王玉峰, 逄 宇
2019年全球約140萬人死于結(jié)核病(tuberculosis),約1 000萬人發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病,其中約50萬活動(dòng)性結(jié)核患者對(duì)利福平(rifampin,RIF)耐藥,100萬患者RIF敏感而異煙肼(isoniazid,INH)耐藥。因此,使用各種檢測(cè)工具迅速、準(zhǔn)確地檢測(cè)患者對(duì)這兩種藥物耐藥性,以盡快制定合適的治療方案至關(guān)重要[1]。傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)受限于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢,往往需要2~3個(gè)月才能獲得結(jié)果,無法滿足臨床對(duì)耐藥患者即時(shí)診斷的需求,也造成患者治療的延遲和潛在的耐藥結(jié)核傳播風(fēng)險(xiǎn)。隨著快速診斷工具的發(fā)展,尤其對(duì)RIF耐藥性的分子生物學(xué)檢測(cè)有了顯著改善,且儀器設(shè)備要求低、操作簡(jiǎn)便[2]。2012年,全球只有7%經(jīng)細(xì)菌學(xué)確診的結(jié)核病患者進(jìn)行了RIF耐藥性檢測(cè),而到2019年有近61%進(jìn)行了檢測(cè)。但同期開始接受耐多藥或RIF耐藥結(jié)核病治療的人數(shù)從77 321例增加到177 099例,增加了近129%。因此,快速、準(zhǔn)確的耐藥性檢測(cè)在制定結(jié)核病治療方案時(shí)至關(guān)重要[1,3]。RIF耐藥性分子基礎(chǔ)主要是RIF耐藥決定區(qū)(rifampicin resistance-determining region,RRDR)的突變,其為一個(gè)81個(gè)堿基對(duì)片段[4]。發(fā)現(xiàn)并認(rèn)知此類耐藥性基因片段及新的分子工具的研究和開發(fā),對(duì)于解決耐藥性檢測(cè)方案起到重要作用[5]。2020年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)建議對(duì)所有結(jié)核病患者的RIF和INH耐藥性進(jìn)行常規(guī)檢測(cè),而對(duì)耐多藥患者常規(guī)進(jìn)行氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones,F(xiàn)Qs)耐藥性檢測(cè)[5]。目前對(duì)INH和FQs的耐藥機(jī)制研究比較清楚,且已有相應(yīng)耐藥性檢測(cè)的商品化分子生物學(xué)檢測(cè)工具[6],但這些藥物的基因型藥敏檢測(cè)(drug-susceptibility testing,DST)的敏感度低于RIF的敏感度,因此需額外的表型DST來檢測(cè)基因型DST遺漏的耐藥性[5]。在結(jié)核病藥物研發(fā)長(zhǎng)期停滯之后,多種新藥的陸續(xù)上市及現(xiàn)有抗菌藥物的再利用,使結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的治療方案有了巨大改進(jìn)。隨著抗結(jié)核新藥和舊藥新用在耐藥結(jié)核病治療的推廣應(yīng)用,耐藥性也隨之增加,因此急需快速檢測(cè)患者的耐藥情況,以選擇合適的藥物組合方案。然而,目前對(duì)這些藥物耐藥的分子機(jī)制仍然知之甚少,由于耐藥菌株整體數(shù)量較少,部分耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)及其與耐藥表型的相關(guān)性在不同研究得出的結(jié)果不盡相同[7]。對(duì)于這些新型耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)與耐藥表型結(jié)果的解讀將提升分子診斷技術(shù)在耐藥結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值。近年來,測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速,二代及三代測(cè)序技術(shù)廣泛用于基因型DST,潛力巨大[7]。其中包括全基因組測(cè)序(whole-genome sequencing,WGS),測(cè)序?qū)ο鬄榕囵B(yǎng)的臨床分離株,若直接對(duì)臨床樣本檢測(cè),可對(duì)所有遺傳物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序,包括大量人類和其他共生生物的DNA。