楊曉曉,柳毅浩,王成偉,牛浩一,王金武,2
(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院,上海 200011;2.上海交通大學生物醫(yī)學工程學院,上海 200030)
皮膚覆蓋全身,是保護各種組織和器官免受物理、機械、化學和病原微生物侵害的天然屏障[1-2]。正常情況下,皮膚表面呈酸性,pH值約為4~6。傷口微環(huán)境的pH值反映和影響了傷口愈合過程中許多基本的生理和生化過程,是傷口護理中治療干預的一個重要參數[3]。慢性、感染性傷口微環(huán)境pH值呈堿性,pH值高于7.3[4]。已有研究利用慢性傷口pH值變化的特點制備pH值響應性藥物釋放敷料[5-6]。軍事沖突導致的創(chuàng)傷感染率高達27%[7],包括皮膚及深部組織的感染;其中開放型骨折的并發(fā)感染率約為7.6%[8]。傷口感染常導致膿毒血癥、傷口慢性愈合等并發(fā)癥,加重患者的痛苦,降低患者的生活質量,且增加其他并發(fā)癥的風險,給患者和醫(yī)療系統(tǒng)帶來極大的衛(wèi)生與經濟負擔。同時,人口老齡化的加劇及糖尿病等慢性疾病的增多使醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)面臨著巨大的考驗,急劇增加治療負擔,對公共衛(wèi)生持續(xù)造成重大威脅。筆者采用抗菌肽ε-L-聚賴氨酸(ε-L-polylysine,PLL)與聚乙二醇二縮水甘油醚(polyethylene glycol diglycidyl ether,PEGDGE)通過共價鍵交聯制成PEGDGE/PLL復合物(PP)的凝膠顆粒,再根據酚紅(phenol red,PR)酸堿指示劑的特點,通過靜電吸附,與正電性PP形成PRPP復合物凝膠顆粒,通過PRPP復合物的顏色變化直觀地監(jiān)測傷口愈合過程。同時,PRPP復合物與中藥活性成分配伍組方,協同發(fā)揮抗菌抗炎活性。本研究為感染傷口的治療及傷口愈合過程監(jiān)測的醫(yī)產品的開發(fā)提供了新思路和實驗數據。
1.1 藥物與試劑ε-L-聚賴氨酸(國藥集團化學試劑有限公司,分子量5 000,純度95%);聚乙二醇二縮水甘油醚(國藥集團化學試劑有限公司,分子量6 000,純度99%);綠原酸(中國食品藥品檢定研究院,批號:110753-201415,含量≥98%);黃連堿(中國食品藥品檢定研究院,批號:110713-201206,含量≥98%);黃芩苷(中國食品藥品檢定研究院,批號:110715-200514,含量≥98%);去離子水(實驗室自制)。
1.2 主要儀器SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州艾克林凈化設備有限公司);3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司);TS2型倒置顯微鏡(上海衡浩儀器有限公司);AG135型分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)公司];XKA-2200型低度冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);HH-600型數顯恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司);800TS型酶標儀(Bio Tek公司);S400-B型pH計(梅特勒-托利多公司);Scientz-10ND型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Tensor 27和MIRacle ATR FT-IR型光譜儀(Bruker Optics公司);Cary100紫外-可見分光光度計(美國VARIAN公司)。
