王玉峰， 逄 宇

2019年全球約140萬人死于結(jié)核病(tuberculosis)，約1 000萬人發(fā)展為活動性結(jié)核病，其中約50萬活動性結(jié)核患者對利福平(rifampin，RIF)耐藥，100萬患者RIF敏感而異煙肼(isoniazid，INH)耐藥。因此，使用各種檢測工具迅速、準(zhǔn)確地檢測患者對這兩種藥物耐藥性，以盡快制定合適的治療方案至關(guān)重要[1]。傳統(tǒng)藥敏試驗受限于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，往往需要2～3個月才能獲得結(jié)果，無法滿足臨床對耐藥患者即時診斷的需求，也造成患者治療的延遲和潛在的耐藥結(jié)核傳播風(fēng)險。隨著快速診斷工具的發(fā)展，尤其對RIF耐藥性的分子生物學(xué)檢測有了顯著改善，且儀器設(shè)備要求低、操作簡便[2]。2012年，全球只有7%經(jīng)細菌學(xué)確診的結(jié)核病患者進行了RIF耐藥性檢測，而到2019年有近61%進行了檢測。但同期開始接受耐多藥或RIF耐藥結(jié)核病治療的人數(shù)從77 321例增加到177 099例，增加了近129%。因此，快速、準(zhǔn)確的耐藥性檢測在制定結(jié)核病治療方案時至關(guān)重要[1，3]。RIF耐藥性分子基礎(chǔ)主要是RIF耐藥決定區(qū)(rifampicin resistance-determining region，RRDR)的突變，其為一個81個堿基對片段[4]。發(fā)現(xiàn)并認(rèn)知此類耐藥性基因片段及新的分子工具的研究和開發(fā)，對于解決耐藥性檢測方案起到重要作用[5]。2020年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)建議對所有結(jié)核病患者的RIF和INH耐藥性進行常規(guī)檢測，而對耐多藥患者常規(guī)進行氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)耐藥性檢測[5]。目前對INH和FQs的耐藥機制研究比較清楚，且已有相應(yīng)耐藥性檢測的商品化分子生物學(xué)檢測工具[6]，但這些藥物的基因型藥敏檢測(drug-susceptibility testing，DST)的敏感度低于RIF的敏感度，因此需額外的表型DST來檢測基因型DST遺漏的耐藥性[5]。在結(jié)核病藥物研發(fā)長期停滯之后，多種新藥的陸續(xù)上市及現(xiàn)有抗菌藥物的再利用，使結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的治療方案有了巨大改進。隨著抗結(jié)核新藥和舊藥新用在耐藥結(jié)核病治療的推廣應(yīng)用，耐藥性也隨之增加，因此急需快速檢測患者的耐藥情況，以選擇合適的藥物組合方案。然而，目前對這些藥物耐藥的分子機制仍然知之甚少，由于耐藥菌株整體數(shù)量較少，部分耐藥相關(guān)基因突變位點及其與耐藥表型的相關(guān)性在不同研究得出的結(jié)果不盡相同[7]。對于這些新型耐藥相關(guān)基因突變位點與耐藥表型結(jié)果的解讀將提升分子診斷技術(shù)在耐藥結(jié)核中的應(yīng)用價值。近年來，測序技術(shù)發(fā)展迅速，二代及三代測序技術(shù)廣泛用于基因型DST，潛力巨大[7]。其中包括全基因組測序(whole-genome sequencing，WGS)，測序?qū)ο鬄榕囵B(yǎng)的臨床分離株，若直接對臨床樣本檢測，可對所有遺傳物質(zhì)進行測序，包括大量人類和其他共生生物的DNA?；诙鷾y序技術(shù)(next-generation sequencing technology，NGS)的基因型DST工具的開發(fā)和診斷效能評價，其主要限制是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、覆蓋全面的基因突變及其與耐藥性關(guān)聯(lián)的分類，可供診斷工具開發(fā)者及臨床檢測人員使用。關(guān)于基因組中不同藥物耐藥性決定區(qū)域的數(shù)量、鑒別和臨床解釋，隨著該領(lǐng)域研究在持續(xù)更新，但耐藥性決定區(qū)的暫時不確定性，限制針對該區(qū)域檢測工具的開發(fā)，尤其是對于新藥和舊藥新用的藥物[2，8]。因此，急需準(zhǔn)確、全面的結(jié)核分枝桿菌表型耐藥相關(guān)基因突變目錄，以區(qū)分臨床耐藥變異與耐藥無關(guān)變異。鑒此，WHO在2021年出版了《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄及其臨床應(yīng)用指南》(以下簡稱《指南》)，以推進新藥的基因型DST、表型DST、測序數(shù)據(jù)相互識別，并更好地理解與耐藥表型相關(guān)的突變?！吨改稀坊谝寻l(fā)表的數(shù)據(jù)，對迄今為止最大的多國結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)分離株(>38 000)的WGS和表型數(shù)據(jù)進行分析，用于從遺傳數(shù)據(jù)預(yù)測臨床相關(guān)耐藥表型。該突變目錄解釋所有一線藥物[RIF、INH、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)]以及二線藥物[左氧氟沙星(levofloxacin，LFX)、莫西沙星(moxifloxacin，MFX)、貝達喹林(bedaquiline，BDQ)和利奈唑胺(linezolid，LZD)]、B組藥物[氯法齊明(clofazimine，CFZ)]、C組藥物[德拉馬尼(delamanid，DLM)、阿米卡星(amikacin，AMK)、鏈霉素(streptomycin，STM)、乙硫異煙胺(ethionamide，ETO)和丙硫異煙胺(protionamide，PTO)]的耐藥性提供了常見的標(biāo)準(zhǔn)化參考。

