]?，F(xiàn)代研究也表明茶葉[6-9]及其活性成分茶多酚[10,11]、兒茶素[12,13]、黃酮類(lèi)[14]、L-茶氨酸[15,16]、沒(méi)食子酸[17]等具有解酒或緩解酒精性肝損傷的作用。目前，有關(guān)茶葉緩解急性酒精中毒的研究主要是綠茶類(lèi)和黑茶類(lèi)，紅茶類(lèi)的研究則集中在對(duì)慢性酒精中毒的保護(hù)作用，有關(guān)其緩解AAI 的作用及機(jī)制的研究報(bào)道較少。

英紅九號(hào)是廣東省英德紅茶的典型代表，在廣東省大面積推廣種植，英紅九號(hào)紅茶內(nèi)含物豐富，品質(zhì)優(yōu)異，經(jīng)濟(jì)效益極高。有研究報(bào)道[18]，英紅九號(hào)紅茶（英紅）中的茶黃素和茶紅素的含量均高于云南紅茶（滇紅）和祁門(mén)紅茶（祁紅），英紅九號(hào)紅茶還具有抗氧化[18]、抗前列腺癌[19]、抑制肥胖[20,21]等功效，而有關(guān)英紅九號(hào)紅茶緩解AAI 的作用及機(jī)制的研究尚未見(jiàn)有報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用一次灌胃過(guò)量白酒建立小鼠AAI 模型，通過(guò)灌胃不同劑量的英紅九號(hào)紅茶水提物（Yinghong NO.9 Black Tea Water Extract，YBTE），觀察給藥后小鼠的翻正反射消失和出現(xiàn)的時(shí)間，以及測(cè)定血清和肝臟中生化指標(biāo)及相關(guān)炎癥蛋白的表達(dá)，探究英紅九號(hào)紅茶緩解AAI 作用及分子機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)天然的紅茶解酒護(hù)肝產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

英紅九號(hào)（Camellia sinensisvar.assamicacv.Yinghong 9）紅茶，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所基地提供。二鍋頭白酒（56°），北京壇井坊酒業(yè)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）測(cè)試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）測(cè)試盒，南京建成生物工程有限公司；乙醇脫氫酶（ADH）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司；BCA 蛋白定量測(cè)試盒，Thermo Fisher Scientific；TNF-α、NF-κB、NF-κBp65 抗體，Cell Signing Technology；IL-1β、β-actin 抗體，Abcam公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

小鼠規(guī)格：SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠，7 周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)條件：小鼠飼養(yǎng)于（25±2）℃恒溫環(huán)境中，相對(duì)濕度為50%～60%，光照12 h，自由攝食飲水，在SPF 級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 儀器設(shè)備

TriStar LB941 多功能酶標(biāo)儀，德國(guó)Berthold Technologies 公司；HE 90 水平電泳槽、VE 186 轉(zhuǎn)移電泳槽、Tanon-5200 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf；1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；JH-12-06 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；OHAUS 準(zhǔn)微量電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；ZMQS5001 型Millipore 純水儀，密理博公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 YBTE 的制備

按茶水比（m/V）1:30，沸蒸餾水浸提2 次，每次浸提20 min，浸提結(jié)束后過(guò)濾，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮，冷凍干燥成凍干粉后置于干燥器內(nèi)備用。

1.4.2 英紅九號(hào)紅茶生化成分的測(cè)定

水分含量：按照國(guó)標(biāo)“GB 5009.3-2016 食品中水分的測(cè)定”進(jìn)行測(cè)定；水浸出物含量：按照國(guó)標(biāo)“GB/T 8305-2013 茶水浸出物測(cè)定”進(jìn)行測(cè)定；茶多酚含量：按照國(guó)標(biāo)“GB/T 8313-2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法”進(jìn)行測(cè)定；游離氨基酸總量：按照國(guó)標(biāo)“GB/T 8314-2013 茶游離氨基酸總量的測(cè)定”進(jìn)行測(cè)定；可溶性總糖含量：采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定；黃酮類(lèi)含量采用三氯化鋁比色法進(jìn)行測(cè)定；茶黃素、茶紅素和茶褐素的含量采用系統(tǒng)比色法進(jìn)行測(cè)定。

兒茶素單體、沒(méi)食子酸、咖啡堿含量參照國(guó)標(biāo)“GB/T 8313-2018茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法”進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行了改進(jìn)，具體色譜條件如下：色譜柱：phenomenex C18柱（150×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；檢測(cè)溫度28 ℃；流動(dòng)相A：含φ=0.5%乙酸、φ=1%乙腈和φ=2%甲醇的水溶液，流動(dòng)相B：含φ=0.5%乙酸、φ=10%乙腈和φ=20%甲醇的水溶液；洗脫步驟：在30 min 內(nèi)，A 相由72.5%到20%，B 相由27.5%到80%，30 min 后在5 min 內(nèi)，A 相由20%恢復(fù)到72.5%，B 相由80%恢復(fù)到27.5%，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。以外標(biāo)法按峰面積進(jìn)行定量。

