黃 成，周仁杰，黃保生,，韓燕全，朋湯義，金傳山，吳德玲

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)/中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)中心，安徽 合肥 230031）

蒼耳子為菊科植物蒼耳（Xanthium sibirium Patr.）的干燥成熟帶總苞果實(shí)，為治療鼻淵頭痛之要藥[1]，至今已有1 800多年藥用歷史。蒼耳子藥材資源豐富，臨床應(yīng)用廣泛[2-3]。現(xiàn)代研究表明，蒼耳子具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗腫瘤等藥理作用[4-6]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部記載蒼耳子“味辛、苦，性溫，有毒，歸肺經(jīng)”，須炒制去刺后使用[7]。文獻(xiàn)研究表明，蒼耳子對(duì)機(jī)體毒性影響最主要的部位是肝臟[8-9]。CYP450酶是肝臟中非常重要的Ⅰ相藥物代謝酶，其亞型CYP1A2和CYP3A4分別代謝40%～50%的臨床藥物，在藥物代謝中起到關(guān)鍵作用[10-12]，目前尚未見基于CYP450酶活性探討蒼耳子炮制減毒機(jī)理的研究。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠肝微粒體孵育體系，以咖啡因和咪達(dá)唑侖分別作為CYP1A2、CYP3A4兩種酶的探針?biāo)幬?，用HPLC檢測(cè)其消耗量，計(jì)算酶的相對(duì)活性，并結(jié)合血清生化指標(biāo)檢測(cè)及病理切片觀察來確定肝損傷的程度，從而研究蒼耳子的炮制對(duì)此兩種CYP酶活性的影響，以及與肝損傷程度間的關(guān)系，以期為蒼耳子的炮制減毒機(jī)理研究及臨床安全用藥提供依據(jù)，同時(shí)為其他毒性藥材的研究提供思路。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種雄性小鼠49只，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物于12 h光照或黑夜循環(huán)環(huán)境中飼養(yǎng)，保持溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為（50±5）%，自由攝水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范要求。

1.2 儀器與試劑 Nexera XR LC-20AD XR型高效液相色譜儀，包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、SPD檢測(cè)器和LabSolutions色譜工作站（日本SHIMADZU公司）；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；3XZ21K型高速冷凍離心機(jī)（上海名元實(shí)業(yè)有限公司）。

蒼耳子生品（批號(hào)：1911160062，產(chǎn)地：山東）購(gòu)自亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)謝冬梅副教授鑒定為菊科植物蒼耳的干燥成熟帶總苞果實(shí)；咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：DST200510-001）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）（批號(hào)：DST200712-090）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；咪達(dá)唑侖注射液（批號(hào)：MD200304）購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司；地西泮注射液（批號(hào)：1902551）購(gòu)自天津金耀藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈均為色譜級(jí)，購(gòu)自SIGMA公司；蒸餾水購(gòu)自屈臣氏公司。

蒼耳子炮制品制備：取潔凈的河砂置鍋內(nèi)，武火加熱至滑利狀態(tài)，測(cè)定離鍋底1 cm左右處的溫度，待溫度穩(wěn)定至160 ℃時(shí)，投入蒼耳子炒制7 min，炒至表面微黃出鍋，放涼備用[13]。

2 方 法

2.1 蒼耳子水煎液制備 取蒼耳子生品、炮制品各150 g分別加10倍量的水浸泡30 min，武火煮沸后，文火繼續(xù)煎煮30 min，過濾后留存，藥渣加入8倍量水進(jìn)行二次煎煮并過濾，合并濾液后濃縮至質(zhì)量濃度為2 g/mL。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法 將49只昆明小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分成正常組、蒼耳子生品低劑量組、蒼耳子生品中劑量組、蒼耳子生品高劑量組、蒼耳子炮制品低劑量組、蒼耳子炮制品中劑量組、蒼耳子炮制品高劑量組，每組7只。蒼耳子人用量為10.0 g/d，按照人與小鼠體質(zhì)量進(jìn)行劑量換算，蒼耳子生品和炮制品低劑量組（13.0 g/kg）、蒼耳子生品和炮制品中劑量組（26.0 g/kg）和蒼耳子生品和炮制品高劑量組（39.0 g/kg），分別相當(dāng)于臨床人用劑量的10、20和30倍[14]。各給藥組小鼠按照0.2 mL/10 g體積灌胃生、炒蒼耳子水煎煮液，正常組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)10 d。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食。

