龍 丹，袁宇晴，毛晨晗，朱 瑩

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028）

痢疾是以大便次數(shù)增多、腹痛、里急后重、痢下赤白膿血為主癥的病證，具有傳染性，多發(fā)于夏秋季節(jié)[1]，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的潰瘍性結(jié)腸炎、細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾等[2-3]。痢疾相關(guān)疾病屬臨床常見(jiàn)疑難病，其病勢(shì)纏綿、遷延難愈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多使用激素類藥物、免疫抑制劑等，但容易產(chǎn)生不良反應(yīng)[5]。對(duì)此類病因不明、癥狀復(fù)雜的疾病，中醫(yī)藥可以發(fā)揮多靶點(diǎn)的特色，改善癥狀，具有較好的臨床療效[6-7]。葉天士作為“溫病四大家”之一，在瘟疫病方面有著獨(dú)到見(jiàn)解。《臨證指南醫(yī)案》中專設(shè)一篇對(duì)其治“痢”經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行闡述。本研究借助數(shù)據(jù)挖掘分析《臨證指南醫(yī)案·痢》的用藥規(guī)律，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其現(xiàn)代藥理機(jī)制，旨在為臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎、阿米巴痢疾、細(xì)菌性痢疾等疾病提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 以人民衛(wèi)生出版社出版的《臨證指南醫(yī)案·痢》[8]所載醫(yī)案為研究資料，其中所錄醫(yī)案92例，處方109首，涉及中藥110味。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)《臨證指南醫(yī)案·痢》醫(yī)案中所收錄的方劑。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 處方記錄不明確或無(wú)法考究；復(fù)診方藥與初診完全相同。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范化 參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[9]及中國(guó)中醫(yī)藥出版社出版的第10版《中藥學(xué)》[10]對(duì)處方涉及的中藥名稱進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。例如：“廣皮白”“新會(huì)皮”規(guī)范為“陳皮”，“官桂”規(guī)范為“肉桂”，“焦術(shù)”規(guī)范為“白術(shù)”等。

1.4 數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計(jì)分析 將處方逐一輸入Excel 2010，資料錄入完成后，由2人對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行審核，確保數(shù)據(jù)的完整性和準(zhǔn)確性。通過(guò)軟件“數(shù)據(jù)管理”功能，將得到的處方上傳至中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)（V3.0）軟件[11]，建立“《臨證指南醫(yī)案·痢》的中藥數(shù)據(jù)庫(kù)”。通過(guò)軟件“數(shù)據(jù)分析”功能依次對(duì)藥物分類、性味、歸經(jīng)及使用頻數(shù)進(jìn)行分析；運(yùn)用SPSS Statistics 25.0、SPSS Molder 18.0對(duì)組方規(guī)律、核心用藥進(jìn)行分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究 在TCMSP、UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選葉天士治痢核心藥對(duì)（黃芩-黃連）的有效成分及相應(yīng)靶點(diǎn)；在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與痢疾相對(duì)應(yīng)的英文病名作為疾病靶點(diǎn)：潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis）、阿米巴痢疾（Amebic dysentery）和細(xì)菌性痢疾（bacillary dysentery），將以上靶點(diǎn)合并后去重，再與黃芩-黃連靶基因取交集，作為黃芩-黃連藥對(duì)治療痢疾的潛在靶點(diǎn)。將上述交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；用Metascape對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物的分類及性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì) 本項(xiàng)研究共納入處方109首，涵蓋中藥110味，總用藥頻數(shù)為712。藥物分類、性味及歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1～4。補(bǔ)虛類藥物使用頻數(shù)最高，其次為清熱藥、利水滲濕藥、理氣藥、溫里藥等。藥性以溫藥為主，其次為寒藥，平藥；藥味甘味使用最廣，苦、辛味次之。歸經(jīng)主要?dú)w脾經(jīng)。

表1 用藥類別及頻數(shù)