1.4.3 小鼠急性酒精中毒模型建立

取小鼠40 只，隨機(jī)分成4 組，每組10 只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，根據(jù)小鼠體重按15 mL/kg灌胃量，分別以56°白酒原液、56°白酒稀釋液①（白酒:蒸餾水，3:1，V/V）、56°白酒稀釋液②（白酒:蒸餾水，2:1，V/V）和56°白酒稀釋液③（白酒:蒸餾水，1:1，V/V）灌胃小鼠，觀察各組小鼠的活動(dòng)狀態(tài)，記錄小鼠情況。以翻正反射是否消失作為小鼠醉酒與否的標(biāo)準(zhǔn)，即小鼠灌胃白酒一段時(shí)間后，使其背部朝下，若小鼠保持此姿勢(shì)30 s，則認(rèn)為翻正反射消失，即為醉酒。選擇小鼠醉酒率最高而死亡率最低的白酒濃度，即為建立小鼠急性酒精中毒模型最適酒精濃度。

1.4.4 小鼠醉酒時(shí)間和醒酒時(shí)間的統(tǒng)計(jì)

取小鼠40 只，隨機(jī)分成4 組，每組10 只，根據(jù)小鼠體重按量給藥，分別設(shè)為是模型組、YBTE 低劑量組（500 mg/kg）、YBTE 中劑量組（1 000 mg/kg）和YBTE 高劑量組（2 000 mg/kg）。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，0 h 時(shí)各給藥組均一次性灌胃給藥，模型組灌胃等體積蒸餾水，30 min 后各組小鼠均分別按最適酒精劑量灌胃白酒，通過(guò)觀察各組小鼠活動(dòng)情況，記錄小鼠翻正反射消失的時(shí)間和翻正反射出現(xiàn)的時(shí)間。

1.4.5 YBTE 緩解小鼠急性酒精中毒的作用機(jī)制研究

1.4.5.1 小鼠分組與給藥

取小鼠50 只，隨機(jī)分成5 組，每組10 只，根據(jù)小鼠體重按量給藥，分別設(shè)為是正常組、模型組、YBTE 低劑量組（500 mg/kg）、YBTE 中劑量組（1 000 mg/kg）和YBTE 高劑量組（2 000 mg/kg）。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按照1.4.4 進(jìn)行灌胃給藥，正常組灌胃等體積蒸餾水，30 min 后除正常組外，各組小鼠灌胃白酒，正常組灌胃等體積蒸餾水，末次灌胃結(jié)束1 h 后麻醉小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼處死后解剖取肝臟組織。

1.4.5.2 小鼠血清中ALT 和AST 活性的測(cè)定

收集血液靜置30 min 后，于4 ℃溫度下，3 000 r/min 離心20 min 分離得到血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法檢測(cè)血液中ALT 和AST 的活性。

1.4.5.3 小鼠血清和肝臟中ADH 活性的測(cè)定

采血完成后處死小鼠，迅速解剖取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水漂洗并用濾紙吸干。剪取少量肝組織加入9 倍體積預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行勻漿，于4 ℃溫度下，以2 500 r/min 離心15 min，得到上清液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定血清和肝臟組織中ADH 活力。

1.4.5.4 Western blotting 檢測(cè)肝臟中炎癥因子相關(guān)蛋白的表達(dá)

（1）肝組織中總蛋白的提取及樣品制備

取各組肝組織約40 mg，按照1:10（m/V）比例，加入RIPA 裂解液，置于勻漿機(jī)上充分勻漿，勻漿結(jié)束后將勻漿管插入冰中靜止1 h，收集勻漿液于1.5 mL離心管中，于4 ℃溫度下，13 200 r/min 離心20 min等到上清液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）定量蛋白

按照BCA 蛋白定量測(cè)試盒的說(shuō)明書(shū)的方法對(duì)肝組織上清液進(jìn)行蛋白定量。

（3）Western blot 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

蛋白質(zhì)樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉在搖床上室溫封閉90 min，裁剪目標(biāo)條帶，選取目標(biāo)蛋白的一抗于4 ℃孵育12 h，洗膜，孵育二抗，洗膜，ECL 法顯影，用Image J 軟件分析條帶灰度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以ˉ表示，采用方差分析（one-way ANOVA），p＜0.05 表示具有顯著差異，p＜0.01 表示具有極顯著差異。

