宋惠霄，劉艷紅，由笑蕊，李燕寧

小兒病毒性心肌炎是由病毒感染引起的，以局限性或彌漫性心肌炎性病變?yōu)橹鞯募膊?，各年齡段均可發(fā)病，以3～10歲多見，臨床表現(xiàn)輕重不同，積極治療后多數(shù)患兒預(yù)后良好，少數(shù)呈急性暴發(fā)性發(fā)病，病情危重，短時(shí)間內(nèi)死亡或遺留頑固性心律失常等，嚴(yán)重影響兒童身心健康。中醫(yī)學(xué)雖無(wú)“病毒性心肌炎”病名，根據(jù)病因及臨床癥狀，該病歸屬于“心悸”“怔忡”“心痹”“胸痹”等范疇，中醫(yī)藥辨證施治療效肯定。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討童心康合劑治療小兒毒瘀互結(jié)、氣陰兩虛型病毒性心肌炎的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照1999年9月全國(guó)小兒心肌炎、心肌病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的小兒病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 小兒病毒性心肌炎毒瘀互結(jié)、氣陰兩虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[2]：神疲乏力，心悸，氣短，面色蒼白胸悶或胸痛，肢冷，多汗，等；主癥：心悸，胸悶或胸痛，嘆息；次癥：乏力，氣短，懶言，多汗，煩躁，咽痛(紅)。具備主癥1項(xiàng)及次癥2項(xiàng)，可辨證為毒瘀互結(jié)、氣陰兩虛證。

1.3 病毒性心肌炎臨床分型輕型標(biāo)準(zhǔn) 無(wú)明顯自覺癥狀，偶發(fā)期前收縮或一過(guò)性心電圖ST-T改變；患兒多表現(xiàn)為肢體無(wú)力、汗出過(guò)多、面色蒼白、心悸、氣短、胸悶、頭暈等；檢查可見面色蒼白、口周發(fā)青、心尖部第一心音低鈍，伴有期前收縮或Ⅰ度、Ⅱ度房室傳導(dǎo)阻滯、輕度ST-T改變[2]。

1.4 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 符合小兒病毒性心肌炎西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)或臨床診斷為病毒性心肌炎；符合中醫(yī)小兒病毒性心肌炎毒瘀互結(jié)、氣陰兩虛證；符合小兒病毒性心肌炎臨床分型輕型；年齡1～14歲；病程≤1個(gè)月；患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.5 病例排除標(biāo)準(zhǔn) 不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或資料不全影響判斷；合并嚴(yán)重原發(fā)疾病及精神病；本研究前3個(gè)月內(nèi)參與過(guò)藥物臨床研究；白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥12×109/L，中性粒細(xì)胞百分比>70%，疑似細(xì)菌感染的患兒；過(guò)敏體質(zhì)(對(duì)2種以上食物、藥物過(guò)敏)；根據(jù)接診醫(yī)生分析，易失去有效聯(lián)系人；年齡<1歲或>14歲等。

1.6 一般資料 選取2015年1月—2018年11月山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院、濟(jì)南市第三人民醫(yī)院及濟(jì)南市第四人民醫(yī)院病毒性心肌炎患兒99例，隨機(jī)分為童心康組(應(yīng)用童心康合劑)和玉丹組(應(yīng)用玉丹榮心丸)。童心康組48例，男25例，女23例；年齡1～10(4.87±2.80)歲；病程(14.85±3.00)d。玉丹組51例，男26例，女25例；年齡1～14(4.85±3.12)歲；病程(15.59±2.71)d。兩組性別、年齡、病程比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.7 治療方案 童心康合劑由炙黃芪、麥冬、丹參、板藍(lán)根、炙甘草5味中藥按3 ∶2∶2∶2∶1組成(山東省中醫(yī)院西區(qū)制劑室生產(chǎn)，規(guī)格：每瓶100 mL)；用法：1～3歲4 mL，每日3次；4～6歲7 mL，每日3次；7～14歲10 mL，每日3次。玉丹榮心丸(上海玉丹藥業(yè)廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970095)由玉竹、丹參、五味子、降香、苦參、大青葉、山楂、炙甘草8味中藥組成；用法1～3歲2丸，每日3次；4～6歲3丸，每日3次；7～14歲4丸，每日3次。兩種藥物符合有效、同類、可比原則。兩組以4周為1個(gè)療程。

1.8 觀察指標(biāo) 觀察兩組治療前后中醫(yī)證候改善情況，主癥、次癥按無(wú)、輕、中、重計(jì)分，統(tǒng)計(jì)證候改善率及單項(xiàng)癥狀療效；觀察兩組治療前后肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心電圖、心臟彩超及血尿便常規(guī)、肝腎功能；記錄研究過(guò)程中兩組不良事件發(fā)生情況。

