成家宏，孟毅，喬明亮

（河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002）

腦卒中是繼心臟病和癌癥之后的第三大死亡原因[1]，其中缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占所有腦卒中病例的85%以上。目前IS有效療法為組織纖溶酶原激活劑和血管內血栓切除術[2]，但因缺血半暗帶（ischemic penumbra，IP）時間窗和繼發(fā)性缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷，患者可接受率較低[3]。在IS引起的缺血、缺氧和營養(yǎng)缺乏等應激條件下，IP神經(jīng)元的自噬過程被激活。研究認為，自噬對IP神經(jīng)元存活至關重要[4]，提示自噬可能是治療IS的重要靶點。IS神經(jīng)元損傷與氧供需失衡有關。缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）是IS缺氧的關鍵反應物之一，mTOR是調節(jié)自噬經(jīng)典信號通路的關鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下，HIF-1α可負調節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）并誘導自噬[5]。異鉤藤堿（isorhynchophylline，IRN）是一種從鉤藤中提取的四環(huán)羥吲哚生物堿，具有抗炎、抗凋亡、抗神經(jīng)毒性、調節(jié)自噬等作用[6]。但目前關于IRN對腦損傷尤其是對IS腦損傷的影響及可能作用機制方面的報道較少，故本實驗擬利用線栓法致大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）以構建IS模型，并以依達拉奉作為陽性對照，探討IRN對IS模型大鼠I/R腦損傷和神經(jīng)元自噬的影響，分析其可能作用機制是否與HIF1α/mTOR通路有關，以期為IRN臨床應用及IS臨床治療提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級雄性Wistar大鼠75只，體質量（200±20）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0013。實驗前大鼠于24 ℃恒溫、50%恒濕環(huán)境下，適應性飼養(yǎng)1周，12 h光-暗交替，自由獲得飲水、飼料。本研究動物處置符合“3R”原則，經(jīng)河南省中醫(yī)院動物倫理委員會批準，倫理批號：HNZY-2020078。

1.2 藥品與試劑 IRN（純度≥98%，批號：6859-01-4）購自成都儀睿生物科技有限公司；依達拉奉（純度≥99%，批號：89-25-8）購自美國Sigma公司；TTC染色試劑盒（批號：298-96-4）購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗微管相關蛋白1輕鏈3B（microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC3B）（批號：ab63817）、HIF-1α單克隆抗體（批號：ab179483）、mTOR單克隆抗體（批號：ab134903）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）單克隆抗體（批號：ab137133）、自噬相關蛋白Beclin1單克隆抗體（批號：ab207612）、自噬降解底物P62蛋白（autophagy degradation substrate p62 protein，p62）單克隆抗體（批號：ab91526）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 Oxylab LDF型激光多普勒血流儀（北京拜安吉科技有限公司）；PerkinElmer EnVision型多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）。

1.4 分組與給藥 75只大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、IRN低劑量組、IRN高劑量組、依達拉奉組，每組15只。其中IRN低劑量組、IRN高劑量組大鼠腹腔注射給藥劑量分別為20、40 mg/（kg·d）[7]；依達拉奉組大鼠腹腔注射給藥劑量為3 mg/（kg·d）[8]；假手術組及模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

1.5 IS大鼠模型構建 末次給藥后，禁食不禁水12 h，除假手術組外，其他各組利用腔內MCAO誘導制備IS模型大鼠[9]，具體操作：腹腔注射水合氯醛（0.4 g/kg）麻醉大鼠，將其放于溫控加熱墊上操作以保持正常體溫。頸部中線切口，分離右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，將一根帶硅膠珠尖端的4/0單絲尼龍經(jīng)頸外動脈插入右側頸內動脈，阻斷右側大腦中動脈血液供應，激光多普勒血流儀監(jiān)測右側大腦中動脈的血流量，見血流量下降并低于基線30%即成功缺血，缺血2 h后撤回單絲進行血液再灌注。假手術組大鼠未中斷血液供應，其他手術操作同上。

1.6 觀察指標

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分 血液再灌注24 h后，由實驗不知情研究人員評估各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分[10]：正常，對稱運動，無任何異常體征計0分；提尾時對側前肢屈曲計1分；大鼠步態(tài)不穩(wěn)，向腦損傷一側轉圈計2分；無法支撐身體而右側躺臥計3分；意識水平降低，無自發(fā)性活動計4分；死亡計5分。

1.6.2 TTC染色測定腦梗死面積 麻醉大鼠并脫頸處死，取7只大鼠腦組織并稱重（濕質量），作2 mm冠狀冷凍切片，于37 ℃的2% TTC染液中孵育30 min，4%多聚甲醛4 ℃固定6 h。正常組織區(qū)域為紅色，缺血梗死區(qū)因無線粒體酶活性而呈白色。采用Image J圖像分析軟件計算腦梗死面積，梗死面積百分比=白色面積/總面積×100%。

