姜桂來， 郁舒陽， 俞莞茜， 周宇軒， 周哲敏， 李 恒

抗生素的過度使用加速了細菌耐藥性的發(fā)展。2017年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)發(fā)布對人類健康最具威脅的12種“超級細菌”，表明細菌抗生素耐藥性已成為全球公共衛(wèi)生問題[1]。2022年Lancet發(fā)布的最新研究指出，2019年全球有127萬例患者死亡和抗生素耐藥直接相關(guān)；約495萬例因耐藥菌感染病逝[2]。細菌耐藥性的出現(xiàn)和蔓延，是當今人類社會三大死亡原因之一[3]。因此，對于細菌耐藥性的監(jiān)測刻不容緩。最近研究表明，在中國爆發(fā)的多重耐藥細菌中，以沙門菌為代表的腸桿菌廣泛攜帶blaOXA-1、blaTEM-1和β-內(nèi)酰胺酶等細菌耐藥性基因[4]。此外，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌以及鮑曼不動桿菌的多重耐藥性也是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的最重要原因之一[5-8]。根據(jù)我國2014至2019年及2022上半年的細菌耐藥性監(jiān)測報告(www.chinets.com)顯示，耐藥性大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌為我國臨床主要耐藥菌[9]。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率雖有下降趨勢，但仍然在30%或以上；碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的檢出率仍保持高位，監(jiān)測顯示第三代頭孢菌素耐藥腸桿菌目細菌已流行傳播。多重耐藥細菌的出現(xiàn)和快速擴散正在將人類逐步推向“后抗生素時代”。鑒于此，細菌的耐藥性檢測、新型細菌耐藥性檢測技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用迫在眉睫。臨床上多重耐藥細菌的檢測中，抗生素敏感性試驗(antimicrobial susceptibility testing，AST)是目前較常使用的方法，包括紙片擴散法、瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、濃度梯度法等經(jīng)典方法。隨后出現(xiàn)了物理、化學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如應(yīng)用流式細胞儀、質(zhì)譜儀和拉曼光譜儀等方法推算細菌的耐藥性；以及免疫雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴增技術(shù)等檢測細菌的耐藥基因。如今，隨著測序技術(shù)的迭代更新和生物信息學(xué)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細菌耐藥檢測領(lǐng)域，包括全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)、宏基因組測序(metagenomics sequencing,mNGS)和微生物單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(microbial-single-cell RNA sequencing,MscRNA-seq)等技術(shù)?；谏鲜鰴z測技術(shù)和方法，本文闡述了各類細菌耐藥性及耐藥基因檢測的原理、優(yōu)點和局限性，并對經(jīng)典技術(shù)和新技術(shù)的關(guān)聯(lián)性及應(yīng)用場景進行分析，為我國細菌耐藥性的預(yù)防和監(jiān)測提供相關(guān)技術(shù)支持。

1 基于經(jīng)典方法的細菌耐藥性檢測

臨床對于細菌AST多采用表型檢測的方法，按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)或者歐洲藥敏試驗聯(lián)合委員會(European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing,EUCAST)頒布的《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》執(zhí)行。國內(nèi)外臨床和實驗室常使用的AST包括紙片擴散法、瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、濃度梯度法等經(jīng)典方法。此類經(jīng)典方法檢測時間在18～24 h，常用于臨床耐藥菌株的表型篩查。其優(yōu)點在于便捷、靈敏、可重復(fù)、成本低。但此類方法僅限于細菌耐藥性的表型檢測，無法檢測耐藥基因。

1.1肉湯稀釋法 肉湯稀釋法是細菌耐藥性檢測的傳統(tǒng)方法。肉湯稀釋法一般包括肉湯微量稀釋法和肉湯宏量稀釋法，前者96孔微量板中抗菌藥物稀釋液體積通常是每孔0.1 ml，后者每個含不同濃度抗菌藥物的測試管中肉湯體積為≥1 ml(通常為2 ml)。微量肉湯稀釋法是目前已視為藥敏試驗的國際參考方法(CLSI)，其主要優(yōu)點在于抗菌藥物敏感性試驗的全球標準化，接種和判讀的過程簡單，且可同時對單株菌株進行多種抗菌藥物的測試。但其缺點在于最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值的誤差較大，存在一定的技術(shù)可變性，對操作者實驗技能和無菌意識要求較高。而肉湯宏量稀釋法是一種易于標準化、可靠的標準參考方法，對以研究為目的或測試一種藥物對一株細菌的MIC值的判讀具有較大的價值和意義。