基于二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing technology,NGS)的基因型DST工具的開發(fā)和診斷效能評(píng)價(jià),其主要限制是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、覆蓋全面的基因突變及其與耐藥性關(guān)聯(lián)的分類,可供診斷工具開發(fā)者及臨床檢測(cè)人員使用。關(guān)于基因組中不同藥物耐藥性決定區(qū)域的數(shù)量、鑒別和臨床解釋,隨著該領(lǐng)域研究在持續(xù)更新,但耐藥性決定區(qū)的暫時(shí)不確定性,限制針對(duì)該區(qū)域檢測(cè)工具的開發(fā),尤其是對(duì)于新藥和舊藥新用的藥物[2,8]。因此,急需準(zhǔn)確、全面的結(jié)核分枝桿菌表型耐藥相關(guān)基因突變目錄,以區(qū)分臨床耐藥變異與耐藥無關(guān)變異。鑒此,WHO在2021年出版了《結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變目錄及其臨床應(yīng)用指南》(以下簡(jiǎn)稱《指南》),以推進(jìn)新藥的基因型DST、表型DST、測(cè)序數(shù)據(jù)相互識(shí)別,并更好地理解與耐藥表型相關(guān)的突變。《指南》基于已發(fā)表的數(shù)據(jù),對(duì)迄今為止最大的多國(guó)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)分離株(>38 000)的WGS和表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,用于從遺傳數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)臨床相關(guān)耐藥表型。該突變目錄解釋所有一線藥物[RIF、INH、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)]以及二線藥物[左氧氟沙星(levofloxacin,LFX)、莫西沙星(moxifloxacin,MFX)、貝達(dá)喹林(bedaquiline,BDQ)和利奈唑胺(linezolid,LZD)]、B組藥物[氯法齊明(clofazimine,CFZ)]、C組藥物[德拉馬尼(delamanid,DLM)、阿米卡星(amikacin,AMK)、鏈霉素(streptomycin,STM)、乙硫異煙胺(ethionamide,ETO)和丙硫異煙胺(protionamide,PTO)]的耐藥性提供了常見的標(biāo)準(zhǔn)化參考。
1.1表型藥敏試驗(yàn)方法及基因測(cè)序結(jié)果解讀注意事項(xiàng) 創(chuàng)建結(jié)核耐藥基因突變目錄的基礎(chǔ)為收集的數(shù)據(jù),包括表型DST和培養(yǎng)的MTBC分離株的WGS,以下四個(gè)主要目錄組成要素至關(guān)重要:
1.1.1 高質(zhì)量表型DST 確保采用最佳表型DST結(jié)果作為參考,由于結(jié)核桿菌表型DST方法優(yōu)劣及臨界濃度(critical concentrations,CCs)可能隨時(shí)間不斷變化。因此,對(duì)于具有多重表型DST結(jié)果的MTBC分離株,優(yōu)選當(dāng)前WHO推薦的表型DST方法,之前或非WHO推薦方法次之。新藥及舊藥新用類藥物使用微量肉湯稀釋法(broth microdilution,BMD)DST檢測(cè)數(shù)據(jù)較多,但WHO尚未推薦此方法及相應(yīng)解釋標(biāo)準(zhǔn),因此,該方法僅能“暫定”用于基因突變與表型耐藥關(guān)聯(lián)?;谝陨媳硇虳ST在應(yīng)用方面存在多種情況,兼顧WHO推薦的表型DST方法及文獻(xiàn)發(fā)表的數(shù)據(jù),將表型DST結(jié)果的可信度類別分為4類(由《指南》自行定義,第1類為WHO當(dāng)前推薦的表型DST方法,第2類方法為WHO當(dāng)前和之前推薦的表型DST方法,第3類指其他表型DST方法,主要為BMD法,第4類為1~3類之外的其他表型DST方法),第1類(WHO當(dāng)前推薦)、第1和第2類(WHO當(dāng)前和之前推薦)和第1、第2及第3類(幾乎所有方法)的表型DST數(shù)據(jù)進(jìn)行了單獨(dú)的關(guān)聯(lián)分析[4,9-10]。見表1。許多MTBC分離株采用一種以上的DST方法獲得表型DST結(jié)果,在這些情況下,需制定一個(gè)表型DST優(yōu)先選擇的順序,只包括WHO最近推薦的表型DST數(shù)據(jù)。當(dāng)用同一分離株的一種藥物的不同方法獲得的表型DST結(jié)果都可用時(shí),使用以下優(yōu)選規(guī)則:(1)1類>2類>3類。(2)在同一類別中,固體培養(yǎng)基法結(jié)果優(yōu)于液體培養(yǎng)基法結(jié)果,液體培養(yǎng)基更容易錯(cuò)過關(guān)鍵的、臨床相關(guān)的rpoB突變[11]。