1.6.3 腦組織水含量測定 TTC染色后的腦切片于110 ℃干燥48 h，稱重（干質量）。腦組織水含量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.6.4 HE染色檢測大鼠腦組織病理變化 取剩余8只大鼠部分腦組織，常規(guī)石蠟包埋制備5 μm厚度腦切片。二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木精染色2 min，伊紅染色1 min，常規(guī)脫水，透明，中性樹脂封片。400倍鏡下觀察并記錄各組大鼠腦組織切片病理情況。神經(jīng)元細胞核呈藍色，細胞質呈不同程度的紅色。

1.6.5 TUNEL染色檢測腦組織細胞凋亡 按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書，取上述石蠟切片，加入生物素標記液37 ℃反應1 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗3次，加入Streptavidin-HRP工作液室溫孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色，脫水透明，封片觀察。400倍鏡下，隨機選取5個視野，計數(shù)TUNEL陽性細胞，陽性凋亡細胞核或細胞質在顯微鏡下呈褐色。凋亡指數(shù)（%）=凋亡陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.6.6 Western blotting法檢測HIF-1α/mTOR通路相關因子蛋白表達 分離的缺血側腦組織加入適量裂解液，勻漿裂解，后經(jīng)4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清，測定蛋白濃度后加熱變性，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。各組蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（壓縮膠60 V 25 min，分離膠120V 70min），后轉移至PVDF膜上（轉膜條件200mA 120min），PVDF膜于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，后于一抗內（HIF-1α、Beclin1均以1∶1 000稀釋；mTOR、p62均以1:8 000稀釋；p-mTOR以1∶5 000稀釋；LC3B以1∶2 000稀釋）4 ℃孵育過夜。次日洗膜，后于辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗（以1∶8 000稀釋）內室溫孵育1 h，TBST洗膜3～6次后，ECL顯影，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照記錄。利用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ、Beclin1、p62與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達拉奉組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與IRN低劑量組比較，bP＜0.05；與IRN高劑量組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠腦梗死情況比較 假手術組大鼠腦組織呈紅色均染，未見梗死；模型組、IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織可見明顯梗死灶。與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦梗死面積百分比均明顯減?。≒＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦梗死面積百分比均明顯減?。≒＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達拉奉組大鼠腦梗死面積百分比明顯減?。≒＜0.05）。（見圖1、表2）

表2 各組大鼠腦梗死情況比較（）

表2 各組大鼠腦梗死情況比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與IRN低劑量組比較，bP＜0.05；與IRN高劑量組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠腦組織水含量比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織水含量明顯增多（P＜0.05）；與模型組比較，IRN低、高劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織水含量均明顯減少（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織水含量均明顯減少（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達拉奉組大鼠腦組織水含量明顯減少（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠腦組織水含量比較（）

表3 各組大鼠腦組織水含量比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與IRN低劑量組比較，cP＜0.05；與IRN高劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學觀察 假手術組大鼠缺血側腦皮質神經(jīng)元排列緊密，結構完整，形狀規(guī)則，核仁清晰，未見水腫及炎癥細胞浸潤；模型組大鼠神經(jīng)元出現(xiàn)明顯核仁固縮，排列散亂且有空泡，形狀不規(guī)則；與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織神經(jīng)元固縮逐漸減輕，形態(tài)逐漸規(guī)則，排列逐漸緊密。（見圖2）

2.5 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況 假手術組大鼠腦組織神經(jīng)元呈淡藍色，排列有序，結構完整；模型組大鼠可見大量棕色凋亡細胞，細胞固縮，排列無序；與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織陽性凋亡細胞逐漸減少，形態(tài)逐漸改善。與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達拉奉組凋亡指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組、依達拉奉組凋亡指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達拉奉組凋亡指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）。（見圖3、表4）

表4 各組大鼠缺血側腦皮質細胞凋亡指數(shù)比較（）

表4 各組大鼠缺血側腦皮質細胞凋亡指數(shù)比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與IRN低劑量組比較，bP＜0.05；與IRN高劑量組比較，cP＜0.05

2.6 各組大鼠腦組織HIF1α/mTOR通路相關因子蛋白表達情況 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織中HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達拉奉組大鼠腦組織HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達拉奉組大鼠腦組織HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）。5組大鼠腦組織mTOR蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表5、圖4）

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、p62 蛋白相對表達量比較（）

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、p62 蛋白相對表達量比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與IRN低劑量組比較，cP＜0.05；與IRN高劑量組比較，dP＜0.05

