丁 茹，李 煜，張 毅，王麗芳，張方博，楊洪軍

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.陜西健民制藥有限公司，咸陽(yáng) 陜西 712000；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700）

腦卒中屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，因氣虛致血瘀，氣虛無(wú)力行血，損傷大腦。氣虛是病理基礎(chǔ)，益氣活血是基本治則，益氣活血和化瘀通絡(luò)為基本治法，可通過(guò)補(bǔ)氣化瘀促進(jìn)血液運(yùn)行，抑制血栓形成，拮抗腦組織損傷，改善神經(jīng)功能，提高臨床療效[1]。蛭蛇通絡(luò)膠囊由人參、黃芪、天麻、丹參、紅花、葛根、川芎、石菖蒲、郁金、水蛭、冰片及烏梢蛇等組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、開(kāi)竅醒神、活血化瘀、祛風(fēng)通絡(luò)等功效。蛭蛇通絡(luò)膠囊可增加腦血流量和腦組織供氧，改善腦部缺血的狀態(tài)，恢復(fù)腦功能，常用于中風(fēng)病、口舌歪斜、氣短乏力等病癥，臨床研究表明蛭蛇通絡(luò)膠囊為治療腦梗死恢復(fù)期的有效復(fù)方[2]。

氧化應(yīng)激（oxidative stress）是細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成與清除處于失衡狀態(tài)，過(guò)多的ROS對(duì)細(xì)胞造成損傷，并促發(fā)后續(xù)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。氧化應(yīng)激性損傷參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3]，如心腦血管病、癌癥、慢性代謝性疾病等，正常情況下，機(jī)體的抗凝和促凝處于動(dòng)態(tài)平衡，若失衡則引發(fā)出血或血栓[4]。缺血性腦卒中時(shí)腦血管栓塞或血栓形成，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，無(wú)法清除，使凝血因子聚集并激活，凝血系統(tǒng)亢進(jìn)，呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，引起抗凝、凝血和纖溶水平變化[5]。臨床研究表明，與健康受檢者相比，腦卒中患者的凝血指標(biāo)明顯升高，疾病嚴(yán)重程度不同，其凝血功能改變情況不同；凝血功能紊亂越嚴(yán)重，病情也越嚴(yán)重，預(yù)后越差；積極的抗凝治療可改善患者預(yù)后[6]。

基于氧化應(yīng)激和凝血狀態(tài)在腦卒中發(fā)病機(jī)制中的重要性，本研究采用“腸吸收液-體外藥理活性”結(jié)合拆方對(duì)蛭蛇通絡(luò)膠囊清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH）自由基的抗氧化作用，以及凝血四項(xiàng)和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)血小板凝集的抗凝作用等兩方面進(jìn)行解析，觀察其對(duì)氧化應(yīng)激和凝血作用的影響，定位其發(fā)揮抗氧化和抗凝的主要組分，以辨識(shí)蛭蛇通絡(luò)膠囊的有效成分，并闡明其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞10周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠15只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：1103222011009337。實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并審核通過(guò)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物房，溫度20～22℃，相對(duì)濕度為40%～70%，換氣次數(shù)15次/h，確保大鼠自由飲食飲水。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（human neuroblastoma cells）SH-SY5Y購(gòu)于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物及試劑根據(jù)蛭蛇通絡(luò)膠囊制備的工藝路線(xiàn)，分為4個(gè)受試藥物樣本，樣本1為人參、黃芪、天麻、丹參和葛根等制得的浸膏，樣本2為水蛭、烏梢蛇和紅花等制得的浸膏，樣本3為川芎、郁金和石菖蒲等制得的浸膏，樣本4為合并以上3種浸膏制得，均由陜西健民制藥有限公司提供。氮自由基（DPPH）清除能力測(cè)定試劑盒（批號(hào)：57941）購(gòu)于上?；菡\(chéng)生物科技有限公司；凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）試劑盒（批號(hào)：STY20101-3B）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）試劑盒（批號(hào)：STY20201-20-1）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）試劑盒（批號(hào)：STY20301-43）和纖維蛋白原含量（fibrinogen，F(xiàn)IB）試劑盒（批號(hào)：STY20401-5）均購(gòu)于泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司；二磷酸腺苷（ADP）（批號(hào)：1123F021）、阿司匹林（aspirin）（批號(hào)：422G013）；戊巴比妥鈉（批號(hào)：811B025）、無(wú)菌D-Hank’s液（批號(hào)：20190929）、依達(dá)拉奉（edaravone）（批號(hào)：629A026）、高效RIPA組織裂解液（批號(hào)：20200915）和青鏈霉素（100×）（批號(hào)：20190317）均購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：8119221）、無(wú)菌中性磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（批號(hào)：8119312）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（批號(hào)：2036226）、非必需氨基酸NEAA溶液（non-essential amino acids，100×）（批號(hào)：2074167）和0.25%胰酶-EDTA（批號(hào)：1869505）均購(gòu)于美國(guó)Gibico公司；CCK-8溶液（批號(hào)：N20072709）購(gòu)于新賽美生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號(hào)：20201012）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)：20200702）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)：20201230）均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；生理鹽水（批號(hào)：1807023205）購(gòu)于石家莊四藥有限公司；C-1厭氧產(chǎn)氣袋和C-22氧氣指示劑購(gòu)于日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社。

