余 聰，方曉峰，彭盛峰

(1．江西省藥品檢查員中心，330029，南昌；2．食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，330047，南昌)

0 引言

黃素(Curcumin)是姜黃和其他植物根莖中發(fā)現(xiàn)的一種親脂性的多酚類(lèi)物質(zhì)，也是姜黃中最具生物活性的成分。大量研究表明，其具有抗炎、抗氧化等廣泛的藥理活性，且毒性低、不良反應(yīng)小[1-7]。姜黃素在世界范圍內(nèi)得到多種不同形式的認(rèn)可和使用，如印度，含有姜黃素的姜黃被用于咖喱中；在泰國(guó)，它用于化妝品；在中國(guó)，它被用作著色劑；在美國(guó)，除了膠囊劑和粉末劑外，它還用于芥末醬、奶酪、黃油和薯片中，作為防腐劑和著色劑。姜黃素是目前世界上銷(xiāo)量最大的天然食用色素之一，但單獨(dú)攝入姜黃素不會(huì)帶來(lái)相關(guān)的健康益處，這主要是由于吸收不良、新陳代謝與消除迅速所致，且其在水中的溶解性也極差，這些缺點(diǎn)極大地限制了其在食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用與發(fā)展[8]。

植物乳是用含蛋白質(zhì)和脂肪的植物種子(如大豆、核桃、花生等)或果實(shí)(如椰子等)鮮榨后得到的制品，其中存在植物油體和多種植物蛋白。油體(oil body)是子葉細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的儲(chǔ)存形式，其核心由疏水性甘油三酯構(gòu)成，周?chē)粚恿字?，其中嵌入了各種兩親性的蛋白。油體蛋白通過(guò)在油體的疏水成分和親水細(xì)胞質(zhì)之間形成一個(gè)界面來(lái)穩(wěn)定油體，其所提供的靜電斥力和電阻滯力對(duì)油體的完整性和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用[9-10]。因此，油體存在的疏水核心和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使其極為適合作為包埋姜黃素的天然載體。植物乳中還存在有多種天然的植物蛋白，可作為天然的乳化劑對(duì)姜黃素進(jìn)行包埋。然而目前關(guān)于植物乳中單獨(dú)組分對(duì)姜黃素的包埋研究較少，且對(duì)負(fù)載姜黃素后的產(chǎn)品的消化特性也尚不清晰。

因此，本研究以花生乳為研究對(duì)象，分離得到花生粗、精油體、全脂乳和脫脂乳，測(cè)定不同產(chǎn)物的油水含量。采用pH驅(qū)動(dòng)的方法，對(duì)姜黃素進(jìn)行溶解包埋，測(cè)定其粒徑與電位，并通過(guò)體外消化模型對(duì)其在體外消化過(guò)程中消化特性進(jìn)行研究。本研究的結(jié)果有助于更有效的姜黃素營(yíng)養(yǎng)保健品的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

花生(山東谷悅食品有限公司)；姜黃素(C400222)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；牛膽鹽、口腔粘膜蛋白(M2378)、胃蛋白酶(P7125；酶活力≥400 U/mg)、胰酶(P1750；4×USP specifications)、脂肪酶(L3126；酶活力 100～400 U/mg)均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)上海Sigma Aldrich 公司；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液等試劑均為分析純，購(gòu)自西隴化工股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

MasterSizer 3000微米粒度儀(英國(guó)Malvern公司)；UV-1600PC紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)公司)； SHJ-4A水浴鍋(江蘇東鵬儀器制造有限公司)；907 Titrando pH-stat自動(dòng)電位滴定儀(瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司)；共焦掃描激光顯微鏡(尼康D-Eclipse C1 80i，梅爾維爾)。