3 討 論

IS發(fā)病機制復雜，大腦某一區(qū)域血液循環(huán)發(fā)生障礙時，可導致腦組織缺氧及葡萄糖供應不足，引起谷氨酸相關的興奮性毒性、炎癥、氧化應激和細胞凋亡等一系列病理反應，進而啟動細胞死亡途徑，影響神經(jīng)行為功能[11]。

腦缺血的主要臨床表現(xiàn)為局灶性腦缺血，如短暫或永久性MCAO，因與IS非常相似而常用于探討IS實驗模型動物研究[12]。本研究結果顯示，經(jīng)短暫閉塞大腦中動脈后再灌注，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高，腦梗死面積百分比明顯增大，腦組織水含量明顯增多，神經(jīng)元出現(xiàn)明顯核仁固縮，排列散亂且有空泡，凋亡細胞指數(shù)明顯升高，提示MCAO可致嚴重I/R損傷，成功構建IS模型大鼠。神經(jīng)元形態(tài)異常及高死亡率為I/R損傷標志，腦組織水含量可評估腦水腫程度。腦水腫可導致顱內壓升高，是IS治療關鍵[13]。依達拉奉是一種抗氧化劑和氧自由基清除劑，具有抗炎、增加血流量、減少神經(jīng)損傷及改善神經(jīng)功能等作用，常用作治療腦卒中[14]。有研究表明，IRN可減輕I/R損傷大鼠腦梗死程度，降低腦缺血側神經(jīng)元死亡率及腦含水量[15]。本研究結果顯示，經(jīng)低、高劑量IRN及依達拉奉治療后，IS模型大鼠腦組織病理損傷情況明顯改善，神經(jīng)功能缺損評分及腦梗死程度均明顯降低，腦組織水含量明顯減少，凋亡細胞指數(shù)明顯降低，提示IRN具有改善IS模型大鼠腦損傷的作用。

自噬在IS神經(jīng)元死亡調控中起雙重作用[16]。適度自噬可通過消除受損的組織及蛋白質來拯救受損細胞，而過度自噬可促進細胞內容物降解，導致細胞死亡，最終損傷組織器官。LC3為自噬體的特異性標志物；p62可以作為自噬通量的衡量標準，被認為與自噬降解呈負相關。自噬形成時，胞漿型LC3（LC3-Ⅰ）會酶解掉一小段多肽，轉變?yōu)樽允审w膜型（LC3-Ⅱ）。當LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達水平降低時，p62在細胞中積聚，自噬受阻，可導致自噬活性降低[17]。Beclin1是自噬的關鍵參與者，被認為參與調節(jié)自噬體合成與成熟[18]。研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中恢復期神經(jīng)元自噬水平較高[19]。本研究結果顯示，模型組大鼠腦組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對表達量明顯升高，p62蛋白相對表達量明顯降低，提示自噬發(fā)生和自噬活性較強；而經(jīng)低、高劑量IRN及依達拉奉治療后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1及p62表達情況發(fā)生逆轉，提示IRN可抑制IS大鼠神經(jīng)元自噬體形成，降低自噬活性。

IS缺血狀態(tài)可誘導HIF-1轉錄，HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異源二聚體，其活性由HIF-1α決定。常氧條件下，HIF-1α被蛋白酶體降解；缺氧條件下，蛋白酶體可抑制HIF-1α降解，穩(wěn)定HIF-1α與分子伴侶的結合進而增加HIF-1活性。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α信號通路可以促進缺氧誘導的自噬[20]，自噬受mTOR信號通路負性調控，能量缺乏可導致mTOR活性失活從而導致自噬增加[21]。mTOR可通過調節(jié)HIF-1α影響凋亡與自噬，缺氧狀態(tài)下HIF-1α可反向調節(jié)mTOR，HIF-1α過表達通常伴隨mTOR途徑的抑制[22]。本研究結果顯示，模型組大鼠HIF-1α蛋白相對表達量明顯升高，mTOR磷酸化水平明顯降低，提示IS大鼠在腦卒中氧糖剝奪情況下，可出現(xiàn)HIF-1α響應及mTOR失活而促進自噬發(fā)生。經(jīng)IRN低劑量組、IRN高劑量及依達拉奉治療后，HIF-1α及mTOR磷酸化水平被逆轉，提示HIF-1α降解和mTOR激活可促進IS模型大鼠腦組織損傷的恢復。

綜上所述，IRN可通過減輕IS模型大鼠神經(jīng)功能缺損及腦水腫，減少腦梗死并降低神經(jīng)元凋亡水平，改善腦組織病理損傷，其作用機制可能與抑制HIF1α表達、激活mTOR信號進而抑制IS模型大鼠神經(jīng)元過度自噬有關。