龐文娟，王麗，張生杰

（武威市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 武威 733000）

維C銀翹片作為中西藥結(jié)合的代表藥品，既有中醫(yī)的治療特點(diǎn)，又有西藥退熱鎮(zhèn)痛功效。臨床上維C銀翹片用于治療流感引起的發(fā)熱、頭痛、咳嗽、口干和喉嚨痛[1-2]。經(jīng)查詢國家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫，維C銀翹片作為中藥制劑已有批準(zhǔn)文號(hào)306個(gè)，同時(shí)維C銀翹片也是一種治療上呼吸道感染非處方藥品，患者可以根據(jù)癥狀自行購買使用。但是據(jù)國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示該品種存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，雖然引起不良反應(yīng)的原因是已知化學(xué)成分的不良反應(yīng)，但是患者往往忽略了所添加的化學(xué)藥物，造成重復(fù)用藥而帶來新的安全風(fēng)險(xiǎn)[3]。此外，生產(chǎn)維C銀翹片的企業(yè)有上百家，每個(gè)廠家由于工藝、原輔料的差異使所生產(chǎn)的藥品在質(zhì)量、臨床療效方面都存在很大差異?，F(xiàn)行維C銀翹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)馬來酸氯苯那敏、對(duì)乙酰氨基酚、維生素C、綠原酸、牛蒡子苷的含量進(jìn)行了控制[4]，缺少對(duì)連翹和甘草的質(zhì)量控制。這就造成很難用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來有效的控制維C銀翹片質(zhì)量。因此，建立能夠同時(shí)控制多個(gè)指標(biāo)的方法對(duì)維C銀翹片質(zhì)量進(jìn)行控制，以保證藥品質(zhì)量的穩(wěn)定、安全，確保療效并降低用藥風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測(cè)定維C銀翹片多個(gè)成分含量的方法，普遍是選擇維生素C、對(duì)乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、牛蒡子苷這7種成分中的3種或4種進(jìn)行同時(shí)測(cè)定的研究[5-8]，此外，也有研究利用多波長(zhǎng)檢測(cè)技術(shù)或液質(zhì)連用技術(shù)實(shí)現(xiàn)5～6種成分的同時(shí)測(cè)定[9-12]。本研究采用高效液相色譜法在同一個(gè)色譜條件下測(cè)定維C銀翹片中8種指標(biāo)成分的含量，為通過提高維C銀翹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來控制原藥材質(zhì)量，確保質(zhì)量穩(wěn)定和療效，提供了新的分析方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜，配DAD檢測(cè)器（日本島津）；Secura125-1CED型十萬之一電子天平（賽多利斯公司）；UA10MFD型超聲波清洗器（德國wiggens公司）。

1.2 材料 甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-201/619，含量：93.1%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-200112，含量：100%）、連翹酯苷A對(duì)照品（批號(hào)：111810-201606，含量：93.4%）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：11052-201611，含量：95.0%）、馬來酸氯苯那敏對(duì)照品（批號(hào)：100047-200606，含量：99.7%）、連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201615，含量：94.9%）、牛蒡苷對(duì)照品（批號(hào)：110819-201007，含量：95.4%）、對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（批號(hào)：100018-200408，含量：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；維C銀翹片（A廠家，批號(hào)：202006020，C20 201120；B廠家，批號(hào)：201101；C廠家，批號(hào)：20 200803；D廠家，批號(hào)：20200601）；乙腈（色譜級(jí)）（美國默克公司，批號(hào)：10945730812）；甲酸（色譜級(jí)）（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10332080）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫時(shí)間程序：0～10.0 min，90%B；10.0～20.0 min，90%～80%B；20.0～30.0 min，80%B～70%B；30.0～45.0 min，70%B～80%B；45.0～55.0 min，80%B～90%B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

BNP屬于多肽類激素一種，是心血管系統(tǒng)的一種具有生物活性的重要激素，能在心肌受損時(shí)快速入血進(jìn)行調(diào)節(jié)，能夠靈敏的反映出心肌受損的情況［6］，并且與心肌受損程度正相關(guān)，心肌損傷越嚴(yán)重BNP水平越高，它是一種常用且有效的心衰檢測(cè)指標(biāo)。目前BNP已被納入心衰診斷指南，用于心衰患者的預(yù)測(cè)和診斷工作。本研究中，鉤藤人參高劑量組BNP水平與卡托普利組BNP水平相近，并明顯低于模型組，說明鉤藤人參高劑量組在降低HCHF大鼠BNP水平，改善心功能方面效果顯著。