小波分析是由法國(guó)石油工程師Morlet于1980年在進(jìn)行地震數(shù)據(jù)分析工作時(shí)首創(chuàng)。它是一種信號(hào)的時(shí)間－頻率分析方法，具有多分辨率分析的特點(diǎn)，在時(shí)域和頻域都能反映出信號(hào)的振幅、相位和功率的局部變化特征，近年來(lái)廣泛用于多尺度氣候分析研究中［6］。Morlet小波母函數(shù)的形式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 英紅九號(hào)紅茶生化成分分析

由表1 的結(jié)果可知，英紅九號(hào)紅茶茶多酚含量為19.36%，氨基酸含量為3.64%，咖啡堿含量為4.14%，黃酮類(lèi)含量為0.72%，可溶性糖含量4.26%，沒(méi)食子酸含量為0.23%，茶黃素含量為0.17%，茶紅素含量為7.10%，茶褐素含量為2.48%。從表2 的結(jié)果可知，英紅九號(hào)紅茶兒茶素的總量為3.78%，各兒茶素單體的含量表現(xiàn)為EGC＞GCG＞EGCG＞CG＞GC≈ECG＞EC＞C。

表1 英紅九號(hào)紅茶生化成分含量（%wt）Table 1 Contents of the biochemical components in Yinghong NO.9 black tea (%wt)

表2 英紅九號(hào)紅茶兒茶素含量（%wt）Table 2 Contents of catechins monomers in Yinghong NO.9 black tea (%wt)

2.2 急性酒精中毒動(dòng)物模型造模酒精濃度選擇

由表3 的結(jié)果可知，56°白酒稀釋液②處理組的小鼠均表現(xiàn)出翻正反射消失的現(xiàn)象，且沒(méi)有小鼠出現(xiàn)死亡，因此選定該酒精濃度為急性酒精中毒動(dòng)物模型最佳的造模濃度。

表3 不同酒精度白酒對(duì)小鼠翻正反射的影響Table 3 Contents of catechins monomers in Yinghong NO.9 black tea

2.3 YBTE對(duì)小鼠入睡時(shí)間和睡眠時(shí)間的影響

急性酒精中毒是指一次攝入過(guò)量酒精引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)由興奮轉(zhuǎn)為抑制的狀態(tài)，臨床上表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍嗜睡，嚴(yán)重者可出現(xiàn)昏迷、血壓下降、呼吸困難甚至死亡[22]。小鼠過(guò)量攝入乙醇后會(huì)逐漸出現(xiàn)后腿拖地爬行，行動(dòng)呆滯，昏睡、翻正反射消失等現(xiàn)象，以翻正反射是否消失作為小鼠醉酒與否的標(biāo)準(zhǔn)。有研究報(bào)道，綠茶和普洱茶均可延長(zhǎng)急性酒精中毒小鼠的入睡時(shí)間，并能縮短其睡眠時(shí)間，具有良好的抗醉解酒作用[7]。本研究結(jié)果表明（圖1a），模型組小鼠翻正反射消失的時(shí)間為24.89 min，YBTE高劑量組能極顯著地延長(zhǎng)小鼠的入睡時(shí)間，翻正反射消失的時(shí)間延長(zhǎng)到40.89 min（p＜0.01），低劑量組和中劑量組則沒(méi)有顯著差異。從圖1b 的結(jié)果可知，模型組小鼠翻正反射出現(xiàn)的時(shí)間為166.18 min，YBTE 高劑量組顯著地縮短小鼠的睡眠時(shí)間，翻正反射出現(xiàn)的時(shí)間為95.75 min（p＜0.05），中劑量組的睡眠時(shí)間也有所縮短，但未達(dá)到顯著差異?？梢?jiàn)，英紅九號(hào)紅茶既能延長(zhǎng)小鼠對(duì)乙醇的耐受時(shí)間，也能縮短睡眠時(shí)間。

圖1 YBTE 對(duì)急性酒精中毒小鼠入睡時(shí)間和睡眠時(shí)間的影響Fig.1 Effects of YBTE on the time of losing righting reflex and sleeping time of mice with acute alcoholism

2.4 YBTE 對(duì)小鼠血清中ALT 和AST 活性的影響

AST 和ALT 是臨床上判斷肝損傷最重要的兩項(xiàng)指標(biāo)，當(dāng)肝組織有損傷時(shí)，這兩種酶就會(huì)釋放到血清中，因此檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)在血清中的活性能判斷肝臟的健康和功能情況。急性酒精中毒會(huì)引發(fā)肝損傷，血清中ALT和AST活性水平與肝臟損傷呈負(fù)相關(guān)性[23]。由圖2 的結(jié)果可知，與正常組相比，模型組小鼠的攝入乙醇后，血清ALT（52.57 U/L）和AST（49.67 U/L）的活性均極顯著提高（p＜0.01），說(shuō)明乙醇導(dǎo)致了小鼠的肝臟功能受損。不同劑量YBTE 預(yù)處理后，小鼠血清中ALT 和AST 的活性均顯著地降低（p＜0.01），且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)，其中高劑量組小鼠的ALT 活性下降到22.89 U/L，AST 活性下降到29.58 U/L，這與Luczaj 等[24]的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明英紅九號(hào)紅茶對(duì)乙醇引起的肝功能損傷具有一定保護(hù)作用。