表2 藥物四氣分布

表3 藥物五味分布

表4 藥物歸經(jīng)分布

2.2 藥物使用頻數(shù)統(tǒng)計(jì) 對(duì)處方中110味藥物頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得使用頻數(shù)≥10的中藥21味。結(jié)果顯示，使用頻數(shù)排前5位的藥物依次為茯苓、人參、白芍、黃連、甘草。（見(jiàn)表5）

2.3 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 采用SPSS Modeler 18.0建模，運(yùn)用Apriori算法進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，參數(shù)[12]：支持度≥10.0%，置信度≥60%，提升度≥1，最大前項(xiàng)為1。共得到二項(xiàng)關(guān)聯(lián)15組。（見(jiàn)表6、圖1）

表6 藥對(duì)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析（支持度≥10.0%，置信度≥60%，提升度≥1）

圖1 關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)展示圖

2.4 藥物聚類分析 藥物聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)藥物聚為6類時(shí)，各類藥物基本達(dá)到穩(wěn)定，采取歐式距離法聚類，以圓形聚類圖展示。共得到5個(gè)有效聚類。C1：豬苓、澤瀉、白術(shù)、茯苓；C2：陳皮、厚樸、木香、附子；C3：人參、干姜；C4：黃芩、黃連、白芍、牡丹皮、山楂、金銀花；C5：熟地黃、肉桂、當(dāng)歸、甘草。（見(jiàn)圖2）

圖2 圓形聚類圖

2.5 相關(guān)性分析 采用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)R值熱圖見(jiàn)圖3，其中有顯著意義的共55個(gè)藥對(duì)。藥對(duì)正相關(guān)R值≥0.5的有2對(duì)，分別為黃芩+黃連（0.812），豬苓+澤瀉（0.532）；0.3≤R值＜0.5的有5組藥對(duì)，分別為厚樸+陳皮、木香+厚樸、豬苓+白術(shù)、金銀花+山楂、肉桂+當(dāng)歸；0.1＜R值＜0.3呈弱相關(guān)的有25對(duì)；23個(gè)藥對(duì)負(fù)相關(guān)，其中人參+厚樸負(fù)相關(guān)性最大。（見(jiàn)圖3）

圖3 相關(guān)性分析熱圖

黃芩-黃連置信度、相關(guān)系數(shù)均最高，此為葉天士治療痢疾的經(jīng)典藥對(duì)。這與痢疾濕熱蘊(yùn)結(jié)于腸腑的關(guān)鍵病機(jī)相印證，故本研究將其定義為核心藥對(duì)[12]，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)黃芩-黃連藥對(duì)治療痢疾的機(jī)制。

2.6 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心藥對(duì)治療痢疾的機(jī)制

2.6.1 藥物活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）檢索核心藥對(duì)黃芩-黃連的化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件[13]，篩選出黃芩的有效化合物36個(gè)、黃連的有效化合物14個(gè)，在Uniprot中篩選出兩者已驗(yàn)證的人類靶點(diǎn)267個(gè)。

2.6.2 痢疾相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 綜合GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出376個(gè)痢疾相關(guān)靶點(diǎn)。疾病靶點(diǎn)與中藥靶點(diǎn)取交集，得到47個(gè)黃芩-黃連治療痢疾的潛在靶點(diǎn)。

2.6.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)上傳至String在線平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種設(shè)為人，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。（見(jiàn)圖4）為進(jìn)一步分析核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，借助Cytoscape篩選出Degree值>10[14]的41個(gè)靶基因，用于進(jìn)一步的GO功能富集和KEGG通路分析。Degree值排名前20的交集靶點(diǎn)信息見(jiàn)表7。

圖4 黃芩-黃連治療痢疾相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表7 “黃芩-黃連”——痢疾核心靶點(diǎn)

2.6.4 GO功能分析 核心靶點(diǎn)參與的生物過(guò)程（BP）共1 159條，細(xì)胞組分（CC）共23條，分子功能（MF）共57條。選取顯著性位于前20的BP、前10的CC、前10的MF條目展示于圖5。黃芩-黃連的生物功能主要集中在抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控白細(xì)胞黏附等方面，其分子功能主要涉及調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性及受體配體活性等。