2.5 精密度試驗(yàn) 在所建色譜條件下，混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，得到各待測(cè)組分峰面積，計(jì)算對(duì)乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨峰面積RSD值分別為0.06%、0.05%、0.20%、0.04%、0.45%、0.58%、0.51%、1.35%，表明所使用高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨、對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品適量，用50%甲醇配成含對(duì)乙酰氨基酚（4 662 μg/mL）、綠原酸（222.5 μg/mL）、牛蒡苷（225.1 μg/mL）、馬來酸氯苯那 敏（135.73 μg/mL）、連翹酯苷A（60.12 μg/mL）、甘草苷（51.64 μg/mL）、甘草酸銨（87.48 μg/mL）、連翹苷（48.55 μg/mL）8種對(duì)照品的混合對(duì)照品溶液。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取維C銀翹片（批號(hào)：201101），平行制備6份供試品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，考察24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性，每隔4 h取樣檢測(cè)1次，記錄待測(cè)成分峰面積，計(jì)算峰面積RSD值。乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨峰面積RSD值分別為0.15%、0.62%、0.88%、0.59%、0.91%、0.62%、0.28%、0.68%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，去除包衣，精密稱取細(xì)粉約0.20 g，置于棕色容量瓶中，精密加50%甲醇20 mL，稱質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即可。

2.9 含量測(cè)定 取5批維C銀翹片樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

證明：假設(shè)(x(t),y(t),u(t),v(t))T為系統(tǒng)(1.1)的解，由系統(tǒng)(1.1)的第一個(gè)方程得，則由引理2.1的結(jié)果，易知

表1 8 種化學(xué)成分的線性關(guān)系、定量限和檢出限

2.2 溶液的制備

2.4 線性關(guān)系、定量限和檢出限考察 將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋6、5、3、2倍，與混合對(duì)照品組成毓?jié)舛忍荻龋础?.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，求得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍；通過連續(xù)稀釋混合對(duì)照溶液確定定量限和檢測(cè)限，當(dāng)信號(hào)和噪聲之間的比值為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度確定為檢測(cè)限，信號(hào)和噪聲之間的比值為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度確定為定量限[13]，結(jié)果見表1。

她從頭到尾見證了他們被屠殺的過程。人的殘忍真是沒有極限，沒有止境。天下是沒有公理的，否則一群人怎么跑到別人的國家如此撒野?把別人國家的人如此欺負(fù)?她哭還因?yàn)樽约簢业娜司瓦@樣軟弱，從來都是受人欺負(fù)。書娟哭得那個(gè)痛啊，把沖天冤屈都要哭出來。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取每份約0.10 g已知含量的維C銀翹片（批號(hào)：201101）6份，加入與待測(cè)組分含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照溶液，按建立的色譜條件進(jìn)行分析，用回歸方程計(jì)算相應(yīng)含量，并計(jì)算待測(cè)組分的平均加樣回收率和RSD值。結(jié)果表明，8種待測(cè)組分的加樣平均回收率在95.82%～101.08%之間，RSD＜2.0%，表明所建HPLC色譜方法的準(zhǔn)確度良好。（見表2）

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取維C銀翹片（批號(hào)：201101）樣品細(xì)粉6份，按供試品溶液制備方法平行制備，按所建立的色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)成分含量。乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨含量RSD值分別為0.48%、0.57%、0.74%、1.28%、1.30%、1.55%、0.75%、0.78，表明所建方法重復(fù)性良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 專屬性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行專屬性分析。測(cè)定結(jié)果表明，混合對(duì)照品8種待測(cè)成分，在供試品溶液保留時(shí)間（±0.5%）處都有特征峰，分離度、拖尾因子理論塔板數(shù)均滿足定量分析要求，其他成分峰對(duì)待測(cè)成分無干擾。（見圖1）

