平 勇，張 倩，馮雪梅

缺血性心臟病發(fā)病率與死亡率逐年增加，嚴重影響病人生活質(zhì)量，再灌注是目前治療缺血性心臟病的有效方案，但缺血組織恢復(fù)灌注后造成代謝功能障礙與結(jié)構(gòu)損傷(心肌缺血再灌注損傷)，心肌缺血再灌注損傷可增加心臟猝死等并發(fā)癥風(fēng)險。線粒體氧化損傷、心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡等可加重心肌缺血再灌注損傷，因而，減輕心肌細胞損傷是改善心肌缺血再灌注損傷的重要途徑[1]。近年來，從植物中提取的活性成分具有抗炎、抗氧化等作用，并可預(yù)防心血管疾病發(fā)生，具體作用機制尚未明確[2-4]。毛蕊花糖苷屬于苯乙醇苷類化合物，而苯乙醇苷類化合物是一種天然糖苷類化合物，有研究表明，毛蕊花糖苷通過抑制炎性因子分泌，減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺組織損傷[5]。微小RNA-455-5p(microRNA-455-5p，miR-455-5p)在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素內(nèi)皮細胞損傷中低表達，上調(diào)其表達可抑制高糖誘導(dǎo)細胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[6]。毛蕊花糖苷對心肌缺血再灌注損傷的影響及其對miR-455-5p的調(diào)控作用尚未明確。本研究采用缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)誘導(dǎo)大鼠心肌細胞H9C2建立心肌缺血再灌注損傷模型，探討毛蕊花糖苷是否通過調(diào)控miR-455-5p表達影響H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 毛蕊花糖苷購自上海源葉生物(純度≥98%)；大鼠心肌細胞H9C2購自上海研謹生物；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；胎牛血清購自美國Gibco；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；Trizol試劑購自廣州國奧生物；逆轉(zhuǎn)錄試劑與熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)試劑購自北京天根生化；miR-455-5p寡核苷酸模擬物(miR-455-5p mimics)及陰性對照mimics NC序列(miR-NC)、miR-455-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-455-5p)及其陰性對照序列(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物；丙二醛(malondialedhyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；兔抗鼠活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3，Cleaved-Caspase 3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-9，Cleaved-Caspase 9)單克隆抗體與二抗購自美國Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建H/R模型 采用不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃缺氧密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入體積分數(shù)95%N2與體積分數(shù)5%CO2的混合氣體3 h，將培養(yǎng)基更換為高糖DMEM培養(yǎng)基后將其置于低氧裝置中缺氧培養(yǎng)3 h，之后將培養(yǎng)液更換為含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)氧培養(yǎng)4 h[7]。

1.2.2 實驗分組 將心肌細胞隨機分為正常對照組(Con組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R組，按照1.2.1步驟構(gòu)建模型)、H/R+毛蕊花糖苷低劑量組(缺氧前48 h，于培養(yǎng)基中加入20 μg/L[8]的毛蕊花糖苷后構(gòu)建模型)、H/R+毛蕊花糖苷中劑量組(缺氧前48 h，于培養(yǎng)基中加入40 μg/L的毛蕊花糖苷后構(gòu)建模型)、H/R+毛蕊花糖苷高劑量組(缺氧前48 h，于培養(yǎng)基中加入80 μg/L的毛蕊花糖苷后構(gòu)建模型)、H/R+miR-NC組(缺氧前48 h，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-NC轉(zhuǎn)染至心肌細胞后構(gòu)建模型)、H/R+miR-455-5p組(缺氧前48 h，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-455-5p mimics轉(zhuǎn)染至心肌細胞后構(gòu)建模型)、H/R+毛蕊花糖苷+anti-miR-NC組(缺氧前48 h，anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至心肌細胞后加入含有80 μg/L毛蕊花糖苷的培養(yǎng)基，之后構(gòu)建模型)、H/R+毛蕊花糖苷+anti-miR-455-5p組(anti-miR-455-5p轉(zhuǎn)染至心肌細胞后加入含有80 μg/L毛蕊花糖苷的培養(yǎng)基，之后構(gòu)建模型)。

1.2.3 檢測氧化應(yīng)激指標MDA水平與SOD、GSH-Px活性 將各組心肌細胞(1×105個/mL)接種于96孔板(每孔100 μL)，將細胞機械勻漿后離心，取各組細胞上清液，參照試劑盒說明書分別檢測MDA水平與SOD、GSH-Px活性。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集各組心肌細胞后加入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗，棄上清液，向細胞沉淀中加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，分別加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)各5 μL，充分混勻后室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-455-5p表達水平 應(yīng)用Trizol試劑提取各組心肌細胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNA(2 μg)，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix每孔10 μL，正反向引物每孔0.8 μL，cDNA每孔1 μL，ddH2O補足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；循環(huán)40次。應(yīng)用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測miR-455-5p相對表達量。