(3)在同一類別的液體方法中,分枝桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)(BACTECTMMycobacterial Growth Indicator TubeTM960,MGIT)>顯微鏡觀察下耐藥檢測(cè)方法(microscopic observation drug-susceptibility assay,MODS)>BACTECTM460>CRyPTIC,但BACTECTM460不再使用,而MGIT比MODS有更多的試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證[12-13]。此類優(yōu)先選擇規(guī)則僅對(duì)同一菌株使用同一類別的表型DST方法檢測(cè)結(jié)果可信度進(jìn)行判斷時(shí)適用,可獲得標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)類型。
表1 四種不同可信度類別初步判定依據(jù)
1.1.2 高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的WGS,用于生成無偏倚的原始序列數(shù)據(jù) 本次分析僅包括使用Illumina儀器生成的WGS數(shù)據(jù)。該平臺(tái)是目前使用最廣泛的,并可提供標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)序數(shù)據(jù),且以原始測(cè)序讀取數(shù)據(jù)的輸出文件作為生物信息學(xué)分析的起點(diǎn)。
1.1.3 用于變異檢測(cè)和注釋的標(biāo)準(zhǔn)化生物信息學(xué)通路 為了確保在所有數(shù)據(jù)源中統(tǒng)一識(shí)別突變,使用標(biāo)準(zhǔn)化的生物信息通路去除非結(jié)核的數(shù)據(jù),通過質(zhì)量檢查處理數(shù)據(jù),將讀取數(shù)據(jù)與H37Rv參考基因組對(duì)比,最后識(shí)別突變。該通路的設(shè)計(jì)目的是最大限度地檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和插入/缺失的變異檢測(cè),在此階段可排除<90%主要變異的耐藥分離株。
1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)化的、有效的方法識(shí)別與耐藥性表型相關(guān)的變異 對(duì)匹配的表型和基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行算法處理,以識(shí)別基因單突變,該突變可清楚地解釋觀察到的耐藥表型。然后對(duì)所有突變和表型的最終數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估,確定該變異與耐藥性的相關(guān)性的比值比(odds ratio,OR)和陽性預(yù)測(cè)值。
1.2不同抗結(jié)核藥物表型DST結(jié)果展示 每個(gè)分離株的表型DST結(jié)果數(shù)量不同,其中4種一線藥物(RIF、INH、EMB和PZA)的結(jié)果最常見(見表2)。表中ALL數(shù)據(jù)集包括基于WHO認(rèn)可的方法(WHO數(shù)據(jù)集)和未經(jīng)WHO認(rèn)可方法的表型DST,后者以BDQ、CFZ、DLM和LZD為主,但對(duì)此類新藥或者舊藥新用藥物的耐藥率≤1.2%。除BDQ和DLM外,所有藥物的ALL數(shù)據(jù)集中的分離株均超過1萬株,部分藥物的分離株超過3萬株。對(duì)RIF和INH的耐藥率為24%~36%,而FQs為14%~20%,這個(gè)比率取決于藥物種類和數(shù)據(jù)來源。有超過15 000株分離株評(píng)估PZA的耐藥性,其中14.6%通過WHO認(rèn)可的方法具有耐藥性。WHO數(shù)據(jù)集中的耐藥率從CFZ的0.6%到ETO的40.5%。而在ALL數(shù)據(jù)集中耐藥率范圍從BDQ的0.9%到INH的35.4%。
表2 按照藥物種類和收集數(shù)據(jù)來源的表型DST結(jié)果匯總
續(xù)表2
