劉振杰，譚小青，丘海芯，覃喜軍，孫雪萍，高紅偉

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530299；2.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院/廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530001；3.廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術研究中心，廣西 南寧 530299）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，味苦、性微寒，歸心、肝經[1]，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的功效，用于胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經不調、痛經經閉、瘡瘍腫痛等[2]。丹參作為活血化瘀的要藥，其活血功效已成為共識，常常配伍其他中藥使用，但關于其配伍后有效成分含量的變化情況的研究較少，并且配伍后對其活血功效產生的影響仍然不明確[3-5]。因此，本實驗在前期研究[6-9]基礎上建立HPLC法同時測定丹參中9種成分含量，并計算效應成分指數（effectconstituent index,ECI）值，闡釋配伍應用對丹參中活性成分的影響，以期為該藥材質量控制提供基礎，也為臨床應用提供參考。

1 材 料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，配置2489紫外檢測器（Waters公司）；JA2003型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；調溫型電熱套（北京市永光醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 丹參于2018年5月購于四川省成都市國際商貿城荷花池中藥材專業(yè)市場，產地為四川中江，經廣西中醫(yī)藥大學藥學院孫雪萍副研究員鑒定為丹參正品。人參（批號：191107，桂林鼎康中藥飲片公司）、黃芪（批號：191101，桂林鼎康中藥飲片公司）、紅花（批號：200101，化州市華逸中藥學飲片有限公司中藥飲片廠）、制何首烏（批號：191001，廣西民生堂中藥研制有限公司）、山藥（批號：191101，桂林鼎康中藥飲片公司）、當歸身（批號：191201，桂林鼎康中藥飲片公司）、鹽牛膝（批號：191101，桂林鼎康中藥飲片公司）、茯苓（批號：200302，化州市華逸中藥學飲片有限公司中藥飲片廠）、山楂（批號：200101，安徽三義堂中藥飲片有限公司）、熟地黃（批號：191102，桂林鼎康中藥飲片公司）、醋郁金（批號：20190901，南寧市景昌中藥飲片有限公司）、生地黃（批號：191202，化州市華逸中藥學飲片有限公司中藥飲片廠）、三七（批號：191102，桂林鼎康中藥飲片公司）、麥冬（批號：190702，安徽三義堂中藥飲片有限公司）、赤芍（批號：191201，廣西民生堂中藥研制有限公司）、制川烏（批號：20200301，南寧市景昌中藥飲片有限公司）、白芍（批號：200201，廣西民生堂中藥研制有限公司）、甘草（批號：200101，廣西民生堂中藥研制有限公司）、醋香附（批號：190801，桂林鼎康中藥飲片公司）、葛根（批號：20191201，南寧市景昌中藥飲片有限公司）、五味子（批號：20200201，南寧市景昌中藥飲片有限公司），以上藥材均購買于廣西一心醫(yī)藥集團有限責任公司；丹參素鈉對照品（批號：17122102）、原兒茶醛對照品（批號：17060708）、迷迭香酸對照品（批號：18030901）、丹酚酸B對照品（批號：18040201）、丹酚酸A對照品（批號：18030807）、二氫丹參酮Ⅰ對照品（批號：17120808）、丹參酮Ⅰ對照品（批號：17122704）、丹參酮ⅡA對照品（批號：17052605）、隱丹參酮對照品（批號：18032807），以上對照品皆購于成都普菲德生物科技有限公司，純度均≥98%；色譜純乙腈（美國Fisher Scientific有限公司）；色譜純甲酸（賽默飛世爾科技中國有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Ultimate Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫，梯度洗脫程序：0 min，10% A，20 min，28% A，35 min，48% A，40 min，60% A，60 min，100% A；體積流量為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為270 nm；進樣量為20 μL。色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品適量，用甲醇制成以上各成分質量濃度分別為0.230、0.250、0.210、0.200、0.200、0.031、0.029、0.031、0.037 mg/mL的混合對照品貯備液，經0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.3 供試品溶液制備 將丹參切制成規(guī)格相近的飲片，取300 g備用。隨機稱取10.0 g置于500 mL的圓底燒瓶中，加入10倍量的水，先行浸泡30 min，再使用調溫型電熱套進行加熱回流，總時長為2 h，加熱結束后過濾，將濾液定容至100 mL儲存在4 ℃冰箱內，為后續(xù)實驗做準備。精密量取提取液1 mL，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻。

隨機稱取丹參10.0g和某一中藥10.0g，兩者置于圓底燒瓶，加入10倍量的水，同“2.3”的制備方法一致。丹參單煎液、丹參與當歸等21味中藥分別合煎的樣品，見表1。