1.2瓊脂稀釋法 標準化的瓊脂稀釋法是將一種抗菌藥物與瓊脂培養(yǎng)基混合，每塊平板中含有不同濃度的藥物，再將接種物單獨或者同時點種在瓊脂表面，培養(yǎng)48 h后計數(shù)菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。此外還可以接種到顯色瓊脂培養(yǎng)基，針對敏感菌株在18～24 h內(nèi)出現(xiàn)的顏色反應(yīng)，更快地檢測和篩查相關(guān)耐藥細菌。此類方法適用于多細菌的培養(yǎng)物，可用來區(qū)分菌株和物種[10]。瓊脂稀釋法的優(yōu)點是操作簡單、成本低，其測定的MIC值穩(wěn)定、可靠。

1.3紙片擴散法 紙片擴散法也稱為Kirby-Bauer(K-B)抗生素試驗。藥敏片中的抗生素在瓊脂中呈放射狀擴散，藥物濃度隨離培養(yǎng)基距離的增加呈對數(shù)下降，并在培養(yǎng)基周圍形成圓形生長抑制區(qū)，其直徑與MIC呈反比。區(qū)域的直徑顯示了分離物的敏感性和藥物通過瓊脂培養(yǎng)基的擴散速率[11]。這種方法只能定性檢測細菌對抗生素的敏感性，無法得到MIC值。但是該方法簡便、可重復(fù)，無需昂貴的設(shè)備支持。

1.4濃度梯度法 Epsilometer testing即E-test，是檢測細菌對于某種抗生素的耐藥性的濃度梯度方法。E-test法使用一面是固定有一系列預(yù)先制備的、濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋的抗菌藥物；另一面是有濃度刻度的MIC值的塑料條。將條帶放置在預(yù)先接種的瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)，即可出現(xiàn)橢圓形抑制區(qū)，其抑制區(qū)與條帶邊緣之間的交點就是MIC。由于E-test條帶上的抗生素濃度梯度穩(wěn)定，所以該方法簡單、靈敏、準確，可以讀取具體的MIC值，但此方法較上述傳統(tǒng)方法使用較少[12]。

2 基于理化性質(zhì)及分子生物學(xué)技術(shù)的細菌耐藥性及耐藥基因檢測

隨著物理、化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了各類新型細菌耐藥性檢測技術(shù)，如流式細胞儀、質(zhì)譜儀和拉曼光譜儀等技術(shù)手段檢測細菌的耐藥性；或應(yīng)用免疫雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴增技術(shù)等檢測細菌的耐藥基因。此類基于細菌理化性質(zhì)和分子生物學(xué)技術(shù)的檢測方法，檢測時間在2～10 h，其省時快速、特異性強、靈敏度高的特點，適用于病原體臨床現(xiàn)場快速診斷。但相較于傳統(tǒng)方法，無法提供MIC值。部分技術(shù)如拉曼光譜尚未在臨床環(huán)境中得到充分探索，基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用存在一定差距。

2.1基于培養(yǎng)的微流控圖像檢測技術(shù) 微流控技術(shù)是一種以在微米尺度空間對流體進行樣品處理、反應(yīng)、檢測等復(fù)雜操作為主要特征的科學(xué)技術(shù)。在微流控檢測方面，Choi等[13]研究人員用瓊脂糖構(gòu)建了一個微流體瓊脂糖通道，通過顯微鏡觀察和追蹤通道內(nèi)單細菌在抗生素作用下的生長情況和表型，經(jīng)圖像對比確定細菌耐藥性和MIC值。微流控圖像檢測技術(shù)在單細胞水平上將細菌限制在很小的體積中，可以最大限度地減少交叉污染，潛在地加速生化反應(yīng)并使分離條件下標志物的濃度迅速增加。該技術(shù)的優(yōu)點在于所需樣本量少、靈敏度高，并提供自動化和高通量分析[14]。