2.3 溶液配制

2.3.1 Cooktail藥物探針 精密稱取10.600 mg咖啡因?qū)φ掌?，加入適量甲醇配制成濃度為9.0 mmol/L的咖啡因母液，按相同方法配制濃度為1.5 mmol/L的咪達(dá)唑侖母液，取兩種母液適量混合后配制成咖啡因濃度為15.0 μmol/L、咪達(dá)唑侖濃度為2.5 μmol/L的Cooktail混合液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液 在滅活過的肝微粒體孵育體系中，加入咖啡因母液適量使其濃度分別為3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 μmol/L，加入咪達(dá)唑侖母液使其濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μmol/L。

2.3.3 TMS緩沖溶液 稱取0.610 g三羥甲基氨基甲烷（Tris）、0.060 g MgCl2·6H2O、6.850 g蔗糖，混合后以超純水溶解至100 mL，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 Tris-HCl溶液 將1 mol/L的Tris-HCl加入超純水分別稀釋成0.10、0.01 mol/L的Tris-HCl溶液。

2.3.5 NADPH溶液 精密稱取3.080 mg NADPH，加入適量的純水配制成50mmol/L的溶液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.6 含地西泮的反應(yīng)終止液 取地西泮注射液（2 mg/mL）1 mL，加入適量甲醇配制成8 μg/mL的溶液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹15]。

2.4 小鼠肝微粒體制備 第10天灌胃后禁食24 h，腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉，眼球取血，迅速打開腹腔取出肝臟，頸椎脫臼處死小鼠。用濾紙吸干肝臟表面血液，將肝臟置于下墊冰盒的表面皿中，用剪刀剪開后分別裝入EP管中，稱取1.5 g肝組織加入4倍量的TMS溶液，剪碎，勻漿機(jī)攪拌制備勻漿，放入高速冷凍離心機(jī)，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上清液加入0.1 mL的68 mmol/L CaCl2溶液進(jìn)行沉淀，4 ℃、20 000 r/min離心20 min，取沉淀物加0.1 mol/L的Tris-HCl 1 mL，渦旋1 min混勻，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，得到的粉色沉淀即為肝微粒體，將其重新懸于1 mL的0.01 mol/L Tris-HCl中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹16]。用BCA蛋白質(zhì)量試劑盒測(cè)肝微粒體蛋白的濃度。

2.5 體外孵育 肝微粒體孵育體系總體積為500 μL，取肝微粒體懸液10 μL按照表1的步驟依次加入探針?biāo)幬锖途彌_液，然后加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，于37 ℃恒溫水浴中孵育30 min，最后加入預(yù)冷的地西泮終止液500 μL，12 000 r/min離心15 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

表1 肝微粒體孵育體系加樣順序

2.6 色譜條件 色譜柱為島津Shim-pack GISP-HPLC18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序如表2所示，流速：0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。

表2 HPLC 測(cè)定Cooktail 探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)物的洗脫條件

2.7 觀察指標(biāo)

2.7.1 血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性 取材后按照試劑盒說明書，用ELISA法檢測(cè)血清AST、ALT的活性。

