張根榮，徐長麗，金俊杰，石 蕓，高 珣，秦昆明,

（1.蘇州市中西結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215101；2.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3.南京海源中藥飲片有限公司，江蘇 南京 210061；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046）

蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri(L)Cuss.的干燥成熟果實(shí)，在全國多數(shù)地區(qū)都有分布[1]。蛇床子中含有揮發(fā)油、香豆素類、黃酮類等多種成分[2]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載：“蛇床子主婦人陰中腫痛，男子陽痿、濕癢，除痹氣，利關(guān)節(jié)，癲癇惡創(chuàng)；久服，輕身?！鄙叽沧泳哂袦啬I壯陽、祛風(fēng)燥濕和殺蟲止癢等功效，常用于治療腎虛陽痿、皮膚瘙癢及陰癢帶下等疾病[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，蛇床子揮發(fā)油是其發(fā)揮止癢作用的主要有效成分，且能夠協(xié)同其他成分共同發(fā)揮止癢作用。劉明平等[5]建立了小鼠瘙癢模型，研究了蛇床子水提物、醇提物、揮發(fā)油的止癢作用，結(jié)果顯示蛇床子醇提物和揮發(fā)油能夠有效減輕模型小鼠的瘙癢癥狀，可見蛇床子揮發(fā)油在發(fā)揮止癢作用中占據(jù)重要地位。

氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）是將色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高鑒別能力結(jié)合在一起的在線分離和定性檢測技術(shù)[6]，適用于中藥中揮發(fā)油類成分的分離分析[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”多層次復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，研究中藥成分與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，從而更直觀深入地了解中藥的藥效成分和作用機(jī)制，為中藥復(fù)雜體系的研究提供了新的思路和方法[8]。本研究運(yùn)用GC-MS技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究蛇床子揮發(fā)油中的潛在活性成分，探討其作用通路或機(jī)制，以期為蛇床子進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥Agilent5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司，配自動(dòng)進(jìn)樣器，附軟件及NIST11.0標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫）；BS142S型電子天平（瑞士Mettler Toledo上海有限公司）；超聲波清洗儀（昆山舒美儀器公司）；蛇床子藥材原產(chǎn)地安徽，經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司丁斐執(zhí)業(yè)中藥師鑒定為正品；無水硫酸鈉（分析純，南京邦諾生物科技有限公司）。

1.2 蛇床子揮發(fā)油的提取稱取蛇床子藥材粉末100 g，置2 000 mL圓底燒瓶中，加10倍量水，按常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油[9]，至揮發(fā)油不再增加，將所得揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥，即得。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：安捷倫彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為260℃。柱室溫度：初始溫度為50℃，保持6 min；以10℃/min升溫速率升至230℃，保持6 min。載氣：高純氦氣，流速：1 mL/min，分流比1∶1，進(jìn)樣量：1 μL，Gas saver：關(guān)閉。

電離方式：EI，電子能量：70 eV，離子源溫度：230℃，接口溫度：260℃，四級桿溫度：150℃，調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧，質(zhì)量掃描方式：全部，掃描范圍：20～500 amu。樣品進(jìn)樣量為1 μL，每個(gè)樣品進(jìn)樣2針，使用NIST11.0標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫進(jìn)行檢索分析[10]。

1.4 蛇床子揮發(fā)油中主要成分及作用靶點(diǎn)的收集將GC-MS分析得到的成分，利用TCMSP平臺(tái)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）結(jié)合Swiss ADME[以胃腸道吸收度（GI absorption）和生物利用度得分（Bioavailability Score）兩者均為高分者為依據(jù)]進(jìn)行篩選，得到蛇床子揮發(fā)油主要有效成分及其靶點(diǎn)信息。經(jīng)篩選整理后，在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫平臺(tái)（http://www.uniprot.org），限定物種為人，統(tǒng)一將化合物的作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為GeneSymbol。

1.5 與止癢相關(guān)疾病靶點(diǎn)的收集在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中分別輸入Pruritus（瘙癢癥）和Skin allergy（皮膚過敏）為關(guān)鍵詞，根據(jù)Relevance score篩選大于平均值的靶點(diǎn)，最后得到與止癢作用相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.6 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)交集，所得交集靶點(diǎn)即為關(guān)鍵靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://STRING-db.org/），構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，下載結(jié)果的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行可視化分析。

