郭東星,胡文娟,李 丹,李靜宜,吳趙永,栗紹剛,田秀君,辛德莉
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)能夠引起肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)和其他呼吸道感染性疾病[1-3]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素(多西環(huán)素及米諾環(huán)素等)和氟喹諾酮類藥物是臨床上常用于治療MPP的藥物。其中,氟喹諾酮類藥物是治療成人MPP的主要藥物,由于氟喹諾酮類及四環(huán)素類藥物可能對(duì)兒童的發(fā)育造成一定影響,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素成為治療兒童MPP的首選藥物。但伴隨著抗生素的使用,相應(yīng)的耐藥MP也出現(xiàn)了較大規(guī)模的流行,尤其在亞洲地區(qū),MP耐藥率呈增高趨勢(shì)[4-5],給治療相關(guān)疾病帶來了極大挑戰(zhàn)。
23S rRNA基因可變區(qū)域肽基轉(zhuǎn)移酶環(huán)的點(diǎn)突變可以干擾大環(huán)內(nèi)酯類藥物與rRNA的結(jié)合,是MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機(jī)制[6-7]。其中,A2063G是最常見的突變,可導(dǎo)致MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物較高水平的耐藥性[4,6,8-11]。前期研究結(jié)果表明,在MP感染者體內(nèi),耐藥菌株與敏感野生菌株以混合菌群的形式存在[12],耐藥菌群所占比例與臨床用藥種類、劑量及治療效果密切相關(guān)。建立有效的檢測(cè)MP菌群中耐藥MP比例的方法,對(duì)于制定MPP臨床治療方案和研究MP耐藥發(fā)生發(fā)展規(guī)律具有重要意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),MP在感染者體內(nèi)是以混合菌群的狀態(tài)存在,另有病例報(bào)道稱,MP感染者體內(nèi)菌株的藥物敏感性可能隨著治療的進(jìn)程會(huì)發(fā)生變化[13]。因此,在MP感染者體內(nèi),支原體菌群可能隨著治療藥物的使用和病程的進(jìn)展發(fā)生耐藥變異,并在一定的選擇壓力下,菌群中耐藥菌株和敏感菌株的相對(duì)占比也在不斷發(fā)生變化。目前臨床中常用的檢測(cè)方法僅能夠檢測(cè)是否MP感染或是否存在耐藥MP,無法檢測(cè)耐藥MP的相應(yīng)占比。
本課題組前期建立了檢測(cè)咽拭子樣本中MP耐藥突變的ASPCR方法[12]。但在之前的研究中,ASPCR方法多為染料法[12,14-15],在檢測(cè)臨床樣本時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增,在結(jié)果分析時(shí)須要結(jié)合擴(kuò)增曲線和熔解曲線進(jìn)行判讀,對(duì)臨床檢測(cè)人員的技術(shù)要求較高,且會(huì)耗費(fèi)一定時(shí)間,一旦出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增就會(huì)直接影響耐藥菌株比例計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性,進(jìn)而須要對(duì)樣本進(jìn)行重新檢測(cè)。因此,為了克服以上缺陷,我們對(duì)前期的染料法ASPCR進(jìn)行了改進(jìn),建立了檢測(cè)MP A2063G耐藥突變的探針ASPCR方法,并對(duì)該方法的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度和檢測(cè)臨床樣本的性能進(jìn)行驗(yàn)證。
1.1 材料
1.1.1 咽試子樣本 本研究中用于方法驗(yàn)證的58份臨床咽拭子樣本采集自2014年民航總醫(yī)院兒科門診及住院的臨床診斷為疑似MMP的2~12歲患兒。
1.1.2 菌株 MP標(biāo)準(zhǔn)株M129(ATCC 29342)為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存菌株,大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、黏液奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、梨狀支原體、發(fā)酵支原體、假單胞菌、解脲支原體等用于驗(yàn)證方法特異性的臨床分離菌株,均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科饋贈(zèng)。
1.1.3 主要試劑和儀器 基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。配制實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系用的TaqManTMUniversal Master Mix II和ABI Prism@7500型熒光定量PCR儀均為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 方法建立 引物/探針組合設(shè)計(jì):根據(jù)MP23S rRNA基因序列(GenBank, accession No.NR_077056)設(shè)計(jì)特異性引物/探針組(SP-2063-F,2063D-R和S2P-AS-18)和非特異性引物/探針組[NU-F(Np),2063D-R 和 N2P-AS-16](表1)。特異性引物/探針組合在一些特定的基因位點(diǎn)以次黃嘌呤核苷酸代替,以提高特異性引物/探針組合的特異性,最終能夠選擇性地?cái)U(kuò)增含有A2063G突變的DNA模板,用于對(duì)耐藥菌株進(jìn)行定量;而非特異性引物/探針組合能夠擴(kuò)增所有MP DNA模板,用于對(duì)總菌群進(jìn)行定量。