1.3 主要儀器ALC-M型組織-器官水浴系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；ALC-CWB型數(shù)控恒溫循環(huán)水槽（上海奧爾科特生物科技有限公司）；5452R型低溫超高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Becton-Dickinson公司）；SC40 LG-PABER-I型血小板凝集及凝血因子分析儀（北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司）；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；C-31型厭氧培養(yǎng)盒（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）。

2 方 法

2.1 腸吸收液的制備實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，頸部脫臼處死，沿腹中線(xiàn)剪開(kāi)皮膚和肌肉。找出胃幽門(mén)，自幽門(mén)以下10 cm開(kāi)始截取腸段并沖洗干凈。將硅膠套管的一端插入腸管中，將腸道內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)，用細(xì)線(xiàn)結(jié)扎；然后用0℃Tyrode緩沖液沖洗腸段內(nèi)表面，將另一端用線(xiàn)結(jié)扎，確保不漏液。量取25 mL各受試藥物供試液，如加入Tyrode緩沖液為空白腸吸收液，預(yù)先將其加入麥?zhǔn)显」苤?，同時(shí)通入95% O2和5% CO2的混合氣體，開(kāi)啟37℃恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)。用注射器吸取2 mL Tyrode緩沖液，注入腸管中，然后將其置于麥?zhǔn)显」苤小? h后收集腸管內(nèi)液體，0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾分裝，-20℃保存待用。

2.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（空白腸吸收液組），3個(gè)組分和全方的低劑量組（1.25 mg/mL）、中劑量組（2.50 mg/mL）和高劑量組（5.00 mg/mL），以及維生素C組（Vit C，10.00 μg/mL）。吸取各樣品100 μL于96孔板，加入100 μL DPPH溶液，混勻后室溫避光30 min，517 nm處測(cè)定吸光值（A）。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以空白腸吸收液為空白對(duì)照（A0），各樣品與DPPH溶液為測(cè)定樣品（A1），各樣品與樣品稀釋液為對(duì)照樣品（A2），則樣品吸光度為A（A1～A2）。清除率計(jì)算公式：清除率（%）=（A0-A）/A0×100%。

2.3 凝血四項(xiàng)凝血四項(xiàng)為活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（FIB）。戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉抗凝，3 000 r/min離心10 min，吸取上清。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（空白腸吸收液組），3個(gè)組分和全方的低劑量組（1.25 mg/mL）、中劑量組（2.50 mg/mL）和高劑量組（5.00 mg/mL），以及阿司匹林組（0.25 mg/mL），每組4個(gè)樣本。將血清與不同藥物共同作用20 min，按試劑盒操作說(shuō)明加入其他試劑，上機(jī)檢測(cè)。