表1 丹參與21 種藥材配伍應用的樣品表

2.4 線性關系考察 將“2.2”項下混合對照品貯備液用甲醇依次稀釋成不同濃度的混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下各進樣20 μL測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，分別以S/N=3、S/N=10為檢測限、定量限，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液20 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別為1.58%、1.47%、1.70%、1.71%、1.71%、1.11%、1.60%、2.83%、0.71%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取丹參-當歸樣品（編號為S2），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h在“2.1”項色譜條件下各進樣20 μL測定，測得丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別為1.26%、0.99%、0.91%、1.23%、0.26%、2.14%、1.02%、2.01%、2.00%，表明溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一批次丹參飲片6份，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下各進樣20 μL測定，測得丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別為1.46%、0.89%、1.91%、1.43%、0.86%、2.10%、1.08%、2.32%、1.70%，表明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的丹參提取液6份，分別以100%水平加入對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，平均加樣回收率分別為99.94%、98.47%、98.80%、98.23%、96.42%、100.06%、98.26%、98.87%、100.05%。RSD值分別為2.58%、1.54%、1.57%、0.96%、0.74%、3.30%、1.27%、0.64%、1.49%，表明方法準確度良好。

2.9 樣品含量測定 取所制備的22份提取液樣品，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量。結果表明，22批提取液樣品中9個成分的含量存在一定的差異，丹參配伍郁金、茯苓、川芎、熟地黃、何首烏，特別是配伍三七和紅花后，配伍提取液中的丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、丹參酮ⅡA等成分的含量明顯增多。（見表4）2.10 聚類分析和熱圖分析 用MetaboAnalyst 5.0軟件將含量測定結果進行聚類分析和熱圖分析，結果見圖2。由聚類分析結果可知，丹參配伍郁金、茯苓、川芎、熟地黃、何首烏聚為第一類；丹參配伍三七和紅花聚在一起，然后與香附和人參共聚為第二類；丹參配伍山藥、甘草、黃芪聚在一起，與丹參配伍五味子、山楂、葛根共聚為第三類；丹參配伍牛膝、白芍、麥冬、當歸、赤芍、生地黃聚為第四類；丹參單獨為第五類。由熱圖結果可知，方格中的紅色越深代表該成分的含量越高，而藍色越深代表該成分的含量越低，丹參配伍后各成分的含量均有一定程度的升高，丹參配伍郁金、川芎、熟地黃、香附、三七等可以提高丹酚酸B的含量；丹參配伍人參、紅花、山楂等可以提高隱丹參酮的含量；丹參除了配伍麥冬、當歸、赤芍和生地黃外，配伍其他味藥材均可以提高丹參酮ⅡA的含量。2.11 丹參活血生物效價的計算 將體質量240～260 g的雄性SD大鼠腹腔注射0.12 mol/L戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，以0.13 mol/L枸櫞酸納1∶9抗凝腹主動脈取血。100 g離心15 min，吸取上液作為富血小板血漿（PRP），剩余部分以2 000 g離心10 min，取上清液即為貧血小板血漿（PPP），以PPP調節(jié)PRP的血小板濃度至所需濃度。取PRP 175 μL加入測試杯，進行儀器調零；然后取PPP 50 μL加入測試杯37 ℃溫育，再加入25 μL花生四烯酸，記錄血小板聚集曲線。

表4 各成分含有量測定結果（mg/g，n=6）

取PRP 175 μL加入測試杯，進行儀器調零；然后分別取50 μL不同濃度的單體化合物溶液（丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮IIA、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮）或者丹參提取物供試品加入測試杯37 ℃溫育，再加入25 μL花生四烯酸，記錄血小板聚集曲線。根據公式計算基于血小板最大聚集的抑制率，計算公式：最大抑制率=[（空白血漿最大聚集率-供試品最大聚集率）/空白血漿最大聚集率]×100%。

選取隱丹參酮為標準對照物質，定義隱丹參酮效價為1 000 U/mg。應用解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心開發(fā)的《中藥生物效價計算軟件》計算各單體化合物和丹參藥材的相對效價。2.12 ECI的計算 丹參ECI公式由肖小河等[7]前期構建，根據不同單體成分的抗血小板聚集率，計算的單體化合物的相對生物效價。丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮I、二氫丹參酮I的相對生物效價（U/mg）分別為4.995、4.782、9.869、18.920、13.290、1 000、0、0、0。以所有組成成分的相對生物效價為Fi，代入公式中計算ECI，結果見表5。丹參ECI的公式如下：