表1 引物及探針序列及其在M129基因組中的位置信息Table 1 Oligonucleotide sequences and locations on the M129 genome
標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建:以M129標(biāo)準(zhǔn)株為模板,擴(kuò)增全長(zhǎng)23S rRNA基因片段,連接至pMD18-T載體中,構(gòu)建含2063位點(diǎn)的野生型質(zhì)粒;在野生型質(zhì)?;A(chǔ)上對(duì)2063位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建突變型質(zhì)粒,將2種基因型質(zhì)粒梯度稀釋為10~106拷貝/μl后作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用特異性引物/探針組和非特異性引物/探針組分別擴(kuò)增含A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品(3復(fù)孔,Ct=Ct平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(lg),縱坐標(biāo)為相應(yīng)Ct值,分別繪制出定量突變型模板的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量總MP的非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線。
反應(yīng)體系:TaqManTMUniversal Master Mix II:10 μl,10 μmol/L 的 SP-2063-F/2063D-R 或 NU-F(Np)/2063D-R 引物各 1 μl,探針 S2P-AS-18或S2P-AS-16 0.5 μl,DNA 模板 1.0 μl,ddH2O 6.5 μl,總體積 20.0 μl。
擴(kuò)增條件:60 ℃ 30 s;95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40循環(huán);60 ℃ 30 s,熒光檢測(cè)信號(hào)激發(fā)基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別選為FAM和NFQ-MGB。
1.2.2 方法性能驗(yàn)證
1.2.2.1 檢測(cè)MP特異性驗(yàn)證 采用非特異性引物/探針組擴(kuò)增臨床常見感染呼吸道且易與MP發(fā)生交叉反應(yīng)的菌種(大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、人型支原體、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、黏液奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、梨狀支原體、發(fā)酵支原體、假單胞菌、解脲支原體)和M129標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較,以驗(yàn)證新建探針ASPCR方法檢測(cè)MP的特異性。
1.2.2.2 檢測(cè)MP A2063G耐藥突變特異性驗(yàn)證 主要從以下2個(gè)方面進(jìn)行驗(yàn)證:①用特異性引物/探針組分別擴(kuò)增等量的突變型(2063G)與野生型(2063A)DNA模板,比較2者的Ct值的差值(△Ct),△Ct值的大小代表了特異性引物/探針組區(qū)分2種基因型能力的強(qiáng)弱,即△Ct值越大表明該方法檢測(cè)A2063G突變的特異度越好;②用特異性引物/探針組測(cè)定野生型和突變型混合模板的Ct值,比較其Ct值與特異性引物/探針組擴(kuò)增對(duì)應(yīng)等量的突變型DNA模板的Ct值,2者一致性越好,說明該方法檢測(cè)A2063G耐藥突變的特異度越高。
1.2.2.3 檢測(cè)MP靈敏度驗(yàn)證 用非特異性引物/探針組進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng), MP DNA模板為10~106拷貝/反應(yīng),驗(yàn)證該方法檢測(cè)MP的靈敏度。
1.2.2.4 檢測(cè)MP A2063G耐藥突變靈敏度驗(yàn)證 使用特異性引物/探針組擴(kuò)增105拷貝野生型模板,共重復(fù)3次,定義臨界值=Ct平均值+標(biāo)準(zhǔn)差;使用特異性引物擴(kuò)增突變比例為0.01%~100%的混合模板,得到相應(yīng)的Ct值(Ct平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)并與臨界值進(jìn)行比較,小于臨界值說明混合物中存在突變模板,大于臨界值說明突變無法檢出,可檢出最低突變比例即為該方法檢測(cè)A2063G耐藥突變的靈敏度。
1.2.2.5 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 用非特異性引物/探針組和特異性引物/探針組分別擴(kuò)增突變模板含量為0.01%~100%的混合DNA,分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,計(jì)算出混合模板的突變比例(檢測(cè)突變比例=特異性擴(kuò)增模板拷貝數(shù)/非特異性擴(kuò)增模板拷貝數(shù)×100%)。比較該方法的檢測(cè)突變比例與理論突變比例值,2者一致性越高,則該方法的準(zhǔn)確度越高。