2.4 ADP誘導(dǎo)血小板凝集戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉抗凝。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（空白腸吸收液組），3個(gè)組分和全方的低劑量組（1.25 mg/mL）、中劑量組（2.50 mg/mL）、高劑量組（5.00 mg/mL），以及阿司匹林組（0.25 mg/mL），每組4個(gè)樣本。800 r/min離心10 min，吸取上層富血小板血漿（PRP）。將下層沉淀再次行2 000 r/min離心10 min，取上清，為貧血小板血漿（PPP）。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，PRP最適數(shù)目為（200～250）×109/L。將270 μL PRP與30 μL不同藥物作用20 min，上機(jī)預(yù)熱5 min，加入ADP 10 μL，終濃度10 μmol/L，比濁法測(cè)定誘導(dǎo)血小板PRP聚集所需要的時(shí)間（s）和百分率。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)至密度接近80%左右時(shí)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，培養(yǎng)于含有10% FBS、青鏈霉素及多種非必需氨基酸（NEAA）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6 氧糖剝奪模型與實(shí)驗(yàn)分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化離心重懸后，將1.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞混懸液分別接種于96孔板中，每孔100 μL。第2天貼壁生長(zhǎng)后，吸去培養(yǎng)液，PBS液輕柔漂洗2遍，換為無(wú)糖D-Hank’s液，放入C-31厭氧培養(yǎng)盒中，進(jìn)行氧糖剝奪。共分為以下4組：正常對(duì)照組不做任何處理；OGD模型組按上述步驟進(jìn)行氧糖剝奪；蛭蛇通絡(luò)膠囊3個(gè)組分組、全方組和依達(dá)拉奉組分別用不同濃度全方、3個(gè)組分腸吸收液（4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.625、0.312 5 mg/mL）、依達(dá)拉奉（6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mmol/L）預(yù)處理24h，再進(jìn)行氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）。

2.7 細(xì)胞存活率氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每孔加入CCK-8溶液10 μL，搖床振蕩混勻，放入培養(yǎng)箱孵育2 h。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度（OD）值，計(jì)算存活率。存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。

2.8 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)結(jié)束，PBS液洗滌2次，加入高效RIPA組織裂解液，收集各組細(xì)胞，4℃，15 000 r/min離心15 min，取上清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀在相應(yīng)波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)LDH、SOD和MDA的水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組分及全方腸吸收液的制備結(jié)果根據(jù)蛭蛇通絡(luò)膠囊的制備工藝路線(xiàn)，人參、黃芪、天麻、丹參和葛根等用10倍體積60%乙醇提取2次，合并提取液并過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓濃縮得到浸膏1，由其制備的腸吸收液為組分1；水蛭、烏梢蛇和紅花等用10倍體積水提取2次，合并提取液并過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓濃縮得到浸膏2，由其制備的腸吸收液為組分2；川芎、郁金和石菖蒲經(jīng)水蒸氣蒸餾提取4 h，濾液經(jīng)減壓濃縮得到浸膏3，由其制備的腸吸收液為組分3；將以上3種浸膏合并，加乙醇至含醇量60%，靜置沉淀24 h，濾過(guò)回收并濃縮制得浸膏4（不含冰片和揮發(fā)油），由其制備的腸吸收液為全方4。以上4個(gè)受試組分腸吸收液的生藥質(zhì)量濃度均為170.0 mg/mL。

3.2 各組分及全方對(duì)DPPH自由基清除的影響與空白對(duì)照組比較，3個(gè)組分及全方均有DPPH自由基清除作用，強(qiáng)弱順序?yàn)槿健到M分1〉組分2〉組分3。全方的清除作用最強(qiáng)，全方低、中、高劑量組DPPH自由基清除率分別為（59.02±1.70）%、（61.99±2.43）%和（77.56±7.73）%；其次為組分1，組分1低、中、高劑量組清除率分別為（65.21±2.85）%、（68.82±5.65）%和（74.40±5.62）%；組分2低、中、高劑量組清除率分別為（36.37±6.97）%、（40.72±4.66）%和（46.50±6.27）%；組分3的清除作用最弱，組分3低、中、高劑量組清除率分別為（7.06±2.56）%、（7.47±6.75）%和（9.28±8.11）%。Vit C（10 μg/mL）具有DPPH自由基清除作用，維生素組清除率為（15.14±2.49）%。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組分及全方對(duì)DPPH自由基清除的影響（±s，n=9）

3.3 各組分及全方對(duì)凝血四項(xiàng)的影響各組分及全方各劑量組ATPP、PT比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）?？瞻讓?duì)照組FIB水平為（1.50±0.23）g/L，與空白對(duì)照組比較，3個(gè)組分及全方的低、中、高劑量均可降低FIB水平，以全方效果最佳。全方低、中、高劑量組FIB水平分別為（1.12±0.03）、（0.96±0.09）、（0.70±0.06）g/L；其次為組分2，組分2低、中、高劑量組FIB水平分別為（1.02±0.12）、（0.99±0.18）、（0.96±0.21）g/L。（見(jiàn)圖2）