對(duì)收集的所有MTBC分離株同時(shí)具有WGS數(shù)據(jù)和表型DST結(jié)果進(jìn)行了分析。不同藥物的突變基因預(yù)測(cè)表型DST結(jié)果,用敏感度、特異度和陽性預(yù)測(cè)值三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行區(qū)分(見表3)。三種指標(biāo)通過關(guān)聯(lián)水平(組1為耐藥性相關(guān),組2為暫定耐藥性相關(guān))以及綜合評(píng)價(jià)來表示,闡明不同基因突變對(duì)表型DST耐藥相關(guān)性的貢獻(xiàn)。預(yù)測(cè)表型DST耐藥結(jié)果的突變可能不夠全面準(zhǔn)確,因?yàn)閰⒖紭?biāo)準(zhǔn)不完善、藥物關(guān)鍵濃度隨著時(shí)間的變化、從數(shù)百個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室收集的表型DST數(shù)據(jù)時(shí)可能存在的一些問題。此外,KAN和CAP僅供參考,此類藥物不再被推薦用于抗結(jié)核治療。對(duì)于大多數(shù)藥物來說,組1和組2的突變組合的敏感度≥75%,特異度≥95%。組1中24個(gè)耐RIF突變的敏感度為92.3%,陽性預(yù)測(cè)值為95.6%,而組1中5個(gè)突變對(duì)INH的聯(lián)合敏感度為90.0%,陽性預(yù)測(cè)值為97.1%。組1中9個(gè)突變對(duì)MFX的敏感度為87.3%,14個(gè)突變對(duì)EMB的敏感度為86.3%。ALL數(shù)據(jù)集中很少有分離株對(duì)新藥和舊藥新用藥物有耐藥性,對(duì)這些藥物的耐藥性關(guān)聯(lián)還不明確。其中一些藥物的特異度低于預(yù)期,可能因表型參考或所使用的解釋標(biāo)準(zhǔn)有差異。組2中基因突變對(duì)大多數(shù)藥物的預(yù)測(cè)性能沒有較大影響,但使與PZA和ETO耐藥相關(guān)基因檢測(cè)的敏感度分別從56.8%、47.2%上升到72.3%、75.7%(為組1和組2耐藥相關(guān)基因檢測(cè)綜合敏感度)。耐藥性產(chǎn)生通常僅與幾個(gè)關(guān)鍵的突變相關(guān),這一嘗試促進(jìn)了快速核酸擴(kuò)增檢測(cè)的發(fā)展,顯然,全面的分子DST-WGS將成為一種理想的新方法,可以覆蓋更多的基因。此外,盡管每個(gè)突變可能并不總是能導(dǎo)致表型DST結(jié)果為耐藥性,但多個(gè)突變的累積效應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生耐藥情況。隨著更多的數(shù)據(jù)和證據(jù)的驗(yàn)證,預(yù)計(jì)一些與暫定耐藥性相關(guān)的突變可能會(huì)轉(zhuǎn)移到第1組,一些意義不確定的突變可能被發(fā)現(xiàn)與耐藥性或者暫時(shí)耐藥性有關(guān),推動(dòng)該領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展。
表3 基于ALL數(shù)據(jù)集不同基因突變預(yù)測(cè)表型DST耐藥性結(jié)果的敏感度、特異度和陽性預(yù)測(cè)值
續(xù)表3
3.1分析的數(shù)據(jù)類型 (1)當(dāng)前治療指南表明,耐INH和MFX水平顯著影響治療效果,例如高劑量INH可能用于單獨(dú)INH低水平耐藥治療,高水平耐藥突變的MFX不能使用高劑量MFX治療[5]。(2)應(yīng)評(píng)估所使用藥物的有效性,特別是當(dāng)抗生素的劑量發(fā)生改變[4]。(3)一些突變僅導(dǎo)致最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值的適度增加,使用可信度類別表型DST進(jìn)行分類時(shí)比較困難,理想情況下,應(yīng)該分析個(gè)體突變模式,像歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)所定義的“技術(shù)不確定性領(lǐng)域”的突變類型,以盡量減少主要表型DST結(jié)果錯(cuò)誤[4,14-15]。(4)收集更大量、更合適的數(shù)據(jù),盡量收集準(zhǔn)確測(cè)試方法和合理結(jié)果解釋的基因型數(shù)據(jù),例如特定rrl突變導(dǎo)致LZD耐藥[7,16-17]。rpoB T427A雖然在RRDR中,但可能不產(chǎn)生RIF抗性[18]。
3.2分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) (1)鑒于幾個(gè)關(guān)鍵藥物(如BDQ和DLM)的耐藥基因與表型DST結(jié)果數(shù)據(jù)極少,放寬分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和(或)根據(jù)新的專家規(guī)則進(jìn)行分類,類似用于PZA和pncA耐藥性分析[7]。(2)需用其他方法來對(duì)補(bǔ)償機(jī)制進(jìn)行分類。(3)基因的選擇和相應(yīng)的調(diào)控區(qū)域必須根據(jù)最新的科學(xué)證據(jù)進(jìn)行修改。例如,Rv1979c在CFZ和BDQ耐藥性中的作用就受到了質(zhì)疑[7-8]。(4)同義突變與耐藥性無關(guān),除非如終止起始密碼子發(fā)生在fabG1或Rv3793中,需進(jìn)行核查并根據(jù)研究結(jié)果,在以后的修訂版中可能會(huì)進(jìn)行不同的處理[19-20],類似于核苷酸變化但未導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變的情況[16]。