2.7.2 肝臟組織病理學(xué)變化 將肝臟組織移至4%多聚甲醛溶液中，在固定24 h后，進(jìn)行脫水和石蠟包埋，制成石蠟切片，隨后進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.7.3 CYP1A2、CYP3A4酶相對(duì)活性 通過測(cè)定樣品組探針?biāo)幬锟Х纫蚝瓦溥_(dá)唑侖的峰面積，將其與內(nèi)標(biāo)物地西泮的比值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出兩種探針?biāo)幬镌诟挝⒘ｓw體系中的濃度，正常組的探針?biāo)幬餄舛葹榭偟孜餄舛?，給藥組濃度為剩余濃度。CYP1A2和CYP3A4兩種酶的相對(duì)活性計(jì)算公式：酶相對(duì)活性=（總底物濃度-剩余濃度）/總底物濃度×100%。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 線性關(guān)系考察 將兩種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液按“2.6”項(xiàng)方法進(jìn)樣，以反應(yīng)物濃度為橫坐標(biāo)（X），反應(yīng)物與底物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。咖啡因：Y=0.018 4X-0.000 7，r=0.999 9。咪達(dá)唑侖：Y=0.054 6X-0.000 3，r=0.999 8。表明在3～30 μmol/L和0.5～5 μmol/L內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2 專屬性試驗(yàn) 空白肝微粒體+內(nèi)標(biāo)物、探針?biāo)幬?內(nèi)標(biāo)物、孵育過的肝微粒體樣品（蒼耳子炮制品中劑量組3號(hào)）+內(nèi)標(biāo)物的HPLC色譜圖見圖1。在本實(shí)驗(yàn)條件下，各藥物分離完全，無雜質(zhì)峰干擾，咖啡因、咪達(dá)唑侖和地西泮的保留時(shí)間分別是4.298、8.988、9.557 min，專屬性良好。

3.1.3 精密度試驗(yàn) 取10 μL小鼠肝微粒體，加入PBS緩沖液460 μL，60 ℃加熱使肝微粒體失活，冷卻至室溫，加入Cooktail探針?biāo)幬?0 μL和NADPH 20 μL，按“2.6”項(xiàng)方法進(jìn)樣，平行測(cè)量6次，計(jì)算日間精密度，測(cè)得咖啡因和咪達(dá)唑侖的RSD分別為0.45%和0.35%，符合試驗(yàn)要求。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蒼耳子生品中劑量組4號(hào)樣品孵育，然后按照“2.6”項(xiàng)方法在0、2、4、6、12、24 h時(shí)分別進(jìn)樣，結(jié)果咖啡因和咪達(dá)唑侖的RSD分別為0.63%和1.13%，說明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取蒼耳子生品中劑量組6號(hào)樣品進(jìn)行孵育，按照“2.6”項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)樣6次，咖啡因和咪達(dá)唑侖的RSD分別為0.55%和0.75%，符合試驗(yàn)要求。

3.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取不同的已知濃度樣品100 μL，加入探針?biāo)幬锘旌弦?00 μL，共制作6組，按照“2.6”項(xiàng)方法進(jìn)樣，咖啡因和咪達(dá)唑侖的平均加樣回收率分別是102.6%和101.37%，RSD分別是1.60%和1.97%。（見表3）

表3 肝微粒體樣品中咖啡因和咪達(dá)唑侖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.2 各組小鼠血清AST、ALT活性比較 蒼耳子生品中、高劑量組和蒼耳子炮制品高劑量組小鼠血清AST、ALT活性均高于正常組（P＜0.05或P＜0.01）；蒼耳子生品低劑量組、蒼耳子炮制品中劑量組小鼠血清ALT活性均高于正常組（P＜0.05）；同等劑量下，蒼耳子生品低、中、高劑量組小鼠血清AST、ALT活性均分別高于蒼耳子炮制品低、中、高劑量組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明蒼耳子生品和炮制品均能造成小鼠肝損傷，炮制品造成的肝損傷較輕。