1.3 菌種及細胞株金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aurues,ATCC 25923,南京便診生物科技有限公司);人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-CS,中國科學院昆明動物研究所);小鼠成纖維細胞(L929,武漢普諾賽生命科技有限公司)。
2.1 PRPP復合物凝膠顆粒的制備本實驗通過溫和的開環(huán)反應制備PP高吸水性樹脂。首先將分子量〈5 000的PLL透析去除雜質和分子量小于3 500的短鏈分子,然后凍干、收集透析后的PLL,使其溶于去離子水配制50%(m/V)PLL溶液,調節(jié)pH值至10.0。分別將0.4、0.6 mL PEGDGE加入2 mL上述PLL溶液中,振蕩器震蕩10 s確保均勻混合后在靜置于60℃水浴鍋中。反應2 h后,收集PP,在大量去離子水中浸泡24 h,且每8 h更換一次去離子水,以去除未交聯的PLL和PEGDGE,將上述制備的樣品冷凍干燥,備用,計算凝膠分數(Gelcontent,G),公式如下:
其中,m1為PLL質量(g),m2為PEGDGE質量(g),m3為PP質量(g)。
隨后于室溫下分別浸泡于質量濃度為1 mg/mL的PR溶液中靜置2 h以制備PRPP。大量去離子水洗滌PRPP樣品5次后,繼續(xù)浸泡于去離子水中24 h,冷凍干燥并收集樣品備用。
2.2 PRPP復合物凝膠顆粒的性能評估
2.2.1 紅外光譜檢測 采用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)檢測,通過特征峰觀察,分析PRPP樣品中無PEGDGE殘留,評價檢測PLL和PEGDGE的交聯情況。
2.2.2 溶脹率測定 參考YUAN H C等[9]所報道的方法對常溫下PRPP在去離子水和PBS中的溶脹性能進行了評估。在微量離心管中預先稱重約10 mg樣品,空離心管質量記為m0,加入樣品后離心管總質量記為md,加入足量去離子水和pH值為7.4的PBS,并于室溫靜置1 h。隨后,小心吸出殘留的去離子水或PBS。最后,測量溶脹樣品與離心管的總質量并記錄為mw。計算溶脹率(Sw),公式如下:
其中,m0為離心管質量(g),md為離心管與初始樣品總質量(g),mw為離心管與溶脹樣品總質量(g)。
2.2.3 PRPP顯色反應 依次配制pH值分別5、6、7、8和9的PBS緩沖液1 mL,分別稱取1 mg PRPP放入緩沖液中,觀察不同pH值下PRPP顏色變化情況。
2.2.4 生物相容性 為了評估PRPP對細胞活力的影響,本研究使用HUVEC-CS和L929細胞作為模型細胞進行CCK-8測試。該實驗通過使用材料浸提液與未接觸材料的DMEM完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細胞,比較各組材料是否具有細胞毒性。首先,將2 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基與10 mg樣品混合,37℃靜置24 h獲得浸提液。在96孔板每孔中加入含8 000個HUVEC或L929的細胞懸液100 μL,于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。隨后,將普通DMEM培養(yǎng)基替換為浸提液,對照組僅用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。在設定的時間點12、24和48 h通過CCK-8測試評估細胞活力,每組重復測試4次。