1.7 GO和KEGG通路富集分析在David數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）中輸入已篩選好的靶點(diǎn)，將物種設(shè)定為人類，分別下載KEGG、生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組成（CC）數(shù)據(jù)結(jié)果，得到通路富集分析圖，并對其進(jìn)行分析。

1.8 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖為了進(jìn)一步更好理解中藥、成分與其相應(yīng)靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，根據(jù)富集的KEGG通路及作用靶點(diǎn)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。選擇Degree值高的成分作為主要活性成分，將活性成分、靶點(diǎn)、通路經(jīng)Excel處理后，導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化分析。

1.9 分子對接通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載得分較高的潛在活性成分spf格式文件，在Chemdraw軟件中獲取3D結(jié)構(gòu)，并另存為mol 2文件。將關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入PDB數(shù)據(jù)庫，尋找關(guān)鍵靶蛋白，下載其數(shù)據(jù)文件。通過Pymol軟件對靶蛋白受體結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水等處理后下載相關(guān)文件。通過AutoDockTools對關(guān)聯(lián)度靠前的活性成分和靶蛋白進(jìn)行分子對接。最后將結(jié)合力強(qiáng)的組合導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行可視化分析展示。

2 結(jié) 果

2.1 蛇床子揮發(fā)油化學(xué)成分分析與鑒定按上述氣相色譜-質(zhì)譜分析條件，對蛇床子揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，以面積歸一化法測定揮發(fā)油中各組分相對百分含量，經(jīng)過NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫檢索，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照將匹配度≥90的作為揮發(fā)油潛在活性成分，最后鑒定得到15個(gè)主要化學(xué)成分。（見表1）

表1 蛇床子揮發(fā)油化學(xué)成分鑒定表

2.2 蛇床子揮發(fā)油中潛在活性成分以及相關(guān)作用靶點(diǎn)篩選將上述蛇床子揮發(fā)油中主要成分通過TCMSP平臺(tái)結(jié)合Swiss ADME，以胃腸道吸收度（GI absorption）和生物利用度評分高為篩選依據(jù)，最終得到除α-萜烯外其他14個(gè)潛在的活性成分及其靶點(diǎn)信息。利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）對上述分析得出的蛇床子揮發(fā)油潛在活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，設(shè)置Probability〉0，篩選得到相關(guān)作用靶點(diǎn)。將兩個(gè)平臺(tái)篩選得到的成分進(jìn)行整合后，通過篩選不重復(fù)選項(xiàng)，最終獲得191個(gè)成分靶點(diǎn)。（見圖1）

圖1 蛇床子揮發(fā)油成分-靶點(diǎn)圖

2.3 成分-疾病共有靶點(diǎn)Venny圖的構(gòu)建在GeneCards數(shù)據(jù)庫中分別輸入關(guān)鍵詞Pruritus（瘙癢癥）、Skin allergy（皮膚過敏）獲得與止癢相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，根據(jù)Relevance score篩選大于平均值的靶點(diǎn)，得到瘙癢癥相關(guān)靶點(diǎn)897個(gè)，皮膚過敏癥相關(guān)靶點(diǎn)790個(gè)。將蛇床子揮發(fā)油中潛在活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny2.1.0進(jìn)行靶點(diǎn)交集。其中JAK2、OPRM1、SCN9A、G6PD、TRPA1、HRH4等20個(gè)靶點(diǎn)為交集靶點(diǎn)，即蛇床子揮發(fā)油發(fā)揮止癢作用的核心靶點(diǎn)。（見圖2）