1.3 油體的提取、純化與樣品制備

根據(jù)Tzen等[11]的方法對(duì)花生油體進(jìn)行提取與純化，并進(jìn)行了以下改進(jìn)。將200 g花生在pH為8.0的磷酸緩沖液(PBS)中按1:7 (w/w)的比例在4 ℃下浸泡16 h，然后丟棄浸泡培養(yǎng)基[12]。以1:7 (w/w)的比例在破壁機(jī)中破碎90 s。研磨后的漿液用3層紗布過(guò)濾。濾液轉(zhuǎn)移至400 mL管中，在4 ℃下以1 000 g離心30 min。上層用抹刀分離，在濾紙上瀝干(Whatman, 5級(jí))，稱(chēng)為粗油體。將制備的粗油體分散于pH為8.0的PBS中，1:7(w/w)，離心10 000 g，30 min。重復(fù)上述操作3次，離心后取面霜層，所得物稱(chēng)之為精油體。破壁之后經(jīng)3層濾布所得漿液稱(chēng)之為全脂乳，離心后中間層稱(chēng)之為脫脂乳。所有樣品保存于4 ℃下，24 h內(nèi)完成分析。

1.4 油含量的測(cè)定

采用索氏提取法進(jìn)行油含量測(cè)定。稱(chēng)取2～10 g 樣品于蒸發(fā)皿中，加入約20 g海沙，于沸水浴上干燥，再于105 ℃下烘干，研細(xì)，轉(zhuǎn)移至濾紙筒中。搭好索氏提取裝置，將濾紙筒放入抽提管中，加入石油醚至2/3處。在60 ℃恒溫水浴抽提10 h。抽提回流結(jié)束后，回收石油醚，將收集瓶置于105 ℃下烘干至恒重，冷卻后稱(chēng)量。

油含量(%)=(收集瓶與樣品所含脂肪質(zhì)量-抽提瓶質(zhì)量)/樣品質(zhì)量× 100%

1.5 水分測(cè)定

取潔凈鋁制扁形稱(chēng)量瓶2個(gè)，置于105 ℃干燥箱中，瓶蓋斜蓋于瓶口，加熱1 h，取出蓋好，置于干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱(chēng)量，重復(fù)干燥至恒量m1。稱(chēng)取2份2 g樣品，分別放入2個(gè)稱(chēng)量瓶中(以下以“瓶1”“瓶2”標(biāo)號(hào))，樣品厚度約5 mm。加蓋，精密稱(chēng)量m2后，至105 ℃干燥箱中，瓶蓋斜蓋于瓶口，干燥4 h后，蓋好取出，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后稱(chēng)量。然后再放入105 ℃干燥箱中干燥1 h左右，取出，放干燥器內(nèi)冷卻0.5 h后再稱(chēng)量m3。至前后2次稱(chēng)量差不超過(guò)2 mg，即為恒量。水分含量由公式(1)計(jì)算：

(1)

1.6 pH驅(qū)動(dòng)法載入姜黃素

將稱(chēng)取的姜黃粉末完全溶解于的氫氧化鈉溶液(0.1 N NaOH)中，制備出10 mg/g的姜黃素原液。然后將堿性姜黃素原液加入到花生粗、精油體、全脂乳和脫脂乳中(1:10 w/w)，用鹽酸溶液快速調(diào)節(jié)，最終pH值為6。將添加姜黃素的乳液用雙蒸餾水稀釋?zhuān)玫胶?%油的最終體系，在室溫下攪拌10 min，以保證均勻性。最后，在體系中加入非食品級(jí)防腐劑疊氮化鈉(0.02%)，以抑制微生物的生長(zhǎng)。需要注意的是，pH驅(qū)動(dòng)的方法會(huì)在最終樣品中形成一些NaCl，因?yàn)槭褂肗aOH生成堿性溶液，然后加入HCl中和。根據(jù)初始NaOH濃度(0.1 M)和稀釋倍數(shù)(1:10)，預(yù)計(jì)最終樣品的NaCl水平在10 mM左右。

1.7 粒徑

粒徑的大小由商用的靜態(tài)光散射儀器在常溫下測(cè)定[13]。粒度數(shù)據(jù)被報(bào)告為表面加權(quán)平均直徑(d32)，樣品用相對(duì)應(yīng)pH值的去離子水稀釋。