3.3生物信息學(xué)路徑 (1)應(yīng)評(píng)估和研究具有不同耐藥性等位基因的分離株。(2)在當(dāng)前的算法中沒有識(shí)別出較大的插入序列,這導(dǎo)致一些突變錯(cuò)誤地出現(xiàn)為單突變,如ahpC啟動(dòng)子突變(如C-57T突變),同樣在目前的分析中沒有考慮到終止密碼子的消除。(3)探索數(shù)據(jù)篩選失敗的確切影響因素和對(duì)分析結(jié)果影響的程度。
3.4如果發(fā)現(xiàn)耐藥性標(biāo)記,應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn) (1)考慮表型DST的重現(xiàn)性、所使用的臨界點(diǎn)的準(zhǔn)確性和耐藥率。(2)一個(gè)突變是否導(dǎo)致MIC值接近臨界點(diǎn)。(3)根據(jù)專家共識(shí)或WHO之前對(duì)某些突變進(jìn)行分類,這可能是不正確的。例如,在ethA、gid、katG或pncA的實(shí)際終止密碼子之前的一個(gè)密碼子的無義突變不太可能產(chǎn)生耐藥性,這些例外可以通過實(shí)驗(yàn)或結(jié)構(gòu)建模來確定[21]。
基于分子診斷技術(shù)的耐藥結(jié)核病早期診斷對(duì)于有效控制結(jié)核病具有重要的意義。傳統(tǒng)基于分子信標(biāo)、反向雜交、熔解曲線等鑒定耐藥突變位點(diǎn)的分子診斷技術(shù),通過對(duì)耐藥的高頻位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了對(duì)RIF、INH、FQs耐藥性的精準(zhǔn)早期檢測(cè),目前在臨床中發(fā)揮了重要的作用[22]。近年來,隨著測(cè)序技術(shù)的普及,臨床可以在1~2 d內(nèi)獲得覆蓋位點(diǎn)更廣泛、涵蓋藥物種類更多的耐藥相關(guān)基因序列信息,《指南》為高通量多靶點(diǎn)耐藥結(jié)核檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用提供了重要的數(shù)據(jù)解讀依據(jù),但是《指南》在制定規(guī)程中還存在一定的不足:首先,表型DST是《指南》的分析基礎(chǔ),盡管《指南》對(duì)表型DST結(jié)果進(jìn)行了優(yōu)先等級(jí)劃分,但是部分藥物缺乏有效的關(guān)鍵濃度是制約后續(xù)分析的關(guān)鍵因素;特別是MFX,在2014—2018年,MFX以2.0 mg/L作為關(guān)鍵濃度,而后其降低到0.5 mg/L,關(guān)鍵濃度的異質(zhì)性將極大地影響對(duì)耐藥突變結(jié)果的解讀[10,23]。其次,對(duì)于不同突變位點(diǎn)對(duì)耐藥的影響,《指南》提供了不同程度的可信度推薦,而這正是基于對(duì)于既往文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的匯總。因此,部分罕見位點(diǎn)即便是引起高水平耐藥,但是由于證據(jù)較少,在推薦等級(jí)上也偏低。此外,部分抗結(jié)核新藥耐藥菌株較少,也造成其耐藥突變分析的難度,因此亟待擴(kuò)充針對(duì)罕見突變以及抗結(jié)核新藥的耐藥突變的全球數(shù)據(jù),以完善《指南》。再次,《指南》獲取的分子數(shù)據(jù)基于WGS的結(jié)果,由于研究成本原因,上述數(shù)據(jù)主要來自于結(jié)核病低負(fù)擔(dān)國(guó)家,而不同國(guó)家流行的優(yōu)勢(shì)結(jié)核分枝桿菌譜系存在顯著差異,提高菌株的代表性以覆蓋結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家的優(yōu)勢(shì)譜系將是值得重點(diǎn)關(guān)注的方向。未來應(yīng)該聚焦于采集更多的關(guān)于新藥及舊藥新用藥物的表型耐藥信息,并開展體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)篩選試驗(yàn)。今后的分析應(yīng)該聚焦于結(jié)合MIC揭示單個(gè)突變間的以及幾組突變間的關(guān)聯(lián)。這樣的數(shù)據(jù)將有助于分子診斷技術(shù)指導(dǎo)個(gè)性化的單個(gè)藥物劑量制定。WHO計(jì)劃對(duì)本分類定期修訂,并嘗試著將這些科研進(jìn)展促進(jìn)公共衛(wèi)生應(yīng)對(duì)舉措并填補(bǔ)其空白。