2.2基于飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的檢測方法 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是當下物種鑒定較流行的方法。而MALDI Biotyper(MBT)是一種基于MALDI-TOF MS的微生物快速鑒定系統(tǒng)，可在幾分鐘內(nèi)對微生物進行無偏鑒定。MBT耐藥性檢測包括抗菌藥物耐藥性的選擇性檢測(MBT-STAR)、β-內(nèi)酰胺酶試驗(MBT-STAR-BL)、抗菌藥物敏感性快速檢測(MBT-ASTRA)和耐藥性檢測(MBT-RESIST)等方法。其中，MBT-STAR-BL原理是通過檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素被產(chǎn)酶菌株水解而引起的分子量變化從而確定菌株耐藥情況。配備MBT-STAR-BL模塊的MBT系統(tǒng)能夠同時快速鑒定細菌種類以及血液培養(yǎng)菌株的β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的耐藥性[15]；而MBT-ASTRA通過計算和生長在含有抗生素或不含抗生素的細菌光譜曲線下面積(area under the curve，AUC)并比較AUC大小以評估細菌生長，可在幾個小時內(nèi)檢測到敏感菌株和耐藥菌株之間的差異。最近一項研究優(yōu)化了MBT-ASTRA，已成功應(yīng)用于白念珠菌和光滑念珠菌等酵母菌的敏感性檢測[16]。MBT-RESIST基于非放射性同位素標記介質(zhì)，使細菌在含有12C或者13C碳組分的培養(yǎng)基中平行生長，并將含抗生素同位素標記的培養(yǎng)基中生長的細菌與在無抗生素標記的培養(yǎng)液中生長的細菌質(zhì)譜結(jié)果進行比較。耐藥細菌可以在含有13C的抗生素中生長，導(dǎo)致質(zhì)譜中峰向更高的m/z移動，進而通過峰位的移動來判定耐藥性。Sparbier等[17-18]通過13C標記的賴氨酸培養(yǎng)基來測試金黃色葡萄球菌對苯唑西林和頭孢西丁的耐藥性。MBT-RESIST和MBT-ASTRA理論上應(yīng)用于所有種類的抗生素和微生物，但仍存在微生物培養(yǎng)時間較長、需要摸索抗生素使用條件等缺點，需要進一步優(yōu)化。

2.3其他光譜學(xué)圖像檢測法 其他光譜學(xué)檢測方法包括了表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)、拉曼光譜等物理化學(xué)技術(shù)方法。其中拉曼光譜通過特定的光譜模式識別，可以快速、高效地識別細菌細胞和抗生素耐藥性。但通常臨床樣品中細菌濃度低，所以對臨床細菌病原體進行拉曼光譜的研究需要在瓊脂平板中培養(yǎng)[19]。相反的，表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)可以促進細菌病原體的無培養(yǎng)鑒定。最近一項研究中將SERS作為一種無創(chuàng)且無標記的方法，通過計算分析將碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌(carbapenem-susceptibleKlebsiellapneumoniae,CSKP)菌株與碳青霉烯類耐藥性肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)菌株區(qū)分開來，并成功地預(yù)測肺炎克雷伯菌的碳青霉烯類敏感性和耐藥性[20]。雖然拉曼光譜具有低成本、無標記和無損的特性，且具有區(qū)分細菌潛在感染的潛力，但是該技術(shù)尚未在臨床環(huán)境中得到充分探索，基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間仍然存在差距。

2.4其他物理、化學(xué)檢測法 主要包括流式細胞儀、耐藥菌微動量(micromotion)和微量熱法(microcalorimetry)等檢測方法。其中流式細胞儀是一種革命性的工具，可以從單個細菌細胞角度提供相關(guān)抗生素的耐藥性的檢測。最近一項研究將定量流式細胞儀和熒光插層儀相結(jié)合，在1 h內(nèi)可以檢測到臨床上重要的肺炎鏈球菌耐藥性，為進行快速AST提供了一種新途徑[21]。但是此類方法的局限性在于：基于流式細胞儀的AST研究集中于光散射特性、膜電位和膜滲透性的變化，這些參數(shù)是細菌活力的關(guān)鍵指標，但此類參數(shù)數(shù)據(jù)復(fù)雜、暫無臨床標準參考值，也缺乏系統(tǒng)的臨床研究來論證準確性[22]。