1.9 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 中醫(yī)療效判定，根據(jù)公式：中醫(yī)證候改善率=(治療前總積分-治療后總積分)/治療前總積分×100%。臨床治愈：中醫(yī)證候積分減少>95%；顯效：中醫(yī)證候積分減少70%～95%；有效：中醫(yī)證候積分減少30%～69%；無(wú)效：中醫(yī)證候積分減少<30%。單項(xiàng)癥狀療效判定，痊愈：癥狀消失；顯效：癥狀明顯好轉(zhuǎn)(積分降低2個(gè)等級(jí))；有效：癥狀好轉(zhuǎn)(積分降低1個(gè)等級(jí))；無(wú)效：治療癥狀無(wú)變化或加重。

2 結(jié) 果

2.1 兩組中醫(yī)證候積分及CK-MB比較 治療前，兩組中醫(yī)證候積分及CK-MB比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。治療后，兩組中醫(yī)證候積分及CK-MB較治療前降低(P<0.05)。詳見表1。說(shuō)明童心康合劑及玉丹榮心丸均可改善病毒性心肌炎患兒臨床癥狀及CK-MB，療效顯著，且兩組等效。

表1 兩組中醫(yī)證候積分及CK-MB比較(±s)

2.2 兩組中醫(yī)療效比較 兩組中醫(yī)療效比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。說(shuō)明童心康合劑和玉丹榮心丸治療小兒病毒性心肌炎療效相當(dāng)。

表2 兩組中醫(yī)療效比較

2.3 兩組治療前后中醫(yī)單項(xiàng)主要癥狀比較 3項(xiàng)中醫(yī)單項(xiàng)主要癥狀樣本量較少，不符合等級(jí)資料兩樣本比較秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的要求。兩組3項(xiàng)主癥改善情況僅用痊愈率比較，詳見表3。說(shuō)明玉丹榮心丸治療心悸痊愈率略高于童心康合劑。

表3 兩組治療前后中醫(yī)單項(xiàng)主要癥狀比較

2.4 兩組治療前后肝腎功能比較 兩組治療前后肝、腎功能主要指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，故兩者安全性值得肯定。

2.5 兩組依從性情況比較 治療期間，每次發(fā)放1周藥物，1周后復(fù)診，記錄患兒癥狀體征，療程4周，5例因未按要求服藥中途剔除，研究結(jié)束時(shí)共納入患兒99例。

2.6 不良反應(yīng) 兩組患兒均未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。

3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討童心康合劑治療小兒病毒性心肌炎的作用機(jī)制

3.1 方法

3.1.1 獲取童心康合劑活性成分及靶點(diǎn) 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索童心康合劑各藥物含有的化學(xué)成分。在TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)檢索麥冬、丹參、炙黃芪、炙甘草的有效成分；在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索丹參、板藍(lán)根的有效成分，在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索丹參、炙甘草的有效成分。根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)進(jìn)行篩選，設(shè)置閾值：OB≥30%、DL≥0.18。將獲得的對(duì)應(yīng)smile碼輸入到SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到與藥物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。從DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到的有效成分需要將CAS號(hào)通過(guò)化源網(wǎng)查找分子式，再通過(guò)SwissTargetPrediction預(yù)測(cè)相關(guān)靶點(diǎn)。

3.1.2 病毒性心肌炎靶點(diǎn) 使用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以疾病名稱“病毒性心肌炎(viral myocarditis)”檢索相關(guān)基因，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中Relevance score評(píng)分越高，說(shuō)明此基因?qū)Ρ静〉难芯績(jī)r(jià)值越高。

3.1.3 童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點(diǎn) 利用Venny 2.1在線工具進(jìn)行童心康合劑活性成分靶點(diǎn)和病毒性心肌炎相關(guān)靶點(diǎn)映射并繪制韋恩圖，將兩部分交集靶點(diǎn)作為童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點(diǎn)。

3.1.4 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將單味藥、活性成分、作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape繪制單味藥-活性成分以及活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape軟件Merge功能繪制最終的單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，基于構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)分析童心康合劑治療病毒性心肌炎的作用機(jī)制。

3.1.5 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI network) 利用STRING平臺(tái)將交集靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，組合分?jǐn)?shù)閾值>0.4。應(yīng)用Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用“Network Analyzer”功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)整體的節(jié)點(diǎn)度值分布(node degree distribution)和介數(shù)中心性(betweenness centrality)兩個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)，以Degree和betweenness為參數(shù)分析童心康合劑治療病毒性心肌炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)，設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小與顏色反映度值(Degree)大小，最終獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。

3.1.6 童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點(diǎn)生物學(xué)功能富集分析 利用R語(yǔ)言{packages(“RSQLite”)}等多個(gè)工具包，將得到的交集基因進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，并進(jìn)行可視化處理。