1.2.2.6 檢測(cè)臨床標(biāo)本性能驗(yàn)證 采用新建立的探針ASPCR方法、巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法和前期建立的染料ASPCR方法分別檢測(cè)58份臨床咽拭子標(biāo)本,通過比較該方法與其他2種方法的檢測(cè)結(jié)果,評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)MP感染的性能,通過比較該方法與染料ASPCR方法的檢測(cè)結(jié)果,驗(yàn)證該方法檢測(cè)野生型和耐藥型MP比例的性能。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)新建探針ASPCR與染料ASPCR方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)ASPCR方法與巢式PCR聯(lián)合測(cè)序方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行陽性符合率、陰性符合率、總符合率分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線特異性引物/探針組(SP-2063-F,2063D-R和S2P-AS-18)和非特異性引物/探針組[NU-F(Np),2063D-R和N2P-AS-16]分別擴(kuò)增含A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品(3復(fù)孔,Ct=Ct平均值±標(biāo)準(zhǔn)差),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=-3.15x+38.95,R2=1.00;特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=-3.2044x+38.961,R2=0.999;2條標(biāo)準(zhǔn)曲線幾乎重合,表明新建探針ASPCR方法檢測(cè)模板拷貝數(shù)與相應(yīng)Ct值之間具有良好的相關(guān)性,能夠應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。
圖1 擴(kuò)增A2063G的特異性和非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線◆所在直線為非特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品得到的非特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線;●所在直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品得到的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Specific and non-specific standard curves of A2063G
2.2 方法性能驗(yàn)證
2.2.1 檢測(cè)MP特異度驗(yàn)證 新建探針ASPCR方法檢測(cè)用以驗(yàn)證特異性的菌種,均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào),結(jié)果見表2。由此可見,該方法檢測(cè)MP具有良好的特異度。
表2 探針ASPCR方法的特異度Table 2 Specificity of the probe ASPCR
2.2.2 檢測(cè)MP A2063G耐藥突變特異度驗(yàn)證 ①用特異性引物/探針組分別擴(kuò)增105拷貝的突變型(2063G)與野生型(2063A)DNA模板,△Ct值約為10.93(圖2A);特異性引物/探針組能夠正常擴(kuò)增104和103拷貝突變型模板(見標(biāo)準(zhǔn)曲線),但擴(kuò)增104和103拷貝野生型模板時(shí),無擴(kuò)增信號(hào)。②將107拷貝/μl的突變型模板視作突變型比例100%,用106拷貝/μl的野生型質(zhì)粒梯度稀釋含2063G的突變模板,得到突變比例為50%~0.01%的混合模板,對(duì)該混合模板進(jìn)行檢測(cè),其Ct值仍與相應(yīng)濃度的純突變型模板具有良好的一致性(圖2B)。說明特異性引物/探針組能夠有效區(qū)分突變型和野生型,具有良好的檢測(cè)A2063G耐藥突變的特異度。
圖2 探針ASPCR方法特異度驗(yàn)證A.分別為特異性引物/探針組擴(kuò)增105拷貝/μl A2063G突變模板和野生型模板的擴(kuò)增曲線,△Ctab(Ctb- Cta)=10.93;B.◆所在直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品得到的特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線,●所在直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增梯度稀釋的A2063G突變型模板和5×106拷貝/μl野生型模板的混合物DNAFigure 2 Allelic discrimination of the probe ASPCR assay
2.2.3 靈敏度與準(zhǔn)確度驗(yàn)證 用特異性和非特異性引物/探針組分別擴(kuò)增相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品,所得擴(kuò)增曲線梯度均勻,靈敏度均達(dá)10拷貝(圖3~4)。
圖3 特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變基因的靈敏度特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線,從左到右依次為108~101拷貝Figure 3 Sensitivity of the specific primers and probe for testing A2063G