1.8 負(fù)載姜黃素的油體及其副產(chǎn)物的體外消化特性

參考André等[14]的方法并作略微修改，利用模擬胃腸道模型開(kāi)展其體外消化實(shí)驗(yàn)，口腔：將餅干與口腔液(含3 mg/mL粘液素)按1:1比例混合，調(diào)節(jié)pH至6.8，孵育10 min；胃部：將口腔消化液與胃液(含3.2 mg/mL胃蛋白酶)按1:1比例混合，調(diào)節(jié)pH至2.5，孵育2 h；小腸：在胃消化食糜(30 mL)中加入腸液、膽鹽，再調(diào)節(jié)pH至接近7.0，加入脂肪酶，通過(guò)pH恒定滴定儀恒定pH至7.0。

游離脂肪酸消化速率：通過(guò)pH恒定滴定儀的NaOH滴定量表征其游離脂肪酸消化速率，由公式(2)計(jì)算：

FFA%=100×(VNaOH×mNaOH×Mlipid)/2Wliquid

(2)

式中：FFA為游離脂肪酸消化速率；VNaOH是中和脂質(zhì)分解出的酸所需的滴定液的體積，mNaOH是氫氧化鈉的物質(zhì)的量濃度，Mlipid是所使用的油的分子量，2表示一個(gè)甘油三酯釋放2個(gè)游離脂肪酸，Wliquid是消化系統(tǒng)中油脂的質(zhì)量(g)。

穩(wěn)定性和生物可接受率：體外消化模型結(jié)束后，將腸液以12 000 g離心30 min，收集中間膠束相。提取的含姜黃素溶液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在420 nm處檢測(cè)分析。使用事先準(zhǔn)備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定姜黃素濃度。生物可接受率(B*)與穩(wěn)定性(S*)測(cè)量由公式(3)、(4)計(jì)算:

B*=100×CMicelle/CDigesta

(3)

S*=100×CDigesta/CInitial

(4)

式中：CMicelle表示混合膠束層中姜黃素的濃度，CInitial表示在初餅干中姜黃素的濃度，CDigesta表示在總的小腸消化結(jié)后消化液中姜黃素的濃度。

1.9 共聚焦(CLSM)

使用共聚焦掃描激光顯微鏡200倍放大(20物鏡10目鏡)對(duì)樣品的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。以尼羅紅溶液(將尼羅紅溶解于乙醇中，最終濃度為1 mg/mL)的形式加入疏水熒光染料對(duì)樣品中的油區(qū)進(jìn)行染色。

1.10 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用SPSS 22分析軟件對(duì)數(shù)值進(jìn)行方差分析，通過(guò)Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 含油量與含水量

由表1可知，花生粗油體的含油量77.65%，略低于精油體的78.01%，含水量也呈現(xiàn)相似趨勢(shì)，粗油體中的含水量為18.13%，略低于精油體的19.23%。這些結(jié)果表明，精油體中除油、水外的物質(zhì)顯著低于粗油體，這可能是由于堿性的PBS在洗滌過(guò)程中除去了油體表面的雜蛋白[15]。全脂乳中油含量為4.99%，而脫脂乳中的油含量?jī)H為0.13%。這些結(jié)果對(duì)體外消化過(guò)程中原樣品的初始油含量的標(biāo)定具有重要意義。

表1 花生油體及其副產(chǎn)物的含油量與含水量

2.2 載入姜黃素的花生油體及其副產(chǎn)品的體外消化特性

2.2.1 油體及其副產(chǎn)品的游離脂肪酸釋放 通過(guò)pH驅(qū)動(dòng)的方法使用油體負(fù)載姜黃素，以同樣加入姜黃素的全脂乳和脫脂乳為對(duì)照，考察姜黃素在不同載體運(yùn)輸下的體外消化特性。游離脂肪酸釋放結(jié)果如圖1所示，粗、精油體的游離脂肪酸釋放結(jié)果無(wú)顯著性差異，這表明采用堿性PBS對(duì)油體進(jìn)行純化不會(huì)影響其游離脂肪酸的釋放。全脂乳中游離脂肪酸釋放速率最快，2 h后FFA值高達(dá)91.22%。而脫脂乳由于其油脂含量過(guò)低，在前30 min，游離脂肪酸基本完全釋放。