2.3 綠原酸與PRPP配伍體外抗菌活性考察體外抗菌性能試驗以S.aurues作為模型細菌。將S.aurues接種到新鮮的MH肉湯中,37℃恒溫搖床孵育6~8 h后,使用分光光度計在625 nm處計數細菌懸液,并稀釋至最終濃度約為1×107CUF/mL。隨后,將50 μL PBS或質量濃度為2、4和8 mg/mL的綠原酸PBS溶液與50 μL菌液混合后,滴加在48孔板中或預先紫外滅菌的各組樣品表面,每組樣品10 mg。于37℃,濕度90%的培養(yǎng)箱中共同孵育2 h后每組加入0.9 mL無菌PBS,在超聲清洗儀中震蕩10 min使細菌重懸于PBS中,并以無菌PBS梯度稀釋上述重懸菌液,取100 μL涂布于MH瓊脂平板上培養(yǎng)8~24 h后計數細菌菌落。每組重復3次,計算抗菌率(antibacterial rate,AR)。
其中,Cr、Cs分別代表空白對照組菌落計數和樣品組菌落計數。
3.1 PRPP復合物凝膠顆粒的制備PRPP復合物凝膠顆粒制備結果見表1。隨著PEGDGE的增加,PRPP復合物凝膠顆粒的凝膠分數增加,說明隨著PEGDGE的增加,其交聯程度同樣增加,故得到的PRPP復合物凝膠重量也上升;同時可以發(fā)現不同比例PEGDGE所制備的PRPP復合物凝膠均能很好的吸附PR。
表1 PRPP樣品制備
3.2 PRPP復合物凝膠顆粒的性能評估結果
3.2.1 紅外光譜分析PRPP凝膠的FT-IR譜圖見圖1。在C-O特征峰1100 cm-1處,PRPP1-3透過率依次減小,提示隨著PEGDGE比例增加,來源于PEG的醚基團增加,說明其交聯程度隨PEGDGE的增加而增加。1 540 cm-1與1 650 cm-1處為PPL的特征峰,此外,未觀察到環(huán)氧環(huán)峰,反映PRPP樣品中無PEGDGE殘留[10]。
圖1 PRPP水凝膠的FT-IR譜圖
3.2.2 溶脹率水凝膠作為一種理想的創(chuàng)面敷料材料,其吸收和保存液體的能力是評價其效果的一個重要方面,凝膠的溶脹率是評價凝膠吸收液體能力的重要指標。PRPP在PBS與去離子水中的溶脹率見表2。結果顯示,PRPP在PBS緩沖溶液的溶脹率為(1 224.6±74.0)%~(1 900.7±145.3)%,在去離子水中的溶脹率為(2 495.4±423.0)%~(4 597.0±278.1)%,說明PRPP凝膠具有很好的吸水性;PRPP凝膠在PBS緩沖溶液中的溶脹率小于在去離子水中的溶脹率,這是PBS緩沖溶液中多種離子對其造成的影響;此外,隨著PEGDGE的增加,PRPP凝膠的溶脹率逐步減小,這是因為PEGDGE與PPL形成的氫鍵增加,導致其交聯程度升高,從而使溶脹率下降。
表2 PRPP在PBS與去離子水中的溶脹率(±s,n=3)
表2 PRPP在PBS與去離子水中的溶脹率(±s,n=3)
溶劑 PRPP1 PRPP2 PBS 1 900.7±145.3 1 224.6±74.0去離子水 4 597.0±278.1 2 495.4±423.0
3.2.3 PRPP顯色反應2種PRPP凝膠在不同pH值下的顏色變化如圖2所示。不同pH值下PRPP凝膠顏色發(fā)生顯著變化,當pH值=5或6時,PRPP凝膠顯示黃色,當pH值=7時,PRPP凝膠顯示橙色,當pH值=8或9時,PRPP凝膠顯示紫紅色。正常人體皮膚呈酸性(pH值=4~6),慢性、感染性傷口微環(huán)境pH值呈堿性(pH值〉7.3),PRPP凝膠的變色范圍涵蓋人體皮膚受傷前后的pH值變化,提示PRPP凝膠能很好地反映傷口的愈合情況。
圖2 PRPP顯色反應
3.2.4 生物相容性2種PRPP凝膠的浸提液對HUVEC-CS和L929的細胞毒性見圖3。結果顯示,2種PRPP凝膠的浸提液在12、24和48 h內對HUVEC-CS和L929基本無細胞毒性,除PRPP1外,PRPP2對兩種細胞的增殖還具有很好的促進作用,提示PRPP凝膠能促進傷口愈合,加速患者傷口恢復。
圖3 PRPP浸提液對HUVEC-CS和L929的細胞毒性
3.3 中藥活性成分配伍PRPP凝膠劑性狀中藥活性成分中,黃連堿和黃芩苷均具有一定的顏色,在不同pH值條件下,對PRPP凝膠的顏色變化有一定的干擾,使其顏色變化不顯著,容易影響對傷口愈合程度的判斷;此外,黃連堿和黃芩苷在水中的溶解度極低,在PRPP凝膠中有部分析出,導致凝膠整體渾濁,影響其外觀和使用;而綠原酸本身無色,同時溶解度較好,對PRPP的性質并無影響,能很好地協調起效,故中藥活性成分選取綠原酸。