表5 22 份樣品的ECI

公式中Fi為各單體化合物的生物效價；公式中Ci為丹參藥材中各單體化合物的含量；公式中n為選擇的丹參藥材中單體化合物的數目；公式中i是變數，表示對i求和。將生物效價代入公式即得：丹參樣品的ECI=（4.995×丹參素鈉含量）+（4.782×原兒茶醛含量）+（9.869×迷迭香酸含量）+（18.920×丹酚酸B含量）+（13.290×丹酚酸A含量）+（1 000×隱丹參酮含量）+（0×二氫丹參酮I含量）+（0×丹參酮I含量）+（0×丹參酮IIA含量）。

結果顯示，22批提取液樣品中9個成分的含量存在一定的差異，丹參與香附、郁金、何首烏、熟地黃、茯苓、三七、川芎等配伍煎煮后的提取液的ECI值較高。

3 討 論

本研究考察了流動相甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸等洗脫方式，發(fā)現與甲醇相比，乙腈洗脫能力、分離效果較好，最終確定為乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫。丹參酮類成分紫外光譜在270 nm波長有最大吸收，丹酚酸類成分在280 nm有最大吸收，實驗發(fā)現在270 nm條件下，9個色譜峰峰形良好，分離度理想，故選擇270 nm作為檢測波長。

ECI是基于化學成分分析和效應檢測共同加權的質量評價指標，其可通過中藥中活性成分的“量-效”關系方程來建立。由于中藥含有多種化學成分，具有整體性特點，是通過多成分、多靶點協(xié)調起效而發(fā)揮藥效作用，而測定單一或幾個成分含量不能真正反映藥材的與臨床療效關聯的中藥的質量。以指標性成分含量測定為代表的化學評價能夠表征部分成分的定性定量差異，但這些檢測指標與臨床安全性和有效性關聯性需要確認，未來中藥的品質評控模式應是化學評價與生物評價相結合。因此，近年來，國內外課題研究組以黃連[6]、丹參[7]、附子[8]等為代表，探索建立了中藥品質綜合量化評價方法-ECI，本課題是在已經構建的丹參的ECI的基礎上，應用其對丹參的配伍應用進行研究。

本研究通過查閱收集2020年版《中華人民共和國藥典》收錄的163種含丹參的成方制劑和從一些中成藥網站收集到117種含丹參且在市面上銷售的中成藥作為資料來源，并統(tǒng)計與丹參配伍的中藥及其出現頻數，累計出現頻數由高到低的前20味中藥[10-15]。綜合兩者，最終選取頻數較高的黃芪、當歸、川芎、地黃、紅花、茯苓、甘草、人參、赤芍、五味子、香附、三七、白芍、山藥、山楂、郁金、牛膝、麥冬、葛根、何首烏20味藥為研究對象（地黃又分生地黃、熟地黃）。

本研究中所選取與丹參配伍頻率較高的20味藥材中，活血化瘀功效較顯著的中藥有川芎、紅花、當歸、三七、赤芍，研究結果發(fā)現它們與丹參配伍后丹參素鈉等9個有效成分的含量增加，對應計算出的ECI值升高，因此，與丹參合理配伍使用，能使丹參活血功效增強[16-17]。川芎、三七、郁金、紅花、赤芍、山楂等為活血化瘀類中藥，當歸、何首烏、地黃等為補血藥，五味子、牛膝、茯苓、麥冬、葛根等具有收澀、清熱、利尿通淋等作用，這些中藥與丹參相須或相使為用，配伍后起到減毒增效的作用。配伍后，對指標成分含量變化與配伍藥材之間的相關性進行分析，可知，丹參配伍郁金、茯苓、川芎、熟地黃、何首烏，特別是配伍三七和紅花后，配伍提取液中的丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、丹參酮ⅡA等成分的含量明顯增多，說明配伍可能對活性成分起到了增溶作用，從而增強了丹參的藥效。另外，麥冬、當歸、生地黃、黃芪等中藥與丹參配伍后，丹酚酸B或丹參酮ⅡA等成分沒有明顯變化，所以其并不是通過增加丹參有效成分的溶出度來起效，也可能是通過自身的活血的活性成分來增強藥效，或者是起到減少丹參副作用的功能。

2020年版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定，丹參藥材飲片的含量測定項的指標性成分是丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA；丹參水提物（丹參總酚酸提取物）的指標性成分有原兒茶醛和迷迭香酸和丹酚酸B；而丹參酮提取物的特征圖譜的共有峰又包括15,16-二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA；而復方丹參滴丸、丹參片、復方丹參片等含有丹參的中成藥的含量測定方法也常選用以上的化合物為指標性成分，而且，這些成分也往往是丹參藥材飲片及其制劑中含量較高的成分[1]。因此，筆者選用丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA作為含量測定的指標。根據相關文獻報道，丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA具有抗血小板聚集、體外抗凝血的作用，這些成分作為含量測定指標與這些效應有直接相關性，也與丹參的活血化瘀功效有密切的關系[18-20]。