圖5 黃芩-黃連治療疾痢靶點(diǎn)GO 分析圖

2.6.5 KEGG通路分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)41條核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，設(shè)定P＜0.01[15]，按P值選取前20條具有代表性的富集結(jié)果予以展示。（見(jiàn)圖6）黃芩-黃連藥對(duì)有效成分可以參與AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。

圖6 黃芩-黃連治療痢疾靶點(diǎn)KEGG 通路分析氣泡圖

3 討論

《臨證指南醫(yī)案》有云：“痢癥古名滯下，惟夏秋暑濕夾積者居多，其次則風(fēng)淫火迫寒侵也?！盵8]葉天士謹(jǐn)守痢疾邪蘊(yùn)腸腑、氣血凝滯的病機(jī)關(guān)鍵，重視清利濕熱、調(diào)暢氣血。除此之外，筆者還總結(jié)出葉氏扶正祛邪、標(biāo)本兼顧，分消走泄、因勢(shì)利導(dǎo)，辛開苦降、調(diào)和寒熱等治療特色，以期指導(dǎo)臨床。

3.1 扶正祛邪，標(biāo)本兼顧 黃芩-黃連藥對(duì)置信度、相關(guān)系數(shù)均最高，與痢疾邪蘊(yùn)腸腑的關(guān)鍵病機(jī)相吻合。兩藥直清里熱，燥濕堅(jiān)陰，使?jié)駸岬们?，則腑氣自通。葉天士治痢以溫藥為主，其次為寒藥與平藥；在藥物功效分類中，補(bǔ)虛藥居于首位。用藥頻數(shù)分析結(jié)果顯示，茯苓、人參、白芍、黃連、甘草、黃芩等用藥頻數(shù)居于前列，其中茯苓出現(xiàn)頻率最高，反映了葉天士扶正祛邪的治療大法。置信度較高的6個(gè)藥對(duì)（澤瀉→茯苓、陳皮→茯苓、厚樸→茯苓、白術(shù)→茯苓、豬苓→茯苓、炮姜→茯苓）中均有茯苓，可見(jiàn)健脾滲濕在治痢中的重要性。葉氏慣于在顧護(hù)脾胃的基礎(chǔ)上利水滲濕。聚類分析C3組（人參、干姜）中，干姜溫中焦之陽(yáng)、散中焦之寒，人參健中焦之氣，共奏甘溫補(bǔ)中、溫陽(yáng)健脾之效。C5組（熟地黃、肉桂、當(dāng)歸、甘草）中肉桂補(bǔ)火助土，熟地黃滋陰養(yǎng)血，當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，可與因子分析F7組相印證，適用于痢疾日久，正氣耗損，陰陽(yáng)兩傷者，提示了葉天士“久痢治腎”的學(xué)術(shù)主張。濕熱痢雖占病案之多數(shù)，但葉氏治痢不在一味清熱，而是正邪兼顧，注重祛邪同時(shí)顧護(hù)脾腎。

3.2 分消走泄，因勢(shì)利導(dǎo) 本研究表明，利水滲濕藥使用頻數(shù)排在第3位，提示了葉天士治療痢疾重視利濕之法。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果顯示，豬苓-茯苓、澤瀉-茯苓、白術(shù)-茯苓置信度、支持度均較高；濕熱偏于下焦者，葉氏喜用豬苓-茯苓、澤瀉-茯苓等藥對(duì)，使?jié)裥皬男”愣ィ纭夺t(yī)學(xué)正傳》所云：“治濕不利小便，非其治也”。聚類分析C1組（豬苓、澤瀉、白術(shù)、茯苓）為五苓散之雛形，葉天士宗張仲景“利小便以實(shí)大便”之法[16]，諸藥甘淡滲利，體現(xiàn)了因勢(shì)利導(dǎo)治濕之妙。木香-厚樸藥對(duì)使用頻數(shù)與置信度均較高，可見(jiàn)葉天士辨治痢疾重視氣機(jī)升降。濕阻中焦者，易阻滯氣機(jī)，故輔以木香-厚樸辛溫開郁、暢通中焦氣機(jī)，理氣以祛濕，氣行則濕走，體現(xiàn)了走泄祛濕之法，彰顯了葉天士分消走泄法祛濕的治痢特色。