1 高質(zhì)量的表型藥敏和基因序列數(shù)據(jù)是納入《指南》研究的首要因素

1.1表型藥敏試驗方法及基因測序結(jié)果解讀注意事項 創(chuàng)建結(jié)核耐藥基因突變目錄的基礎(chǔ)為收集的數(shù)據(jù)，包括表型DST和培養(yǎng)的MTBC分離株的WGS，以下四個主要目錄組成要素至關(guān)重要：

1.1.1 高質(zhì)量表型DST 確保采用最佳表型DST結(jié)果作為參考，由于結(jié)核桿菌表型DST方法優(yōu)劣及臨界濃度(critical concentrations，CCs)可能隨時間不斷變化。因此，對于具有多重表型DST結(jié)果的MTBC分離株，優(yōu)選當(dāng)前WHO推薦的表型DST方法，之前或非WHO推薦方法次之。新藥及舊藥新用類藥物使用微量肉湯稀釋法(broth microdilution，BMD)DST檢測數(shù)據(jù)較多，但WHO尚未推薦此方法及相應(yīng)解釋標(biāo)準(zhǔn)，因此，該方法僅能“暫定”用于基因突變與表型耐藥關(guān)聯(lián)?；谝陨媳硇虳ST在應(yīng)用方面存在多種情況，兼顧WHO推薦的表型DST方法及文獻發(fā)表的數(shù)據(jù)，將表型DST結(jié)果的可信度類別分為4類(由《指南》自行定義，第1類為WHO當(dāng)前推薦的表型DST方法，第2類方法為WHO當(dāng)前和之前推薦的表型DST方法，第3類指其他表型DST方法，主要為BMD法，第4類為1～3類之外的其他表型DST方法)，第1類(WHO當(dāng)前推薦)、第1和第2類(WHO當(dāng)前和之前推薦)和第1、第2及第3類(幾乎所有方法)的表型DST數(shù)據(jù)進行了單獨的關(guān)聯(lián)分析[4，9-10]。見表1。許多MTBC分離株采用一種以上的DST方法獲得表型DST結(jié)果，在這些情況下，需制定一個表型DST優(yōu)先選擇的順序，只包括WHO最近推薦的表型DST數(shù)據(jù)。當(dāng)用同一分離株的一種藥物的不同方法獲得的表型DST結(jié)果都可用時，使用以下優(yōu)選規(guī)則：(1)1類>2類>3類。(2)在同一類別中，固體培養(yǎng)基法結(jié)果優(yōu)于液體培養(yǎng)基法結(jié)果，液體培養(yǎng)基更容易錯過關(guān)鍵的、臨床相關(guān)的rpoB突變[11]。(3)在同一類別的液體方法中，分枝桿菌生長培養(yǎng)系統(tǒng)(BACTECTMMycobacterial Growth Indicator TubeTM960，MGIT)>顯微鏡觀察下耐藥檢測方法(microscopic observation drug-susceptibility assay，MODS)>BACTECTM460>CRyPTIC，但BACTECTM460不再使用，而MGIT比MODS有更多的試驗進行了驗證[12-13]。此類優(yōu)先選擇規(guī)則僅對同一菌株使用同一類別的表型DST方法檢測結(jié)果可信度進行判斷時適用，可獲得標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)類型。