表4 各組小鼠血清AST、ALT 活性比較（，U/L）

表4 各組小鼠血清AST、ALT 活性比較（，U/L）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

3.3 各組小鼠肝組織病理變化情況 正常組小鼠肝臟細(xì)胞圍繞中央靜脈呈規(guī)則的放射狀排列，大小均勻，排列緊密，細(xì)胞核飽滿，結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；蒼耳子生品的低、中劑量組小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核萎縮現(xiàn)象，蒼耳子生品高劑量組小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核萎縮及四周空洞現(xiàn)象；蒼耳子炮制品低劑量組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)基本正常，蒼耳子炮制品中、高劑量組小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞核萎縮及四周空洞現(xiàn)象。（見圖2）

3.4 各組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4活性比較 蒼耳子生品中、高劑量組和蒼耳子炮制品的中、高劑量組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2活性均明顯高于正常組（P＜0.05或P＜0.01）；蒼耳子生品高劑量組和蒼耳子炮制品高劑量組小鼠肝臟微粒體中CYP3A4活性均明顯高于正常組（P＜0.05）；同等劑量下，蒼耳子生品低、中、高劑量組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4活性均分別高于蒼耳子炮制品低、中、高劑量組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明蒼耳子能誘導(dǎo)這兩種酶的活性，并且炮制后能減輕對(duì)這兩種酶的誘導(dǎo)作用。

表5 各組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4相對(duì)活性比較（）

表5 各組小鼠肝臟微粒體中CYP1A2、CYP3A4相對(duì)活性比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

4 討 論

蒼耳子在臨床上有著廣泛的應(yīng)用，常用于治療風(fēng)寒感冒、慢性鼻炎、過敏性鼻炎、皮膚病及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[17]。蒼耳子生品有小毒，由于未經(jīng)炮制或者炮制不當(dāng)導(dǎo)致的中毒事件時(shí)有發(fā)生。其毒性主要表現(xiàn)為對(duì)機(jī)體臟器的損害，其中對(duì)肝臟的損害尤為嚴(yán)重[18]。目前關(guān)于蒼耳子炮制減毒機(jī)理的研究主要集中在炮制前后毒、效成分的變化及對(duì)藥效的影響方面[19]，其具體的毒性機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討。肝臟是藥物代謝的主要器官，肝臟中CYP1A2、CYP3A4酶是較重要的兩種CYP450亞酶，從對(duì)肝藥代謝酶活性影響的角度進(jìn)行研究有望從新視角探明蒼耳子的炮制減毒機(jī)理[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)建立了小鼠肝微粒體孵育體系，通過HPLC檢測(cè)CYP1A2、CYP3A4酶的特異性代謝物咖啡因、咪達(dá)唑侖在孵育過程中的消耗量來觀察不同給藥組酶的相對(duì)活性變化。本研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子生品低、中、高劑量組和蒼耳子炮制品低、中、高劑量組對(duì)CYP1A2酶的誘導(dǎo)作用均高于正常組，且同劑量比較時(shí)，蒼耳子生品低、中、高劑量組對(duì)CYP3A4酶的誘導(dǎo)作用分別高于蒼耳子炮制品低、中、高劑量組；結(jié)合血清AST、ALT的檢測(cè)和肝臟HE染色病理切片觀察，本研究發(fā)現(xiàn)蒼耳子生品低、中、高劑量組的肝臟損傷情況分別較蒼耳子炮制品低、中、高劑量組更為嚴(yán)重，肝損傷嚴(yán)重程度和酶活性升高的趨勢(shì)基本一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同劑量的蒼耳子生品對(duì)CYP1A2、CYP3A4酶的誘導(dǎo)作用高于蒼耳子炮制品，蒼耳子炮制后對(duì)CYP1A2、CYP3A4酶活性的誘導(dǎo)作用減弱，可能是蒼耳子炮制減毒的機(jī)理之一。由于CYP450酶族系眾多，其活性同時(shí)受到環(huán)境、遺傳、飲食、情緒等因素的影響,蒼耳子炮制后對(duì)其他CYP450酶的誘導(dǎo)效果如何，還需要進(jìn)一步研究。