3.3 辛開苦降，調(diào)和寒熱 由關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果可知，干姜-黃連藥對(duì)常組合為用，其宗瀉心湯之意，提示葉天士治痢立足中焦，辛以開之，苦以降之，苦辛通降，調(diào)和寒熱。《臨證指南醫(yī)案》中明確指出：“脾胃之病，虛實(shí)寒熱，宜燥宜潤(rùn)，固當(dāng)詳辨，其于升降二字，尤為緊要?！盵17]蓋脾健氣升，則肺氣宣發(fā)，肝氣升發(fā)，腎氣蒸騰，如是則水精四布，而不獨(dú)注腸中，胃和氣降，則腑氣通降，受盛傳化有序進(jìn)行，糟粕時(shí)有序排出[18]。葉天士對(duì)藥物性味配伍頗有見(jiàn)地，有“在氣分，有苦辛調(diào)氣與辛甘益氣等法；在血分，有酸苦行血及咸柔養(yǎng)血諸方”之說(shuō)[8]，其亦巧用甘溫益氣、苦辛調(diào)氣、酸甘養(yǎng)陰等法。

3.4 核心藥對(duì)治療痢疾的機(jī)制 本研究表明，核心藥對(duì)黃芩-黃連治療痢疾度值排名10的關(guān)鍵基因?yàn)椋篒L-6、AKT1、IL-1B、PTGS2、TNF、MMP-9、TP53、CXCL8、IL-10、ICAM1。白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種重要的多功能細(xì)胞因子，能影響腸道黏膜微循環(huán)狀態(tài)及腸道黏膜潰瘍的修復(fù)，可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)促進(jìn)C反應(yīng)蛋白的釋放，加重炎癥反應(yīng)[19-20]。蛋白激酶B（AKT1）是一種自噬相關(guān)基因，主要參與細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝等細(xì)胞過(guò)程[21]。實(shí)驗(yàn)研究表明，其可通過(guò)增強(qiáng)自噬作用而降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥因子的表達(dá)[22]。細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM1）可介導(dǎo)白細(xì)胞不同亞群間的黏附和接觸，調(diào)節(jié)其功能活性和免疫反應(yīng)，降低該分子的表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸黏膜的修復(fù)[23]。

GO富集分析結(jié)果顯示，“黃芩-黃連”治療痢疾的生物過(guò)程主要定位在抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化、白細(xì)胞黏附、平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等方面；其分子功能參與了腫瘤壞死因子受體結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性及受體配體活性等，涉及質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組分。KEGG通路分析顯示，黃芩-黃連藥對(duì)有效成分可以參與AGE-RAGE、癌癥、乙型肝炎、TNF等信號(hào)通路。唐康等[24]發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE信號(hào)通路可以通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞遷移、增殖和凋亡。相關(guān)研究表明，NF-κB廣泛參與炎癥相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[25]。左玲等[26]發(fā)現(xiàn)清熱祛濕法治療UC的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB的激活，減輕炎癥反應(yīng)，從而改善腸道功能。

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究借助數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析了《臨證指南醫(yī)案·痢》治療痢疾的用藥規(guī)律與作用機(jī)制，在一定程度上反映了葉天士對(duì)該病的用藥規(guī)律與辨治思路。葉天士治療痢疾重視清利濕熱、調(diào)暢氣機(jī)，其善用分消走泄法祛濕，辛開苦降法協(xié)調(diào)升降，顧護(hù)正氣貫穿始終。核心藥對(duì)黃芩-黃連治療痢疾可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫、調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖發(fā)揮作用，同時(shí)受AGE-RAGE、NF-κB、HIF-1、IL-17信號(hào)通路等多靶點(diǎn)、多通路的共同影響。但本研究尚存在局限性，如未能將使用頻數(shù)較少但臨床療效確切的中藥挖掘出來(lái)。期望以后有更成熟的信息挖掘技術(shù)，進(jìn)一步完善相關(guān)研究。