圖2 蛇床子揮發(fā)油成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)Venny圖

2.4 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析選擇STRING數(shù)據(jù)庫中的Multiple proteins，輸入交集靶點(diǎn)信息，獲取靶點(diǎn)蛋白之間相互作用關(guān)系，通過結(jié)果分析得到節(jié)點(diǎn)數(shù)為20、邊數(shù)為54的網(wǎng)絡(luò)圖。進(jìn)一步對PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使節(jié)點(diǎn)大小和顏色隨Degree值變化，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深（藍(lán)色）說明該節(jié)點(diǎn)Degree值越大，則該節(jié)點(diǎn)為重要靶點(diǎn)。（見圖3）從圖中可以得出蛇床子揮發(fā)油中發(fā)揮止癢作用排名靠前的靶點(diǎn)依次為前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、表皮生長因子受體（EGFR）、胱天蛋白酶3（CASP3）、雌激素受體1（ESR1）、ATP依賴性轉(zhuǎn)位酶ABCB1（ABCB1）、細(xì)胞色素p4501A1（CYP1A1）、瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族V成員1（TRPV1）等，說明這幾個(gè)靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)度大，即為重要靶點(diǎn)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析利用David數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”分別對生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）3個(gè)部分進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選，對富集蛋白靶點(diǎn)較多的條目進(jìn)行分析，以了解靶點(diǎn)蛋白的GO生物學(xué)富集過程。通過結(jié)果分析可知，在關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的生物過程上主要是富集于對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控（negative regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter）、氧化還原過程（oxidation-reduction process）、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控（negative regulation of cell proliferation）等方面；在細(xì)胞組成上主要富集在核（nucleus）、核質(zhì)（nucleoplasm）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（endoplasmic reticulum membrane）、細(xì)胞表面（cell surface）、膜筏（membrane raft）、細(xì)胞器膜（organelle membrane）、分泌顆粒（secretory granule）等方面；在分子功能上主要富集于酶結(jié)合（enzyme binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、類固醇結(jié)合（steroid binding）、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding）、序列特異性DNA結(jié)合（sequence-specific DNA binding）等方面。（見圖4）

圖4 GO功能富集分析網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 KEGG通路富集分析利用David數(shù)據(jù)庫對成分-疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共富集出9個(gè)結(jié)果。蛇床子揮發(fā)油發(fā)揮止癢作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要通過調(diào)控雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路（Neuroactive ligand-receptor interaction）、癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、癌癥中的微小RNA（MicroRNAs in cancer）等通路發(fā)揮療效。（見表2、圖5）

表2 KEGG通路富集結(jié)果

圖5 KEGG通路分析氣泡圖

2.7 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Excel對前期所得的成分、靶點(diǎn)及通路數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，將所得文件導(dǎo)入到Cytoscape中進(jìn)行可視化分析，見圖6。蛇床子揮發(fā)油中主要潛在活性成分為α-蒎烯、β-羅勒烯、芳樟醇、順二氫香芹酮、乙酸橙花酯、α-胡椒烯、β-紅沒藥烯等。關(guān)鍵靶點(diǎn)為PTGS2、EGFR、CASP3、ESR1、ABCB1、CYP1A1等，并與多個(gè)潛在活性成分有著密切關(guān)聯(lián)。潛在靶點(diǎn)主要調(diào)控神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、雌激素信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、癌癥中的微小RNA等通路，從而揭示了蛇床子揮發(fā)油是通過多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)通路共同發(fā)揮止癢的藥效機(jī)制。

圖6 藥物-成分-靶點(diǎn)-主要通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.8 分子對接通過Pubchem數(shù)據(jù)庫下載關(guān)聯(lián)度排名靠前的潛在活性成分β-細(xì)辛腦、α-胡椒烯、L-龍腦、β-紅沒藥烯、β-芹子烯的spf格式文件，在Chemdraw軟件中打開并獲取其3D結(jié)構(gòu)，另存為mol 2文件。根據(jù)Dgree值將靠前的靶點(diǎn)導(dǎo)入PDB數(shù)據(jù)庫，下載其數(shù)據(jù)文件。將得到的靶蛋白文件導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行去水、加氫等操作后，下載處理后的靶蛋白及其配體的pdb文件。通過AutoDockTools-1.5.6對處理后的潛在活性成分和靶蛋白進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果見表3。通過分子對接，發(fā)現(xiàn)CYP1A1靶點(diǎn)與β-細(xì)辛腦、β-紅沒藥烯、β-芹子烯結(jié)合力分別均大于7.0 kcal/mol說明CYP1A1與3種成分具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。將其他關(guān)聯(lián)度高的成分與靶蛋白分別進(jìn)行分子對接，通過篩選將有一定結(jié)合力的成分-靶蛋白組合導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行可視化分析，對接后的三維結(jié)構(gòu)見圖7。