圖4 非特異性引物/探針組擴(kuò)增目的基因的靈敏度非特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變型標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線,從左到右依次為108~101拷貝Figure 4 Sensitivity of the non-specific primers and probe
根據(jù)計(jì)算所得臨界值為33.96;使用特異性引物擴(kuò)增突變比例為100%~0.01%的混合模板,得到相應(yīng)的Ct值均<臨界值(圖5)。用非特異性和特異性引物/探針組同時(shí)擴(kuò)增混合模板,實(shí)際檢測(cè)突變比例與理論突變比例值具有良好的一致性(圖6),說明探針ASPCR方法檢測(cè)MP A2063G耐藥突變具有良好的準(zhǔn)確度。另外,當(dāng)理論突變比例為0.01%時(shí)其相應(yīng)的Ct值仍顯著小于臨界值;當(dāng)理論突變模板比例為0.1%時(shí),與檢測(cè)到的比例具有良好一致性,低于0.1%時(shí),測(cè)得值將顯著偏離理論值,因此結(jié)合靈敏度和準(zhǔn)確度的驗(yàn)證結(jié)果,最終確定探針ASPCR方法檢測(cè)MP耐藥位點(diǎn)的靈敏度可達(dá)0.1%。
圖5 探針ASPCR方法檢測(cè)A2063G靈敏度圖中直線為特異性引物/探針組擴(kuò)增105拷貝/μl野生型模板得到的臨界值;●為特異性引物/探針組擴(kuò)增A2063G突變模板比例為100%~0.01%的混合物所得Ct值Figure 5 Sensitivity of the probe ASPCR assay
圖6 探針ASPCR方法檢測(cè)A2063G準(zhǔn)確度橫坐標(biāo)軸為A2063G突變模板理論比例,縱坐標(biāo)軸為0.01%~100%的混合模板的檢測(cè)比例Figure 6 Accuracy of of the probe ASPCR assay
2.2.4 臨床標(biāo)本檢測(cè)應(yīng)用 使用新建探針ASPCR方法、染料ASPCR方法和巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法分別檢測(cè)58份臨床咽拭子標(biāo)本。探針ASPCR方法和染料ASPCR方法檢測(cè)MP感染陰、陽性結(jié)果一致,總陽性率相同,均為94.83%(55/58);巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法檢測(cè)MP陽性率為75.86%(44/58),ASPCR和巣式PCR方法同時(shí)檢測(cè)為陽性樣本44份,同為陰性3份,陽性符合率是80.00%,陰性符合率是100%、總符合率是81.00%。其中探針法和染料法2種ASPCR方法檢測(cè)結(jié)果中野生型、A2063G突變型和混合菌群的樣本數(shù)量分別為20/16(<S%)、10/14(100%)、20/21(≥20%,<100%)(見表3)。配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,t=2.057 ,P=0.044,說明染料ASPCR方法檢測(cè)的A2063G耐藥突變比例顯著高于探針ASPCR方法檢測(cè)的結(jié)果。探針ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的擴(kuò)增結(jié)果見圖7~9。
表3 探針ASPCR方法和染料ASPCR方法檢測(cè)A2063G結(jié)果比較(例)Table 3 Comparison of the results of dye-ASPCR and probe-ASPCR for testing A2063G (cases)
圖7 混合基因型臨床樣本檢測(cè)結(jié)果探針ASPCR方法檢測(cè)混合(野生型+A2063G)臨床樣本的擴(kuò)增曲線:a.是用非特異性引物擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線;b.是A2063G特異性引物擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖,說明樣本中肺炎支原體是混合菌群,同時(shí)含有野生型和耐藥突變型Figure 7 Results of probe ASPCR testing clinical sample with mixed genotype
圖8 野生型基因型臨床樣本檢測(cè)結(jié)果探針ASPCR方法檢測(cè)野生型臨床樣本的擴(kuò)增曲線:a.是用非特異性引物擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線;b.是A2063G特異性引物擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果(未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)),說明樣本中肺炎支原體均為敏感型,無耐藥突變Figure 8 Results of probe ASPCR testing clinical sample with wild genotype
圖9 突變基因型臨床樣本檢測(cè)結(jié)果探針ASPCR方法檢測(cè)突變型臨床樣本的擴(kuò)增曲線,特異性引物/探針組和非特異性引物/探針組擴(kuò)增樣本的曲線完全重合,說明樣本中肺炎支原體耐藥比例為100%Figure 9 Results of probe ASPCR testing clinical sample with mutant genotype