表3 維C 銀翹片樣品測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3 討 論

3.1 待測(cè)成分的選擇 維C銀翹片是在經(jīng)典名方銀翹散基礎(chǔ)上添加西藥組成的中西藥復(fù)方制劑。在銀翹散方劑中金銀花、連翹發(fā)揮主要療效，相須配伍使用同為君藥，故本研究選擇用綠原酸、連翹脂苷A、連翹苷3個(gè)指標(biāo)成分控制其質(zhì)量。市場(chǎng)銷售連翹飲片質(zhì)量分析發(fā)現(xiàn)連翹分為青翹、老翹，其連翹脂苷A與連翹苷存在明顯差異，用連翹脂苷A、連翹苷兩種成分同時(shí)控制連翹質(zhì)量更為全面[14-15]。牛蒡苷為牛蒡子的指標(biāo)成分，能夠直接反映牛蒡子質(zhì)量狀況，且不同產(chǎn)地牛蒡子中牛蒡苷含量有差異[16]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)甘草苷、甘草酸銨具有明顯的糖皮質(zhì)激素樣作用[17]，甘草苷和甘草酸銨最大的副作用是由高血壓和低鉀血癥引起的繼發(fā)性疾病[18]，故應(yīng)控制維C銀翹片中甘草的質(zhì)量以保障療效的穩(wěn)定。維C銀翹片不良反應(yīng)主要是由對(duì)乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏引起的，對(duì)其含量控制是保障維C銀翹片安全性的重要質(zhì)控指標(biāo)[3]。綜上選擇用上述8種成分能夠更好地控制維C銀翹片質(zhì)量，以減少用藥風(fēng)險(xiǎn)。

周澤贍霍地一下睜開了眼，門外小雞叫聲已沒先前那么大了。周澤贍把被子掀開，猛地坐起，衣服也不穿就跑了出去。

3.2 優(yōu)化色譜條件 本研究對(duì)確定的8種待測(cè)成分在190～700 nm內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，同時(shí)考慮8種成分在維C銀翹片中含量在同一色譜條件下的響應(yīng)值，為確保各成分峰面積能夠同時(shí)滿足定量需求，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。在此波長(zhǎng)下待測(cè)成分均具有良好的吸收，在供試品色譜中各成分色譜峰能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，且能夠滿足在同一色譜條件下定量分析的系統(tǒng)適用性。因待測(cè)成分極性差異較大，為實(shí)現(xiàn)8種成分同時(shí)測(cè)定，需選用梯度洗脫。此外，本研究還考察了不同流動(dòng)相組成對(duì)峰形的影響，試驗(yàn)證明加入0.1%甲酸時(shí)峰形最好，并對(duì)梯度洗脫時(shí)間程序進(jìn)行優(yōu)化已實(shí)現(xiàn)良好的分離效果?！?.1”項(xiàng)下色譜條件能夠在35 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)8種待測(cè)成分的同時(shí)定量分析。

我打算說點(diǎn)什么，想向他保證，我可以撐下去，也許吧——，但話到嘴邊又咽了回去，不知為什么?？赡芤?yàn)槲也幌朐倏吹桨鹂四菑埬?，也不喜歡他盯著我，甚至永遠(yuǎn)不想讓他再看我。

3.3 維C銀翹片質(zhì)量分析 本研究通過測(cè)定維C銀翹片中8種成分的含量發(fā)現(xiàn)，不同廠家生產(chǎn)的維C銀翹片和同一廠家生產(chǎn)的維C銀翹片8種成分含量存在明顯的差異，尤其是《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)中未列出的質(zhì)控成分差別更明顯，比如連翹苷A的最高含量是最低含量的兩倍多，甘草酸差別竟高達(dá)3倍。這可能為市場(chǎng)上銷售的維C銀翹片質(zhì)量和療效參差不齊的原因，因此增加維C銀翹片質(zhì)量控制成分，對(duì)其安全性和保證療效尤為重要。本試驗(yàn)因缺少足夠的樣品并未對(duì)市售維C銀翹片的質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)分析，建議市場(chǎng)監(jiān)督部門加大對(duì)維C銀翹片監(jiān)督抽驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)提高維C銀翹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以確保安全性和療效。本分析方法不足之處在于未將維生素C納入此分析方法中進(jìn)行多成分同時(shí)測(cè)定。維生素C特殊的化學(xué)性質(zhì)，使其在該色譜條件下出峰較早，容易與溶劑峰混淆很難進(jìn)行定量分析，故本分析方法未能實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定。維生素C常作為抗氧化劑以預(yù)防或治療壞血病，超劑量服用可能會(huì)導(dǎo)致胃腸道不適、頭痛、失眠等不良反應(yīng)，且目前尚無具體研究證明其能預(yù)防或治療感冒[19]，因此在以后的分析研究中應(yīng)加以關(guān)注。