空白對(duì)照組TT為（22.26±0.32）s，與空白對(duì)照組比較，組分1中、高劑量，組分2高劑量，以及全方低、中、高劑量均可延長(zhǎng)TT；以全方效果最佳，全方低、中、高劑量組TT分別為（24.13±0.49）、（25.26±1.22）、（29.90±0.95）s；組分1中、高劑量組TT分別為（23.90±0.36）、（25.06±1.16）s；組分2高劑量組TT為（24.93±1.10）s。阿司匹林可降低FIB的水平[（1.09±0.05）g/L]，并延長(zhǎng)APTT[（17.70±0.36）s]和TT[（24.33±0.83）s]。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組分及全方對(duì)凝血四項(xiàng)的影響（±s，n=4）

3.4 各組分及全方對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板凝集的影響空白對(duì)照組血小板凝集率為（47.97±1.66）%，與空白對(duì)照組比較，組分1中、高劑量，組分2低、中、高劑量和全方低、中、高劑量可抑制ADP誘導(dǎo)血小板凝集，以全方抑制效果最佳。全方低、中、高劑量組凝集率分別為（39.55±3.83）%、（30.92±5.60）%、（24.25±5.42）%；其次為組分2，組分2低、中、高劑量組凝集率分別為（41.00±4.33）%、（30.25±4.27）%、（23.92±4.79）%；組分1中、高劑量組凝集率分別為（35.22±3.83）%、（27.47±2.18）%；組分3無(wú)抑制ADP誘導(dǎo)血小板凝集的作用。阿司匹林也可抑制ADP誘導(dǎo)的血小板凝集，阿司匹林組凝集率為（29.57±3.51）%。（見(jiàn)圖3）

圖3 各組分及全方對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板凝集的影響（±s，n=4）

3.5 氧糖剝奪時(shí)間的確定

3.5.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 正常對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈兩極或多極，細(xì)胞突起明顯，細(xì)胞間相互交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞膜光滑完整，胞體透明，折光性較強(qiáng)。氧糖剝奪細(xì)胞間隙變大，部分細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞質(zhì)凝聚，細(xì)胞突起明顯減少，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞團(tuán)脫落，胞體折光性下降，部分細(xì)胞裂解成碎片。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞間隙越大，貼壁細(xì)胞的數(shù)目越少，碎片越多。（見(jiàn)圖4）

圖4 SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)觀察（×200）

3.5.2 細(xì)胞生存率 使用CCK-8法檢測(cè)氧糖剝奪不同時(shí)間的細(xì)胞生存率。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，氧糖剝奪6、12、18、24 h組細(xì)胞生存率分別為（86.45±5.44）%、（74.09±2.35）%、（50.27±3.49）%、（38.65±7.28）%。本研究確定將18 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的氧糖剝奪時(shí)間。（見(jiàn)圖5）

圖5 SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪不同時(shí)間的細(xì)胞生存率（±s，n=9）

3.6 各組分及全方對(duì)氧糖剝奪SH-SY5Y細(xì)胞生存率的影響用蛭蛇通絡(luò)膠囊全方及3個(gè)組分腸吸收液不同質(zhì)量濃度（4.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.625、0.312 5 mg/mL）預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，再氧糖剝奪18 h，測(cè)定細(xì)胞存活率。與正常對(duì)照組比較，OGD模型組細(xì)胞生存率[（52.07±3.25）%]降低（P〈0.01）。與OGD模型組比較，全方的保護(hù)作用最佳，質(zhì)量濃度范圍為（0.50～0.06）mg/mL，最大細(xì)胞生存率為（76.07±10.38）%，相對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。其次為組分1，保護(hù)作用質(zhì)量濃度為（0.25～0.06）mg/mL，最大細(xì)胞生存率為（70.94±8.22）%，相對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。組分2的保護(hù)作用質(zhì)量濃度為（0.25～0.03）mg/mL，最大細(xì)胞生存率為（64.68±3.90）%，相對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL。組分3無(wú)神經(jīng)保護(hù)作用。陽(yáng)性對(duì)照藥依達(dá)拉奉也有神經(jīng)保護(hù)作用，質(zhì)量濃度范圍為（0.80～0.05）mmol/L，最大細(xì)胞生存率為（79.35±13.01）%，相對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為0.80 mmol/L。（見(jiàn)圖6）