2.5基于熒光探針技術(shù)的檢測方法 此類方法基于DNA和RNA探針雜交技術(shù)，通過探針攜帶的熒光標簽檢測耐藥基因，包括經(jīng)典的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)。FISH是一種以定量方式可視化目標DNA的高度特異性方法，它根據(jù)堿基互補配對原則，通過特殊手段使帶有熒光物質(zhì)的探針與目標DNA接合，通過熒光顯微鏡直接觀察目標DNA所在位置。目前基于FISH技術(shù)已經(jīng)開發(fā)的檢測包括XpressFish、QuickFish、RASER-FISH、DVC-FISH等[23-25]。此外，研究人員針對活細菌細胞開發(fā)了rRNA探針檢測，rRNA探針技術(shù)可以更好地檢測活躍細胞的代謝、生長和耐藥性轉(zhuǎn)錄表達。美國Broad研究所開發(fā)的GoPhAST-R技術(shù)，通過RNA檢測以94%～99%的準確率對基因型和表型耐藥的細菌菌株進行分類，并且在數(shù)小時內(nèi)確定關(guān)鍵抗生素耐藥標記[26]。上述基于熒光探針技術(shù)檢測耐藥基因具有可視化、特異性強等優(yōu)點，但是此類探針無法檢出新的耐藥基因，對于具有突變位點的耐藥基因的檢測準確率也顯著降低。

2.6基于核酸擴增技術(shù)的檢測方法 基于核酸擴增技術(shù)的檢測方法包括聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等方法。其中以LAMP最為簡潔且應(yīng)用廣泛[27]。與常規(guī)PCR相比，LAMP無需模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。在等溫(60～65 ℃)條件下，進行核酸擴增1 h，即能達到檢測耐藥基因的目的。最近研究表明，LAMP已成功用于黏菌素耐藥基因mcr-3、β-內(nèi)酰胺酶基因blaAFM-1等檢測[28-29]。此外，研究人員基于LAMP還開發(fā)出smaRT-LAMP、RT-LAMP等技術(shù)和產(chǎn)品[30-31]。綜上所述，基于核酸擴增的檢測技術(shù)步驟簡單、省時且經(jīng)濟，適用于臨床細菌耐藥基因的快速診斷和篩查。

2.7基因芯片技術(shù)檢測 基因芯片又稱為DNA微陣列，是一種同時將大量探針固定于固相表面，核酸樣本經(jīng)熒光標記或擴增后，利用核酸雜交的特異性對大批量未知樣品進行檢測、分析的方法。2000年P(guān)erreten團隊開發(fā)出一種可以在1 h內(nèi)同時檢測革蘭陽性菌中90多種耐藥基因的基因芯片[32]。目前，基因芯片技術(shù)發(fā)展較為成熟，基于此類技術(shù)方法可以快速篩查臨床環(huán)境中病原菌及耐藥菌，從而為抗生素的選擇和使用提供參考?；蛐酒夹g(shù)具有高通量篩選耐藥基因的潛力，具有同時檢測數(shù)千個基因的特征優(yōu)勢，但其局限性在于表型和基因型標記之間的相關(guān)性差、無MIC值、無法檢測新的或非特征性的耐藥基因等。

3 基于高通量測序技術(shù)的細菌耐藥基因檢測

隨著測序技術(shù)的迭代更新和生物信息學(xué)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細菌耐藥檢測領(lǐng)域，包括WGS、mNGS和MscRNA-seq等技術(shù)。此類技術(shù)檢測時間通常在14～20 h，能夠提供細菌的耐藥基因型，發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因，以及獲得單個細菌細胞的耐藥基因轉(zhuǎn)錄情況。但此類技術(shù)實驗周期長，成本高，步驟復(fù)雜，缺乏標準化和自動化的分析流程，目前僅局限于臨床復(fù)雜疾病的病原體診斷篩查。

3.1WGS WGS是指獲得一個物種全基因序列的過程。在細菌耐藥性檢測領(lǐng)域，WGS可以提供細菌全面的耐藥基因譜，并通過耐藥基因預(yù)測其耐藥表型，揭示相關(guān)耐藥機制[33]。多項研究對WGS和表型AST檢測細菌耐藥性進行對比，結(jié)果呈高度一致性[34-35]，證明了通過WGS預(yù)測細菌耐藥性的準確性。此外，通過WGS鑒定耐藥細菌基因組中染色體和質(zhì)粒編碼的抗生素耐藥基因，有助于了解耐藥基因的移動和傳播背后的機制[30]，還可以對耐藥菌株的爆發(fā)流行進行監(jiān)控[36]。但是此類技術(shù)檢測周期較長，價格較貴，且樣本需要純細菌培養(yǎng)物，對臨床細菌的鑒定分離要求較高。