表3 中藥活性成分配伍PRPP制得凝膠敷料的基本信息
3.4 體外抗菌活性綠原酸、PRPP1及PRPP2對S.aurues的抑菌率如圖4所示。未聯用PRPP時,1、2、4 mg/mL綠原酸溶液抗菌率分別為(88.7±4.0)%、(90.4±2.5)%、(93.6±1.4)%。PRPP的抗菌率均在99%以上,說明PRPP凝膠具有較好的抑菌效果。當PRPP2配伍2、4 mg/mL綠原酸時,抗菌率較單用PRPP2顯著提高(P〈0.01)。說明中藥活性成分配伍PRPP凝膠能更好地抑制傷口細菌生長,對傷口愈合有重要作用。
圖4 PRPP聯合綠原酸抗菌率(aP〈0.01,bP〈0.001,cP〈0.001)
本研究合成了pH值指示比色PLL/PEGDGE水凝膠復合物,在此基礎上,與中藥活性物質配伍,開發(fā)一款用于創(chuàng)面抗菌消炎和監(jiān)控傷口微環(huán)境pH值變化的凝膠敷料。其中,PLL是一種鏈霉菌合成的抗菌肽,可通過發(fā)酵工程大量制備,其抗菌譜廣,對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有殺傷作用[11]。同時,作為陽離子殺菌劑,PLL對細菌細胞膜和動物細胞膜具有高度的選擇性,在質量濃度為2 mg/mL時對人真皮成纖維細胞無毒性[12],生物相容性佳。在2003年和2014年,國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家衛(wèi)生健康委員會已經批準使用PLL作為食品添加劑[13]。研究發(fā)現具有雙環(huán)氧功能團的甘油醚類具有促進蛋白質交聯的作用效果,雙環(huán)氧交聯劑能夠通過與酶和載體的氨基等反應形成共價鍵,輔助酶固定化[14]。徐珊等[15]利用乙二醇縮水甘油醚進行包埋固定化脂肪酶,得到的固定化酶最適反應溫度和最適pH值均有提高;錢明華等[16]利用PEGDGE交聯大孔樹脂HPD750固定化脂肪酶,在60℃保溫7 h,固定化酶活力保留約72%,保存穩(wěn)定性也表現優(yōu)異。本實驗利用PEGDGE通過共價鍵交聯具有氨基的PLL,制成PEGDGE交聯PLL的復合物PP凝膠顆粒,提高PLL的穩(wěn)定性和療效的發(fā)揮。PR是一種常用的酸堿指示劑,在臨床上,常用于尿路感染、胃黏膜幽門螺桿菌感染、淚液分泌等相關檢測[17-20],根據酚紅在不同pH值條件下,顏色發(fā)生變化(pH值〈6.6顯黃色,pH值為6.6~8.0顯橙色,pH值為8.4顯紅色),在一定生理pH值條件下呈負電性等性質,通過靜電吸附,將PR加入帶正電荷的PP中,制成PRPP復合物,不僅可以發(fā)揮PLL的抗菌活性,也可有效固定PR。同時,酚紅顏色變化與慢性或感染傷口的pH值范圍相匹配,通過PRPP復合物的顏色變化可直觀地監(jiān)測傷口愈合過程,以及細菌感染程度和治療效果。
本實驗在制得PRPP復合物凝膠的基礎上,優(yōu)選廣譜抗菌中藥金銀花、黃連和黃芩,以各味藥材中主要活性成分綠原酸、黃連堿和黃芩苷為研究對象,與PRPP復合物制成凝膠敷料,最終確定無顏色、水溶性較好的綠原酸為中藥活性成分添加。與陽離子殺菌劑的抗菌原理不同,綠原酸通過改變膜電位從而影響細菌能量代謝并使其累積大量活性氧[21-22],因此綠原酸有望協同陽離子殺菌劑提高抗菌效果。體外抑菌實驗顯示,加入綠原酸可顯著提高PRPP復合物的抗菌活性,能更好地抑制傷口細菌感染,促進傷口愈合。本實驗制備的PRPP復合物凝膠具有結構多孔,力學性能優(yōu)良,溶脹率高、保濕性強等優(yōu)點。此外,中藥活性成分的添加,提高了凝膠的抑菌能力,有利于傷口恢復,該中藥活性成分協同PRPP復合物制備的抗菌凝膠有望作為一種理想的醫(yī)用水凝膠敷料,用于慢性傷口的護理,同時為感染傷口的治療和傷口愈合過程監(jiān)測醫(yī)用產品的開發(fā)提供了新思路。