圖6 各組氧糖剝奪SH-SY5Y細(xì)胞生存率的比較（±s，n=9）

3.7 各組分及全方對(duì)氧糖剝奪SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響與正常對(duì)照組比較，GOD模型組的細(xì)胞內(nèi)LDH釋放增多，為（61.26±22.68）U/g（P〈0.01）；SOD活性降低，為（8.48±1.94）U/mg（P〈0.01）；MDA水平升高，為（1.10±0.38）nmol/mg（P〈0.01）。與GOD模型組比較，全方及組分1的低、高劑量組均能不同程度抑制氧化應(yīng)激，使LDH釋放減少，SOD活性升高，MDA水平下降，均以高劑量組效果最佳。全方和組分1的高劑量組LDH釋放量分別為（35.08±21.62）、（29.04±11.99）U/g（P〈0.01或P〈0.05），SOD活性分別為（20.82±5.08）、（16.14±3.79）U/mg（P〈0.01或P〈0.05），MDA水平分別為（0.70±0.20）、（0.61±0.27）nmol/mg（P〈0.01或P〈0.05）。依達(dá)拉奉組LDH釋放量為（27.26±7.96）U/g（P〈0.01），SOD活性為（23.01±6.88）U/mg（P〈0.01），MDA水平為（0.58±0.21）nmol/mg（P〈0.01）。（見(jiàn)圖7）

圖7 各組氧糖剝奪SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)LDH、SOD和MDA的水平比較（±s，n=9）

4 討 論

腦卒中是突發(fā)的腦血液循環(huán)障礙性疾病，隨著老齡化和高血壓患病率的逐年增長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)腦卒中患者不斷增多，且出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，有效預(yù)防和治療腦卒中日趨重要[7-8]。根據(jù)血管堵塞或破裂，腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占腦卒中的85%以上。西醫(yī)治療腦卒中的主要方法有抗凝、急性期降壓、去血腫的顱骨切除術(shù)及腦室內(nèi)置管引流等外科手術(shù)[9-10]。西醫(yī)療法起效快，但伴隨許多副作用和治療風(fēng)險(xiǎn)。研究表明中藥治療腦卒中，具有療效好和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用日益廣泛，并且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中藥可能通過(guò)調(diào)控體內(nèi)炎癥、氧化、凋亡、抑制血管痙攣和自噬等相關(guān)通路來(lái)發(fā)揮治療作用[11]。

蛭蛇通絡(luò)膠囊中人參大補(bǔ)元?dú)?，促進(jìn)血行；黃芪益氣養(yǎng)血，利水消腫，助人參補(bǔ)氣養(yǎng)血；水蛭味咸性平，破瘀；烏梢蛇祛風(fēng)止痙通絡(luò)；丹參活血化瘀；郁金活血行氣化痰；紅花、川芎助丹參活血化瘀，并加強(qiáng)水蛭行瘀止痛效果；天麻息風(fēng)止痙，祛風(fēng)通絡(luò)，助烏梢蛇祛風(fēng)止痙；冰片開(kāi)竅醒神；葛根升陽(yáng)清濁。臨床研究表明蛭蛇通絡(luò)膠囊治療腦卒中恢復(fù)期患者療效顯著，能降低血脂，抗血栓形成，增加腦血流量，改善臨床癥狀，且治療期間無(wú)不良反應(yīng)；其與西藥聯(lián)用治療腦卒中恢復(fù)期患者，能發(fā)揮協(xié)同作用，提高療效，且效果優(yōu)于單用西藥治療者。蛭蛇通絡(luò)膠囊改善缺血性腦卒中恢復(fù)期患者血脂和血液流變學(xué)指標(biāo)的作用，可能與活血化瘀藥物丹參、紅花、川芎、水蛭等有關(guān)；其降低中醫(yī)證候積分的作用，可能與益氣祛風(fēng)通絡(luò)藥物黃芪、人參、烏梢蛇、郁金、天麻等有關(guān)[12]。但蛭蛇通絡(luò)膠囊治療腦卒中的作用機(jī)制和有效組分尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究制備各組分及全方腸吸收液結(jié)合體外藥理實(shí)驗(yàn)從抗氧化和抗凝血來(lái)闡釋其治療腦卒中的作用機(jī)制，并利用拆方法尋找藥效最佳的組分。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基（reactive oxide species，ROS）或自身清除不足，造成體內(nèi)ROS堆積，引起氧化損傷的病理過(guò)程[13]。氧化應(yīng)激在腦卒中的病理過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14]。大量的自由基及其副產(chǎn)物使脂質(zhì)過(guò)氧化，DNA損傷，蛋白質(zhì)變性，細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞崩解，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[15]；氧自由基也會(huì)影響腦血管的血流，促進(jìn)血管舒張，內(nèi)皮通透性增加，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血腦屏障通透性增加，導(dǎo)致腦組織微循環(huán)障礙[16]；氧化應(yīng)激可影響興奮性氨基酸毒性在體內(nèi)的釋放和重?cái)z取，導(dǎo)致其在體內(nèi)聚積，造成神經(jīng)毒性損傷[17]。腦卒中的發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，氧化應(yīng)激損傷會(huì)造成嚴(yán)重的腦組織損傷，腦組織相對(duì)于其他器官更易產(chǎn)生氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物[18]?？寡趸镔|(zhì)清除自由基，可保護(hù)機(jī)體免受損傷[19]。缺血性腦卒中的急性期由于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板活化等原因，會(huì)激活凝血系統(tǒng)而導(dǎo)致血液處于高凝狀態(tài)，在進(jìn)展性腦卒中發(fā)病24 h內(nèi)凝血酶及D-二聚體水平顯著增高[20]?？鼓幬锸侨毖阅X卒中預(yù)防和治療手段之一[21]。