3.2 結(jié)果

3.2.1 童心康合劑活性成分及靶點(diǎn)分析 通過(guò)TCMID、TCMSP及DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)童心康合劑5種中藥進(jìn)行活性成分檢索，其中丹參312個(gè)、板藍(lán)根180個(gè)、麥冬55個(gè)、炙黃芪2個(gè)、炙甘草17個(gè)。對(duì)應(yīng)1 095個(gè)靶點(diǎn)。

3.2.2 童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點(diǎn)分析 在GeneCards疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到病毒性心肌炎相關(guān)基因靶點(diǎn)1 096個(gè)。繪制韋恩圖得到童心康合劑治療病毒性心肌炎靶點(diǎn)236個(gè)。詳見圖1。

圖1 童心康合劑活性成分與病毒性心肌炎靶點(diǎn)的韋恩圖

3.2.3 童心康合劑活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析 采用Cytoscape軟件的Merge功能繪制童心康合劑活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，得到440個(gè)節(jié)點(diǎn)、4 363條邊的網(wǎng)絡(luò)，5味中藥的199個(gè)活性成分作用于236個(gè)靶點(diǎn)上。詳見圖2。

圖2 童心康合劑活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將韋恩圖中236個(gè)童心康合劑治療病毒性心肌炎的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖3。輸出(string_interactions.tsv)核心基因，使用R語(yǔ)言運(yùn)行篩選出與疾病相關(guān)的30個(gè)基因，詳見圖4。連線數(shù)越多，說(shuō)明該基因越處于核心位置，即該基因?qū)膊∽饔玫囊饬x越大。居前10位的分別是白細(xì)胞介素-6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、清蛋白(ALB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、腫瘤蛋白53(TP53)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和胱天蛋白酶3(CASP3)。提示這些核心靶點(diǎn)可能是童心康合劑治療病毒性心肌炎的主要途徑。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心基因可視化分析圖

3.2.5 富集信號(hào)通路分析 利用R語(yǔ)言安裝{packages(“RSQLite”)}等工具包，將基因symbol轉(zhuǎn)為基因ID，將得到的基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析篩選得到20個(gè)過(guò)程，包括與內(nèi)肽酶活力改變、細(xì)胞因子受體結(jié)合、與蛋白絲氨酸激酶活性、磷酸酶綁定、蛋白二聚體活性等，繪制柱狀圖及氣泡圖，其中P值越小顏色越紅，表明功能富集越大，詳見圖5、圖6。利用R語(yǔ)言運(yùn)行KEGG相關(guān)腳本，得到176條通路，包括與人類巨細(xì)胞病毒感染、流感病毒A感染、細(xì)胞凋亡(見圖7)、C型凝集素受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

圖7 細(xì)胞凋亡

4 討 論

小兒病毒性心肌炎是由柯薩奇病毒、腺病毒、副流感病毒等感染引起的心肌炎性病變，輕者在查體中發(fā)現(xiàn)心律失常，患兒無(wú)明顯不適，重者突然出現(xiàn)心源性休克、心腦綜合征等危重癥，甚則猝死，是嚴(yán)重威脅兒童身心健康的疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無(wú)特異性治療方法，中醫(yī)藥在抗病毒、減輕心肌炎癥、降低免疫反應(yīng)、防治心肌纖維化等方面療效顯著，得到廣大醫(yī)患的認(rèn)可。中醫(yī)學(xué)中無(wú)此病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)歸屬于“胸痹”“心悸”“太息”“溫病”等病證辨治。《小兒藥證直訣》[3]記載五臟主?。骸靶闹黧@。實(shí)則叫哭發(fā)熱，飲水而搐，虛則臥而悸動(dòng)不安……心病，多叫哭，驚悸，手足動(dòng)搖，發(fā)熱飲水”。《兒科要略》記載：“心痛者曲身護(hù)其胸，大痛者爬床而搔席[4]”，發(fā)病情況與病毒性心肌炎發(fā)作時(shí)癥狀類似。李燕寧教授從醫(yī)30余載，治療小兒病毒性心肌炎頗有心得，認(rèn)為本病病機(jī)為毒瘀互結(jié)、氣陰兩虛，此病理變化貫穿各個(gè)分期。急性期外感熱毒從口鼻、鼻咽而入，毒傷心絡(luò)，傷心體損心用，致氣陰兩虛，氣陰兩虛為本，邪毒侵襲為標(biāo)，此期標(biāo)實(shí)為主；遷延期毒瘀互結(jié)，以瘀為主，濕毒、痰毒、濁毒內(nèi)生，虛實(shí)標(biāo)本夾雜；慢性期病情遷延，氣陰兩虛明顯，仍有毒瘀，且反復(fù)感受外毒，本虛為主，兼夾毒瘀。