表3 分子對接結(jié)果

圖7 分子對接三維結(jié)構(gòu)圖

3 討 論

本研究采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對蛇床子揮發(fā)油類成分進(jìn)行了分析鑒定，得到15種化合物，其中β-紅沒藥烯、芳樟醇、α-胡椒烯含量最高。β-紅沒藥烯是一種抗腫瘤化合物，對乳腺癌等具有抑制作用；芳樟醇具有抗菌、抗炎等作用[11]，常被用于殺蟲止癢；α-胡椒烯具有抗腫瘤、抗炎活性[12]，進(jìn)一步證實(shí)了蛇床子揮發(fā)油成分在抗炎、抗腫瘤、止癢等方面的活性作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對蛇床子中揮發(fā)油成分進(jìn)行篩選，最終得到14種化合物，獲得191個(gè)成分靶點(diǎn)；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到瘙癢癥相關(guān)靶點(diǎn)897個(gè)，皮膚過敏癥相關(guān)靶點(diǎn)790個(gè)。將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)通過蛋白-蛋白相互作用得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，關(guān)聯(lián)最多的靶點(diǎn)為PTGS2、EGFR、CASP3、ESR1、ABCB1、CYP1A1等，這些可能是蛇床子揮發(fā)油發(fā)揮止癢作用的主要靶點(diǎn)。其中PTGS2為前列腺素G/H合酶2，參與前列腺素生物合成途徑，主要在炎癥方面發(fā)揮作用；EGFR為表皮生長因子受體，在炎癥性皮膚病中，EGFR基因的缺少或丟失起著關(guān)鍵作用[13]。

在KEGG富集分析中，蛇床子揮發(fā)油通過關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)控雌激素信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥中的蛋白多糖、癌癥中的微小RNA等通路發(fā)揮療效。雌激素信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)[14]，在老年性陰道炎的治療中通過調(diào)節(jié)雌激素，改善陰道內(nèi)菌群微環(huán)境減輕炎癥引起的瘙癢[15]。神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路參與多種神經(jīng)遞質(zhì)及其受體傳遞，蛇床子揮發(fā)油成分通過在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用從而參與瘙癢過程[16]。

在分子對接研究中，CYP1A1與蛇床子揮發(fā)油主要成分結(jié)合力較強(qiáng)。CYP1A1在自身免疫性疾病和過敏性皮膚炎癥中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)CYP1A1可以激活皮膚中的AHR通路產(chǎn)生抗炎作用[17]。研究表明TRPV1參與組胺依賴性瘙癢癥，TRPV1能夠被花生四稀酸類、組胺等多種介質(zhì)激活，在瘙癢性疾病及皮膚神經(jīng)源炎癥產(chǎn)生重要影響[18]。ABCB1參與各種皮膚病的發(fā)病機(jī)制，范圍從皮膚惡性腫瘤到炎癥性皮膚病[19]。分子對接研究結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了蛇床子揮發(fā)油治療瘙癢的機(jī)制是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同起效的。

本研究通過GC-MS技術(shù)鑒定出蛇床子揮發(fā)油中15種成分，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行篩選最終從蛇床子揮發(fā)油中得到14個(gè)潛在活性成分；通過構(gòu)建Venny圖得到成分-疾病交集的20個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)一步通過KEGG富集分析得到9條關(guān)鍵通路，其中α-蒎烯、β-羅勒烯、β-紅沒藥烯等潛在活性成分與PTGS2、CASP3、ABCB1、CYP1A1等關(guān)鍵靶點(diǎn)通過調(diào)控雌激素信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路等通路發(fā)揮藥效的相互作用關(guān)系，通過分子對接進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明蛇床子揮發(fā)油中主要成分β-紅沒藥烯、α-胡椒烯與ABCB1、CYP1A1等關(guān)鍵靶點(diǎn)之間結(jié)合力較強(qiáng)，從而驗(yàn)證了預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。在下一步研究中，筆者將對得到的潛在活性成分與信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究，從而為蛇床子的開發(fā)利用與合理用藥提供指導(dǎo)。