圖1 (a)NaOH的消耗量；(b)FFA釋放曲線(xiàn)

2.2.2 不同載體對(duì)姜黃素穩(wěn)定性與生物可接受率的影響 由圖2可知，脫脂乳中姜黃素的穩(wěn)定性最好為88.17%，顯著高于精油體(62.46%)、粗油體(64.96%)和全脂乳(73.96%)。精油體中姜黃素的生物可接受率為52.10%，顯著高于粗油體的39.92%。這歸因于純化過(guò)程中堿性PBS能夠去除油體中受污染的蛋白質(zhì)[15]，維持和增強(qiáng)油體界面蛋白膜的完整性和穩(wěn)定性，緩解其在胃環(huán)境下的蛋白水解[16]，從而提高姜黃素的生物可接受率。全脂乳中姜黃素的生物可接受最高為76.31%，這可能與油體的乳化性能有關(guān)，油體制備過(guò)程中殘留的油體具有較好的乳化能力[17]，加入姜黃素后，能夠形成較為穩(wěn)定的乳液，從而提升了姜黃素的生物可接受率和穩(wěn)定性。脫脂乳中姜黃素的生物可接受率僅為28.25%，這可能與姜黃素存在的形態(tài)有關(guān)，結(jié)晶形式的姜黃素生物利用度極低[18]。這些結(jié)果表明，花生油體具有包埋和保護(hù)姜黃素的能力，通過(guò)堿性溶液的純化可進(jìn)一步提升姜黃素的生物可接受率。

圖2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.3 負(fù)載姜黃素的不同顆粒在消化過(guò)程中的變化 由圖3可知， 不同種負(fù)載姜黃素的粒子在各消化階段的粒徑變化趨勢(shì)相近，口腔消化過(guò)程中，粒子的粒徑無(wú)明顯變化，而在腸消化階段發(fā)生明顯聚集，粒徑顯著增大，在腸消化末期，粒徑也略有增大。這可能是由于在胃部環(huán)境下，油體界面上部分蛋白質(zhì)發(fā)生水解[16]，降低和破壞了油體的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致粒子發(fā)生聚集現(xiàn)象。過(guò)酸的胃部環(huán)境也會(huì)使得姜黃素析出，形成結(jié)晶，顆粒增大。使用共聚焦掃描激光顯微鏡對(duì)粒子各消化階段的微觀(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果如圖4所示，在胃消化階段，粒子的粒徑明顯增大，這一結(jié)果也印證了粒徑測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，在腸消化階段，粒子進(jìn)一步聚集，大部分物質(zhì)被消化。

圖3 不同載體中姜黃素的穩(wěn)定性和生物可接受率

圖4 消化過(guò)程中負(fù)載姜黃素的粒子的粒徑變化

圖5 消化過(guò)程中粒子的微觀(guān)圖像

3 結(jié)論

本文制備了花生粗油體、精油體、全脂乳和脫脂乳，測(cè)定花生油體及其副產(chǎn)物的油水含量。采用pH驅(qū)動(dòng)的方法，對(duì)姜黃素進(jìn)行溶解包埋，測(cè)定其粒徑與電位，并通過(guò)體外消化模型對(duì)其在體外消化過(guò)程中消化特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，堿性PBS的洗滌能夠有效去除油體中受污染的蛋白。負(fù)載姜黃素的全脂乳中游離脂肪酸的消化速率最高，2 h后達(dá)到91.22%，油體的純化對(duì)油體的游離脂肪酸消化速率無(wú)明顯影響。負(fù)載姜黃素的油體及其副產(chǎn)物在胃消化過(guò)程中有明顯聚集。純化后的油體表現(xiàn)出更高的生物可接受率。研究的結(jié)果有助于更有效的姜黃素營(yíng)養(yǎng)保健品的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。