位于23S rRNA V區(qū)域的A2063G和A2064G點(diǎn)突變能夠干擾大環(huán)內(nèi)酯類藥物與MP rRNA的結(jié)合,是MP耐藥發(fā)生的主要機(jī)制[15-16]。其中,A2063G突變是耐藥MP的最主要突變類型[17-18]。本研究建立了具有高靈敏度的探針ASPCR方法,能夠準(zhǔn)確檢測(cè)微量A2063G耐藥突變。采用該方法能夠研究MP感染者體內(nèi)的不同時(shí)期的23S rRNA變異情況,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MP藥物敏感性的變化情況,是進(jìn)一步研究大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥發(fā)生發(fā)展機(jī)制的有利工具,并能夠?yàn)榕R床治療方案的制定提供有效依據(jù)。
探針ASPCR方法建立的難點(diǎn)在于特異性引物和相應(yīng)探針組合的設(shè)計(jì),要求該引物探針組合能夠特異性地?cái)U(kuò)增突變樣本,就需要盡量降低其擴(kuò)增野生型模板的效率但其擴(kuò)增突變型模板的效率不能有明顯影響。理論上,當(dāng)引物3’末端堿基與模板堿基不完全匹配時(shí),其擴(kuò)增反應(yīng)效率則會(huì)大幅降低,甚至無法擴(kuò)增,但在研究過程中我們發(fā)現(xiàn),特異性引物序列當(dāng)中僅末端堿基不匹配時(shí),在模板足量的情況下,野生型模板仍能夠有較高程度的擴(kuò)增。為此,除了末端堿基外,我們?cè)谔禺愋砸锏钠渌恢靡苍O(shè)計(jì)了數(shù)個(gè)不完全匹配堿基(次黃嘌呤),以提高特異性引物對(duì)突變型和野生型模板的區(qū)分能力。次黃嘌呤的位置及數(shù)量對(duì)引物的特異性影響很大,須反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外,研究過程中我們發(fā)現(xiàn),在特異性引物/探針組合中,除了特異性引物外,探針的序列對(duì)組合的特異性也有一定影響。在本研究中,對(duì)18組引物/探針組合進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)篩選,最終選定表1中所列出的特異性引物/探針組合。
本研究中的探針ASPCR方法是在前期建立的染料ASPCR方法的基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)引物/探針組合建立的一種新的ASPCR方法。對(duì)2種方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):①2者判讀結(jié)果的方法存在差異。探針ASPCR方法在能夠根據(jù)擴(kuò)增曲線直接讀取結(jié)果,而染料ASPCR方法對(duì)多種上呼吸道感染常見病原體均出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng),需要同時(shí)結(jié)合擴(kuò)增曲線(Ct值)和熔解曲線(Tm值)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀。②2種ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的能力不同。臨床樣本檢測(cè)結(jié)果中常有耐藥菌和敏感菌混合存在的情況,采用染料ASPCR方法常會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增的情況,此時(shí)其Ct值會(huì)小于其真實(shí)值,最終導(dǎo)致計(jì)算出的MP耐藥比例存在一定誤差,這也是導(dǎo)致2種ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本時(shí),染料ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的耐藥比例高于探針ASPCR方法檢測(cè)結(jié)果(表3)的主要原因,甚至當(dāng)熔解曲線出現(xiàn)雙峰時(shí),還需要對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)查。因此,該方法檢測(cè)臨床樣本的特異性相對(duì)探針ASPCR方法較低,對(duì)實(shí)驗(yàn)者的要求也較高。而本研究中新建立的探針ASPCR方法,因其加入了探針,提高了擴(kuò)增的特異性,可以根據(jù)Ct值即可直接判讀結(jié)果,符合臨床檢驗(yàn)工作人員的判讀習(xí)慣。
本研究將2種ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本的結(jié)果與巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法的結(jié)果進(jìn)行了比較:ASPCR方法法檢測(cè)MP的陽性率高于傳統(tǒng)巢式PCR方法。巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法一般只能檢測(cè)出主要基因型,不能檢測(cè)出混合株中的其他微量基因型,在這方面,ASPCR方法檢測(cè)臨床標(biāo)本檢測(cè)能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)巢式PCR聯(lián)合DNA測(cè)序法。另外,本研究中,探針ASPCR方法檢測(cè)臨床樣本結(jié)果顯示,在近一半[45.45%(25/55)]的感染者體內(nèi),MP以敏感菌和耐藥菌混合菌群的形式存在,且在MP陽性樣本中,耐藥菌和敏感菌都可能以優(yōu)勢(shì)菌種的形式存在。這說明,在臨床用藥前,很有必要采用ASPCR方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),分析其中耐藥菌和敏感菌的組成比例及其優(yōu)勢(shì)種群,為臨床用藥選擇提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。