表1 四種不同可信度類別初步判定依據(jù)

1.1.2 高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的WGS，用于生成無偏倚的原始序列數(shù)據(jù) 本次分析僅包括使用Illumina儀器生成的WGS數(shù)據(jù)。該平臺是目前使用最廣泛的，并可提供標(biāo)準(zhǔn)化測序數(shù)據(jù)，且以原始測序讀取數(shù)據(jù)的輸出文件作為生物信息學(xué)分析的起點。

1.1.3 用于變異檢測和注釋的標(biāo)準(zhǔn)化生物信息學(xué)通路 為了確保在所有數(shù)據(jù)源中統(tǒng)一識別突變，使用標(biāo)準(zhǔn)化的生物信息通路去除非結(jié)核的數(shù)據(jù)，通過質(zhì)量檢查處理數(shù)據(jù)，將讀取數(shù)據(jù)與H37Rv參考基因組對比，最后識別突變。該通路的設(shè)計目的是最大限度地檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)和插入/缺失的變異檢測，在此階段可排除<90%主要變異的耐藥分離株。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)化的、有效的方法識別與耐藥性表型相關(guān)的變異 對匹配的表型和基因型數(shù)據(jù)進行算法處理，以識別基因單突變，該突變可清楚地解釋觀察到的耐藥表型。然后對所有突變和表型的最終數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計評估，確定該變異與耐藥性的相關(guān)性的比值比(odds ratio，OR)和陽性預(yù)測值。

1.2不同抗結(jié)核藥物表型DST結(jié)果展示 每個分離株的表型DST結(jié)果數(shù)量不同，其中4種一線藥物(RIF、INH、EMB和PZA)的結(jié)果最常見(見表2)。表中ALL數(shù)據(jù)集包括基于WHO認(rèn)可的方法(WHO數(shù)據(jù)集)和未經(jīng)WHO認(rèn)可方法的表型DST，后者以BDQ、CFZ、DLM和LZD為主，但對此類新藥或者舊藥新用藥物的耐藥率≤1.2%。除BDQ和DLM外，所有藥物的ALL數(shù)據(jù)集中的分離株均超過1萬株，部分藥物的分離株超過3萬株。對RIF和INH的耐藥率為24%～36%，而FQs為14%～20%，這個比率取決于藥物種類和數(shù)據(jù)來源。有超過15 000株分離株評估PZA的耐藥性，其中14.6%通過WHO認(rèn)可的方法具有耐藥性。WHO數(shù)據(jù)集中的耐藥率從CFZ的0.6%到ETO的40.5%。而在ALL數(shù)據(jù)集中耐藥率范圍從BDQ的0.9%到INH的35.4%。