1.2.6 免疫印跡法(Western Blot)檢測Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白表達 應(yīng)用蛋白裂解液提取各組心肌細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，將5×SDS上樣緩沖液加入蛋白樣品后100 ℃沸水孵育10 min(蛋白變性)，取30 μg蛋白進行十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，分別孵育Cleaved-Caspase 3(1∶1 000)、Cleaved-Caspase 9(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)抗體稀釋液，4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，滴加電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影；應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，H/R組MDA水平升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+毛蕊花糖苷低劑量組、H/R+毛蕊花糖苷中劑量組、H/R+毛蕊花糖苷高劑量組MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激的影響(±s，n=9)

2.2 毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響 與Con組比較，H/R組凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+毛蕊花糖苷低劑量組、H/R+毛蕊花糖苷中劑量組、H/R+毛蕊花糖苷高劑量組凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響

表2 毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響(±s，n=9)

2.3 毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞miR-455-5p表達的影響 與Con組比較，H/R組miR-455-5p表達降低(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+毛蕊花糖苷低劑量組、H/R+毛蕊花糖苷中劑量組、H/R+毛蕊花糖苷高劑量組miR-455-5p表達升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞miR-455-5p表達的影響(±s，n=9)

2.4 miR-455-5p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-455-5p組MDA水平降低(P<0.001)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.001)，凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.001)。詳見圖2、表4。

圖2 miR-455-5p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響

表4 miR-455-5p過表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響(±s，n=9)

2.5 干擾miR-455-5p表達對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用 與H/R+毛蕊花糖苷+anti-miR-NC組比較，H/R+毛蕊花糖苷+anti-miR-455-5p組MDA水平升高(P<0.001)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.001)，凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.001)。表明干擾miR-455-5p表達逆轉(zhuǎn)了毛蕊花糖苷(80 μg/L)對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用。詳見圖3、表5。

圖3 干擾miR-455-5p表達逆轉(zhuǎn)了毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的作用

表5 干擾miR-455-5p表達逆轉(zhuǎn)了毛蕊花糖苷對H/R導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用(±s，n=9)

3 討 論

缺血性心臟病病人接受再灌注治療后引起心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激等，進而加重心肌細胞損傷。相關(guān)研究表明，心肌纖維能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、氧自由基增多等均可能造成心肌缺血再灌注損傷，黃酮類化合物等植物活性成分在心血管疾病治療過程中發(fā)揮著重要作用[9-10]。miRNA在心血管疾病中表達異常，尤其在H/R誘導(dǎo)的心肌細胞中表達失調(diào)，并可能作為紅景天苷等植物活性成分治療心血管疾病的潛在靶點[11]。

毛蕊花糖苷具有抗炎、抗菌與保護神經(jīng)等作用，可抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[12]。有研究表明，毛蕊花糖苷可抑制神經(jīng)細胞炎癥反應(yīng)與細胞凋亡，從而減輕內(nèi)毒素性大鼠腦組織損傷[13]。關(guān)于毛蕊花糖苷與心血管疾病的相關(guān)研究報道較少。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞MDA水平升高，SOD、GSH-Px活性降低，與既往研究報道結(jié)果[14]相似，提示成功構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷模型。SOD、GSH-Px屬于抗氧化酶類，其活性高低可反映細胞氧化損傷程度；MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，其水平升高可加重細胞氧化應(yīng)激損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷以劑量依賴性方式降低H/R誘導(dǎo)的心肌細胞MDA水平，SOD、GSH-Px活性升高，提示毛蕊花糖苷可增強H/R誘導(dǎo)的心肌細胞抗氧化能力，從而減輕細胞氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高，與既往研究報道結(jié)果[16]相似。隨著毛蕊花糖苷劑量增加，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低，提示毛蕊花糖苷可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，從而減輕細胞損傷。

為進一步探討毛蕊花糖苷減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的分子機制，本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細胞miR-455-5p表達降低，毛蕊花糖苷以劑量依賴方式提高H/R誘導(dǎo)的心肌細胞miR-455-5p表達，提示毛蕊花糖苷可能通過上調(diào)miR-455-5p表達減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。有研究表明，miR-455-5p在糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷和腦缺血再灌注損傷中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷[17]。miR-455-5p在缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，miR-455-5p過表達后H/R誘導(dǎo)的心肌細胞MDA水平降低，SOD、GSH-Px活性升高，凋亡率降低，抑制miR-455-5p表達可拮抗毛蕊花糖苷對H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的作用。提示毛蕊花糖苷通過上調(diào)miR-455-5p表達，減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。

綜上所述，毛蕊花糖苷通過上調(diào)miR-455-5p表達抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激及細胞凋亡，從而減輕細胞損傷。本研究初步證實毛蕊花糖苷可減輕心肌缺血再灌注損傷，且對心臟有保護作用，可能作為治療缺血性心臟病的有效藥物之一，為進一步研發(fā)治療缺血性心臟病的藥物提供新思路。毛蕊花糖苷是否通過調(diào)控其他miRNA或非編碼RNA表達而減輕心肌缺血再灌注損傷，具體作用機制均需進一步深入研究。