李燕寧教授根據(jù)疾病病因病機(jī)提出解毒活血、益氣養(yǎng)陰的治則，精心選藥組成童心康合劑，臨床療效顯著。李燕寧教授強(qiáng)調(diào)本病遷延期、慢性期均為急性期熱毒未清所致，瘀血的產(chǎn)生與熱毒密切相關(guān)，故清熱解毒至關(guān)重要，提出“祛邪務(wù)盡”，防止病情進(jìn)一步發(fā)展。本病急性期瘀血征象不明顯，現(xiàn)代研究已證實(shí)急性期炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌壞死，心肌纖維溶解，心肌微循環(huán)障礙已存在，故李燕寧教授主張活血化瘀藥在疾病初期即用，強(qiáng)調(diào)其應(yīng)用貫穿始終，以防由瘀致毒，毒瘀互結(jié)，損傷正氣。熱毒侵襲致心之氣陰兩傷，如小兒先天稟賦不足、氣陰虧虛，或病后調(diào)護(hù)不周致氣陰損傷，更易感受熱毒，故李燕寧教授臨證早期應(yīng)用大劑量炙黃芪，伍以麥冬，一則補(bǔ)心氣、養(yǎng)心陰，扶正防復(fù)感外毒；二則氣陰充足可托毒外出，防氣虛血運(yùn)不暢留而為瘀或陰虛血少澀而為瘀，加重病情惡化。

童心康合劑是由炙黃芪、麥冬、丹參、板藍(lán)根、炙甘草5味中藥按3∶2∶2∶2∶1組成。方中炙黃芪、麥冬為君，且炙黃芪使用量最大，兩藥合用培本益氣養(yǎng)陰療效顯著。臣以丹參活血化瘀，佐以板藍(lán)根清熱解毒，使以炙甘草調(diào)和諸藥，補(bǔ)脾益氣復(fù)脈。

玉丹榮心丸是由上海玉丹藥業(yè)廠生產(chǎn)，由玉竹、丹參、五味子、降香、苦參、大青葉、山楂、炙甘草8味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、清熱解毒、強(qiáng)心復(fù)脈的功效。治療氣陰兩虛或氣陰兩虛兼心脈瘀阻所致胸悶、心悸、氣短、乏力等證，適用于病毒性心肌炎、心肌病、心肌損傷、心律失常、反復(fù)呼吸道感染、早期復(fù)極綜合征等疾病的治療。劉大為[5]觀察23例病毒性心肌炎患兒，在基礎(chǔ)治療基礎(chǔ)上加用玉丹榮心丸治療，可明顯改善患兒臨床癥狀。葛安霞等[6]觀察302例病毒性心肌炎患兒，觀察組給予玉丹榮心丸治療，對(duì)照組服用生脈飲，結(jié)果顯示，觀察組臨床癥狀、體征改善，心肌酶及心電圖恢復(fù)方面均優(yōu)于對(duì)照組，表明玉丹榮心丸治療病毒性心肌炎療效顯著，且為臨床醫(yī)生及病人所肯定，故本研究選擇玉丹榮心丸作為對(duì)照組用藥，99例患兒隨機(jī)分組臨床觀察，結(jié)果童心康合劑與其同效，療效顯著。

病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制尚未明確，根據(jù)本研究結(jié)果與病毒感染、免疫反應(yīng)、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析童心康合劑治療病毒性心肌炎的核心靶點(diǎn)包括IL-6、AKT1、GAPDH、TNF、MAPK3、ALB、VEGFA、TP53、EGFR、CASP3等。其中IL-6、TNF是輔助性T細(xì)胞中介導(dǎo)炎癥免疫應(yīng)答的Th1細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，富集分析顯示T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路是童心康合劑治療病毒性心肌炎的可能途徑；T細(xì)胞受體在免疫突觸形成中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，提供了T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之間的連接，T細(xì)胞激活促進(jìn)了信號(hào)級(jí)聯(lián)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生，細(xì)胞存活、增殖和分化決定細(xì)胞命運(yùn)。有研究顯示，IL-6單克隆抗體通過(guò)抑制Th17、Treg細(xì)胞數(shù)量和功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)自身免疫性心肌炎的保護(hù)作用[7]。CD40信號(hào)與TNF受體相關(guān)因子結(jié)合，在動(dòng)脈粥樣硬化形成中發(fā)揮著重要作用[8]。

綜上所述，抑制免疫反應(yīng)是童心康合劑治療病毒性心肌炎的可能機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提示童心康合劑可抗流感病毒A，抑制細(xì)胞凋亡，可見童心康合劑治療病毒性心肌炎是多途徑、多靶點(diǎn)的，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步探討童心康合劑治療小兒病毒性心肌炎的分子機(jī)制提供了思路。