表2 按照藥物種類和收集數(shù)據(jù)來源的表型DST結(jié)果匯總

續(xù)表2

2 基于循證醫(yī)學(xué)建立的結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄

對收集的所有MTBC分離株同時具有WGS數(shù)據(jù)和表型DST結(jié)果進行了分析。不同藥物的突變基因預(yù)測表型DST結(jié)果，用敏感度、特異度和陽性預(yù)測值三個指標(biāo)進行區(qū)分(見表3)。三種指標(biāo)通過關(guān)聯(lián)水平(組1為耐藥性相關(guān)，組2為暫定耐藥性相關(guān))以及綜合評價來表示，闡明不同基因突變對表型DST耐藥相關(guān)性的貢獻。預(yù)測表型DST耐藥結(jié)果的突變可能不夠全面準(zhǔn)確，因為參考標(biāo)準(zhǔn)不完善、藥物關(guān)鍵濃度隨著時間的變化、從數(shù)百個不同實驗室收集的表型DST數(shù)據(jù)時可能存在的一些問題。此外，KAN和CAP僅供參考，此類藥物不再被推薦用于抗結(jié)核治療。對于大多數(shù)藥物來說，組1和組2的突變組合的敏感度≥75%，特異度≥95%。組1中24個耐RIF突變的敏感度為92.3%，陽性預(yù)測值為95.6%，而組1中5個突變對INH的聯(lián)合敏感度為90.0%，陽性預(yù)測值為97.1%。組1中9個突變對MFX的敏感度為87.3%，14個突變對EMB的敏感度為86.3%。ALL數(shù)據(jù)集中很少有分離株對新藥和舊藥新用藥物有耐藥性，對這些藥物的耐藥性關(guān)聯(lián)還不明確。其中一些藥物的特異度低于預(yù)期，可能因表型參考或所使用的解釋標(biāo)準(zhǔn)有差異。組2中基因突變對大多數(shù)藥物的預(yù)測性能沒有較大影響，但使與PZA和ETO耐藥相關(guān)基因檢測的敏感度分別從56.8%、47.2%上升到72.3%、75.7%(為組1和組2耐藥相關(guān)基因檢測綜合敏感度)。耐藥性產(chǎn)生通常僅與幾個關(guān)鍵的突變相關(guān)，這一嘗試促進了快速核酸擴增檢測的發(fā)展，顯然，全面的分子DST-WGS將成為一種理想的新方法，可以覆蓋更多的基因。此外，盡管每個突變可能并不總是能導(dǎo)致表型DST結(jié)果為耐藥性，但多個突變的累積效應(yīng)可能會產(chǎn)生耐藥情況。隨著更多的數(shù)據(jù)和證據(jù)的驗證，預(yù)計一些與暫定耐藥性相關(guān)的突變可能會轉(zhuǎn)移到第1組，一些意義不確定的突變可能被發(fā)現(xiàn)與耐藥性或者暫時耐藥性有關(guān)，推動該領(lǐng)域進一步發(fā)展。

表3 基于ALL數(shù)據(jù)集不同基因突變預(yù)測表型DST耐藥性結(jié)果的敏感度、特異度和陽性預(yù)測值

續(xù)表3

3 未來基因突變目錄的更新與修訂注意事項

3.1分析的數(shù)據(jù)類型 (1)當(dāng)前治療指南表明，耐INH和MFX水平顯著影響治療效果，例如高劑量INH可能用于單獨INH低水平耐藥治療，高水平耐藥突變的MFX不能使用高劑量MFX治療[5]。(2)應(yīng)評估所使用藥物的有效性，特別是當(dāng)抗生素的劑量發(fā)生改變[4]。(3)一些突變僅導(dǎo)致最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值的適度增加，使用可信度類別表型DST進行分類時比較困難，理想情況下，應(yīng)該分析個體突變模式，像歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會所定義的“技術(shù)不確定性領(lǐng)域”的突變類型，以盡量減少主要表型DST結(jié)果錯誤[4，14-15]。(4)收集更大量、更合適的數(shù)據(jù)，盡量收集準(zhǔn)確測試方法和合理結(jié)果解釋的基因型數(shù)據(jù)，例如特定rrl突變導(dǎo)致LZD耐藥[7，16-17]。rpoB T427A雖然在RRDR中，但可能不產(chǎn)生RIF抗性[18]。

3.2分級標(biāo)準(zhǔn) (1)鑒于幾個關(guān)鍵藥物(如BDQ和DLM)的耐藥基因與表型DST結(jié)果數(shù)據(jù)極少，放寬分級標(biāo)準(zhǔn)和(或)根據(jù)新的專家規(guī)則進行分類，類似用于PZA和pncA耐藥性分析[7]。(2)需用其他方法來對補償機制進行分類。(3)基因的選擇和相應(yīng)的調(diào)控區(qū)域必須根據(jù)最新的科學(xué)證據(jù)進行修改。例如，Rv1979c在CFZ和BDQ耐藥性中的作用就受到了質(zhì)疑[7-8]。(4)同義突變與耐藥性無關(guān)，除非如終止起始密碼子發(fā)生在fabG1或Rv3793中，需進行核查并根據(jù)研究結(jié)果，在以后的修訂版中可能會進行不同的處理[19-20]，類似于核苷酸變化但未導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變的情況[16]。