3.2mNGS mNGS是通過高通量測序技術(shù)檢測特定環(huán)境樣品中微生物群體的基因組信息。通過生物信息學(xué)分析方法進行病原體鑒定、微生物組分析、宿主相互作用分析和細菌耐藥性預(yù)測。在臨床細菌耐藥基因檢測中，mNGS能診斷未知病原體的感染，并挖掘其耐藥基因，為臨床合理使用抗生素提供參考?；趍NGS技術(shù)，Wang等[37]在1例免疫功能低下的重癥肺炎患者的培養(yǎng)陰性肺組織樣本中鑒定出肺炎克雷伯菌，并進一步鑒定出blaSHV-12、blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTX-M-65等抗性基因。此外，mNGS還可用于新型耐藥基因的檢測。Torres-Cortés等[38]通過mNGS技術(shù)，從土壤樣本中確定了11種新的抗生素耐藥基因，包括新型氨芐西林耐藥基因、慶大霉素耐藥基因、氯霉素耐藥基因和甲氧芐啶耐藥基因等。mNGS的優(yōu)點在于直接從原始樣本進行無偏檢測，在對現(xiàn)有耐藥基因篩查的基礎(chǔ)上挖掘新型耐藥基因。但是該技術(shù)成本高，步驟復(fù)雜，缺乏標準化和自動化的分析流程，對細菌耐藥基因的大規(guī)模篩查較為困難。

3.3MscRNA-seq 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(single-cell RNA sequencing，scRNA-seq)是指對單個細胞的轉(zhuǎn)錄組進行測序，從而獲得轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息，揭示細胞群差異和細胞進化關(guān)系[39]。MscRNA-seq是近年最新的檢測技術(shù)，其原理是將scRNA-seq應(yīng)用于單個微生物，如細菌細胞的轉(zhuǎn)錄組測序中。但是MscRNA-seq的發(fā)展受限于微生物mRNA含量低、部分細菌獨特的細胞壁和細胞膜以及mRNA無多聚腺苷酸化等原因，技術(shù)壁壘高，發(fā)展較為困難。美國華盛頓大學(xué)Georg Seelig研究團隊利用基于分割池連接的轉(zhuǎn)錄組測序(split-pool ligation-based transcriptome sequencing,SPLiT-seq)技術(shù)對細菌進行了微生物單細胞轉(zhuǎn)錄組microSPLiT測序(microbial split-pool ligation transcriptomics)，首次通過低成本、高通量的方法成功進行細菌單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序分析工作[40]。microSPLiT通過組合條形碼標記RNA的細菌細胞來源，一次實驗可分析數(shù)以萬計的細菌細胞。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MscRNA-seq技術(shù)克服了mRNA含量低、細胞多樣性和細胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜等困難，通過此類技術(shù)挖掘臨床超級細菌中耐藥基因的轉(zhuǎn)錄組，理解耐藥基因的表達、轉(zhuǎn)移等問題，對進一步檢測和篩查臨床多重耐藥性具有重要的應(yīng)用價值。

4 小結(jié)

本文總結(jié)了基于傳統(tǒng)經(jīng)典方法、分子生物學(xué)技術(shù)和高通量測序技術(shù)的細菌耐藥性檢測方法，三種檢測方法的比較見表1。傳統(tǒng)細菌耐藥性檢測方法能提供細菌耐藥的表型信息，但需要長時間的培養(yǎng)和鑒定，且無法檢測耐藥基因。以物理、化學(xué)和分子生物學(xué)方法為基礎(chǔ)的新技術(shù)，其細菌耐藥性檢測周期短、靈敏度高，但是無法檢測未知耐藥基因及突變基因。而基于高通量測序的檢測技術(shù)對經(jīng)典方法的表型檢測進行補充，可以準確鑒定細菌的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因及突變位點。筆者認為在未來細菌耐藥性的表型和基因型的綜合檢測，對于控制耐藥細菌感染及流行至關(guān)重要，也為相關(guān)感染性疾病的預(yù)防和監(jiān)測提供新的技術(shù)支持。

表1 細菌耐藥性及耐藥基因檢測技術(shù)的比較