含藥腸吸收液應(yīng)用于中藥體外活性評(píng)價(jià)，是有效成分辨識(shí)和機(jī)制研究的有效方法[22-23]。本研究結(jié)果顯示蛭蛇通絡(luò)膠囊具有清除DPPH自由基的作用，能降低FIB的水平，延長(zhǎng)TT，并抑制ADP誘導(dǎo)的血小板凝集，表明其可能通過(guò)抗氧化和抗凝血發(fā)揮治療腦卒中的作用。根據(jù)制備工藝路線(xiàn)拆方的組分中，DPPH自由基清除作用最強(qiáng)的成分為含人參、黃芪、天麻、丹參和葛根的組分1，抗ADP誘導(dǎo)血小板凝集作用最強(qiáng)的成分為含水蛭、烏梢蛇和紅花的組分2。雖然蛭蛇通絡(luò)膠囊抗氧化和抗凝作用均有藥效最強(qiáng)的不同組分，但和全方相對(duì)應(yīng)的藥效比較，仍以全方的抗氧化和抗凝血作用最佳，說(shuō)明其抗氧化和抗凝血作用是全方綜合作用的結(jié)果。

SH-SY5Y細(xì)胞系來(lái)源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株，具有分化程度低和增殖快的特點(diǎn)，且該細(xì)胞的形態(tài)、生理生化功能均與正常神經(jīng)細(xì)胞較為相似[24]。OGD損傷模型常用于細(xì)胞缺氧缺血損傷后的體外研究[25]。本研究構(gòu)建了OGD損傷SH-SY5Y細(xì)胞模型，通過(guò)采用蛭蛇通絡(luò)膠囊3個(gè)組分及全方腸吸收液預(yù)處理24 h，結(jié)果表明全方、組分1和組分2均能提高細(xì)胞生存率，以全方最佳，其次為含人參、黃芪、天麻、丹參和葛根的組分1。OGD損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)LDH釋放增多，SOD活性降低，MDA水平升高。蛭蛇通絡(luò)膠囊全方和組分1均能抑制細(xì)胞內(nèi)LDH釋放，升高SOD活性，降低MDA水平，抑制氧化應(yīng)激。本研究表明氧化應(yīng)激在神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，抑制氧化應(yīng)激可以發(fā)揮一定程度的神經(jīng)保護(hù)作用。

中藥可通過(guò)多成分作用于多環(huán)節(jié)的不同靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生協(xié)同增效。中藥的作用優(yōu)勢(shì)在于各單一藥效的整合調(diào)節(jié)，構(gòu)成中藥的活性成分群按照配伍組合，通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑、協(xié)同發(fā)揮整合藥效表征[26]。本研究通過(guò)制備工藝路線(xiàn)將蛭蛇通絡(luò)膠囊復(fù)方快速簡(jiǎn)便拆方，研究其體外藥理活性，辨識(shí)各藥效的主要成分，旨在為中藥復(fù)方的功效物質(zhì)基礎(chǔ)提供研究范例。研究結(jié)果證實(shí)蛭蛇通絡(luò)膠囊能清除DPPH自由基，發(fā)揮抗氧化作用，且含人參、黃芪、天麻、丹參和葛根的組分1最佳；蛭蛇通絡(luò)膠囊能拮抗血小板凝集，抑制血栓形成，改善血液循環(huán)，且以含水蛭、烏梢蛇和紅花的組分2最佳，但其抗氧化和抗凝血的有效成分和具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。