3.3生物信息學(xué)路徑 (1)應(yīng)評估和研究具有不同耐藥性等位基因的分離株。(2)在當(dāng)前的算法中沒有識別出較大的插入序列，這導(dǎo)致一些突變錯誤地出現(xiàn)為單突變，如ahpC啟動子突變(如C-57T突變)，同樣在目前的分析中沒有考慮到終止密碼子的消除。(3)探索數(shù)據(jù)篩選失敗的確切影響因素和對分析結(jié)果影響的程度。

3.4如果發(fā)現(xiàn)耐藥性標(biāo)記，應(yīng)進行確認(rèn)試驗 (1)考慮表型DST的重現(xiàn)性、所使用的臨界點的準(zhǔn)確性和耐藥率。(2)一個突變是否導(dǎo)致MIC值接近臨界點。(3)根據(jù)專家共識或WHO之前對某些突變進行分類，這可能是不正確的。例如，在ethA、gid、katG或pncA的實際終止密碼子之前的一個密碼子的無義突變不太可能產(chǎn)生耐藥性，這些例外可以通過實驗或結(jié)構(gòu)建模來確定[21]。

4 展望

基于分子診斷技術(shù)的耐藥結(jié)核病早期診斷對于有效控制結(jié)核病具有重要的意義。傳統(tǒng)基于分子信標(biāo)、反向雜交、熔解曲線等鑒定耐藥突變位點的分子診斷技術(shù)，通過對耐藥的高頻位點進行檢測實現(xiàn)了對RIF、INH、FQs耐藥性的精準(zhǔn)早期檢測，目前在臨床中發(fā)揮了重要的作用[22]。近年來，隨著測序技術(shù)的普及，臨床可以在1～2 d內(nèi)獲得覆蓋位點更廣泛、涵蓋藥物種類更多的耐藥相關(guān)基因序列信息，《指南》為高通量多靶點耐藥結(jié)核檢測方法的臨床應(yīng)用提供了重要的數(shù)據(jù)解讀依據(jù)，但是《指南》在制定規(guī)程中還存在一定的不足：首先，表型DST是《指南》的分析基礎(chǔ)，盡管《指南》對表型DST結(jié)果進行了優(yōu)先等級劃分，但是部分藥物缺乏有效的關(guān)鍵濃度是制約后續(xù)分析的關(guān)鍵因素；特別是MFX，在2014—2018年，MFX以2.0 mg/L作為關(guān)鍵濃度，而后其降低到0.5 mg/L，關(guān)鍵濃度的異質(zhì)性將極大地影響對耐藥突變結(jié)果的解讀[10，23]。其次，對于不同突變位點對耐藥的影響，《指南》提供了不同程度的可信度推薦，而這正是基于對于既往文獻數(shù)據(jù)的匯總。因此，部分罕見位點即便是引起高水平耐藥，但是由于證據(jù)較少，在推薦等級上也偏低。此外，部分抗結(jié)核新藥耐藥菌株較少，也造成其耐藥突變分析的難度，因此亟待擴充針對罕見突變以及抗結(jié)核新藥的耐藥突變的全球數(shù)據(jù)，以完善《指南》。再次，《指南》獲取的分子數(shù)據(jù)基于WGS的結(jié)果，由于研究成本原因，上述數(shù)據(jù)主要來自于結(jié)核病低負擔(dān)國家，而不同國家流行的優(yōu)勢結(jié)核分枝桿菌譜系存在顯著差異，提高菌株的代表性以覆蓋結(jié)核病高負擔(dān)國家的優(yōu)勢譜系將是值得重點關(guān)注的方向。未來應(yīng)該聚焦于采集更多的關(guān)于新藥及舊藥新用藥物的表型耐藥信息，并開展體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)篩選試驗。今后的分析應(yīng)該聚焦于結(jié)合MIC揭示單個突變間的以及幾組突變間的關(guān)聯(lián)。這樣的數(shù)據(jù)將有助于分子診斷技術(shù)指導(dǎo)個性化的單個藥物劑量制定。WHO計劃對本分類定期修訂，并嘗試著將這些科研進展促進公共衛(wèi)生應(yīng)對舉措并填補其空白。