圖2 YBTE 對(duì)急性酒精中毒小鼠血清ALT 和AST 的影響Fig.2 Effects of YBTE on ALT and AST levels in the serum from mice with acute alcoholism

2.5 YBTE 對(duì)小鼠血清和肝臟中ADH 活性的影響

圖3 YBTE 對(duì)急性酒精中毒小鼠血清和肝臟ADH 的影響Fig.3 Effects of YBTE on ADH activity in the serum and liver from mice with acute alcoholism

2.6 YBTE對(duì)小鼠肝臟中炎癥因子相關(guān)蛋白表達(dá)影響

核因子-κΒ（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）NF-κB 是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也參與許多重要的生物過(guò)程的調(diào)控，多種疾病的發(fā)病機(jī)制與NF-κB 的異?；罨嘘P(guān)[27]。大量研究表明，乙醇可激活肝組織中的NF-κB信號(hào)通路，使NF-κB磷酸化入核，激活多種促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β等）和NO 合酶的表達(dá)，引發(fā)肝細(xì)胞炎癥、壞死，甚至凋亡[28-33]。因此，TNF-α/NF-κB 信號(hào)通路可能會(huì)成為緩解急性酒精中毒的重要靶點(diǎn)。有研究報(bào)道，綠茶和青蒿組合提取物可通過(guò)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路緩解酒精性胃炎[34]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，信陽(yáng)紅、白毫銀針、君山銀針、大紅袍、茯磚茶、信陽(yáng)毛尖六種茶葉水提物均能顯著上調(diào)PPAR-αmRNA 相對(duì)表達(dá)水平，并能明顯降低TNF-αmRNA 及IL-1βmRNA 的相對(duì)表達(dá)量，表明不同茶葉水提物具有良好的保肝效果[35]。此外，有研究表明茶葉中的活性成分兒茶素及EGCG 可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路緩解酒精性脂肪肝或乙醇誘導(dǎo)的肝功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥[36,37]，L-茶氨酸可通過(guò)調(diào)控TNF-α/NF-κB 信號(hào)通路緩解酒精性肝損傷[38]。

本研究結(jié)果顯示（圖4），與正常組相比，模型組小鼠肝組織中p-NF-κB p65 的表達(dá)量極顯著增加（p＜0.01），表明乙醇可以激活NF-κB 信號(hào)通路。與模型組比較，YBTE 低、中、高劑量組小鼠的肝組織的p-NF-κB p65 的表達(dá)量明顯下降，中劑量組和高劑量組的表達(dá)水平達(dá)到顯著差異（p＜0.05）。圖5a、5b和5c 顯示了TNF-α和IL-1β在小鼠肝臟中的表達(dá)情況。與正常組相比，模型組小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)量極顯著增加（p＜0.01）。與模型組比較，YBTE 低、中、高劑量組小鼠的肝組織的TNF-α的表達(dá)量明顯下降，其中，低劑量組和中劑量組達(dá)到顯著差異（p＜0.05），高劑量組達(dá)到極顯著差異（p＜0.01）；不同劑量YBTE 組中，IL-1β的表達(dá)水平均極顯著降低（p＜0.01），說(shuō)明英紅九號(hào)紅茶可以劑量依賴(lài)地降低p-NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)。

圖4 YBTE 對(duì)急性酒精中毒小鼠肝臟中p-NF-κB p65 的表達(dá)水平影響Fig.4 Effects of YBTE on p-NF-κB p65 level in liver from mice with acute alcoholism

圖5 YBTE 對(duì)急性酒精中毒小鼠肝臟中TNF-α、IL-1β 的表達(dá)水平影響Fig.5 Effects of YBTE on TNF-α and IL-1β level in liver from mice with acute alcoholism

3 結(jié)論

綜上所述，YBTE 能降低急性酒精中毒小鼠血清ALT 和AST 水平，增強(qiáng)血清和肝臟中ADH 的活性，加快乙醇在體內(nèi)的代謝，并通過(guò)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路，下調(diào)肝臟中TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而起到具有良好的抗醉、解酒和護(hù)肝作用。本研究為紅茶開(kāi)發(fā)天然的解酒護(hù)肝產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)，但英紅九號(hào)紅茶中富含多種活性功能成分，但其發(fā)揮緩解急性酒精中毒的作用的活性成分有待進(jìn)一步的研究。