楊 波 賴燕舞 周 強 杜 鍇 羅秋琪 周 莉 魏 明 張 樂 譚成彬 任志均 徐亞琳 林冰森 羅 波*

(1.中國大熊貓保護研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，邛崍山、岷山瀕危野生動植物保護生物學(xué)國家長期科研基地，都江堰，611830；2.丹巴縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局，丹巴，626300；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)土木工程學(xué)院，都江堰，611830)

動物糞便是非損傷性取樣法中易獲得、易保存的樣本，被應(yīng)用于瀕危野生動物的種群動態(tài)監(jiān)測、遺傳結(jié)構(gòu)、寄生蟲、微生物與繁殖生理等研究[1-2]，大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)糞便被廣泛應(yīng)用于種群生態(tài)與遺傳、食性與消化、類固醇激素、寄生蟲和微生物等多方面的研究[3]。糞便類固醇激素是一種較好衡量動物繁殖狀態(tài)和應(yīng)激反應(yīng)程度的指標(biāo)[4-5]。腎上腺糖皮質(zhì)激素常用來衡量動物所受的脅迫程度，用于指示應(yīng)激源對動物產(chǎn)生的干擾應(yīng)激效應(yīng)[6-7]，而皮質(zhì)醇作為一種糖皮質(zhì)激素的主要生理活性成分，它參與機體多項生理功能的調(diào)節(jié)和影響行為的表達[8]。目前，常用糞便皮質(zhì)醇激素(可的松cortisol)水平來評估某些環(huán)境因子如高溫[6-7，9]、噪音[10-12]、光照[13]或特殊事件如麻醉[6]、運輸[14-15]等對大熊貓產(chǎn)生的短期應(yīng)激反應(yīng)，也可以用于大熊貓應(yīng)激生理的長期監(jiān)測與環(huán)境壓力分析[16-17]。

大熊貓主食竹類，糞便尺寸較大，為采集、保存及處理帶來諸多不便，同時也為類固醇激素測定造成一定的影響。于小杰等[18]早已證實大熊貓糞便表層中類固醇激素含量明顯高于糞便內(nèi)部，糞便激素的分布存在內(nèi)外差異；還有研究也證實了大熊貓糞便的取樣量、保存方式、激素提取方式及檢測方法等因素會影響類固醇激素的測定結(jié)果[5，8，19-20]。由于野生個體難以尋覓，很難采集到新鮮糞便或者采集量受到限制，同時考慮到糞便的多用途性，節(jié)約使用糞便很有必要，于小亞等[18]發(fā)現(xiàn)大熊貓糞便激素的內(nèi)外差異，提出部分取樣(1/2取樣或1/4取樣)的建議。本研究進一步對1/2取樣或1/4取樣的可行性進行驗證，還對糞便重量估測及取樣量做了研究，以期為大熊貓糞便類固醇激素研究的取樣對策提供參考。

1 研究材料

試驗對象為中國大熊貓保護研究中心都江堰基地7只大熊貓(成年雌∶成年雄∶亞成體=2∶2∶3)。每日以新鮮竹子、竹筍為食，并以胡蘿卜、蘋果和人工精飼料(主要由黃豆粉、玉米粉、雞蛋和菜油等混合后蒸制所成)為輔食，采食良好，身體健康。于2021年10月某一周，在圈舍打掃前收集舍內(nèi)所有完整糞便，糞便新鮮程度在24 h以內(nèi)，共采集糞便103份，包括竹節(jié)便62份、竹葉便29份和混合便12份(竹葉與竹節(jié)混合，各占比情況未計算)。

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

利用一次性PE手套采集糞便，采集后首先測量外部尺寸(圖1)、稱量濕重，測量完畢后裝入自封袋，-20 ℃凍存。糞樣采用凍干技術(shù)(真空冷凍干燥機為北京亞星儀科LGJ-100FG)干燥，按照唐丹等[15]操作方法篩取和保存。

圖1 大熊貓糞便尺寸測量與分割Fig.1 The schematic diagram of fecal size measurement and segmentation

2.2 激素提取與測定

糞便皮質(zhì)醇激素提取與測定參考唐丹等[15]的方法，分析樣品量每次約為0.1 g。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

3 結(jié)果與分析

3.1 糞便皮質(zhì)醇分布

將18份糞便(竹節(jié)便∶竹葉便∶混合便=5∶9∶4)分割成A、B、C、D 4個等分(圖1)，并測定72份小型糞便皮質(zhì)醇含量，結(jié)果(圖2)表明：A、B、C、D部分皮質(zhì)醇分別為(97.7±39.6)、(95.9±37.8)、(98.2±28.4)、(99.7±38.8) ng/g。ANOVA方差分析得出這4個區(qū)組整體無顯著差異性(df=3，F(xiàn)=0.033，P=0.992)，多重比較也表明4個區(qū)組間均無顯著差異(P=0.756～0.970)。隨后，將A+B視為一個整體，C+D為另一個整體，二者的皮質(zhì)醇分別為(96.8±37.1)、(98.9±31.6) ng/g，兩區(qū)組間不存在顯著差異(P=0.855)；同樣的，A+D[(98.7±37.6)ng/g]與B+C[(97.0±32.3)ng/g]也不存在顯著差異(P=0.886)。

圖2 糞便取樣方式與皮質(zhì)醇含量的關(guān)系Fig.2 Relationship between fecal sampling method and cortisol concentration

3.2 取樣方式對皮質(zhì)醇的影響

不同取樣方式如1/4取樣(A/B/C/D)和1/2取樣(橫向A+B/C+D、縱向A+D/B+C)分別對皮質(zhì)醇測定準(zhǔn)確性的影響(以Cv值作為指標(biāo))如圖3所示，1/4取樣A/B/C/D的Cv值[(13.7±7.1)%]要稍大于橫向1/2取樣A+B/C+D[(10.2±6.4)%]，兩者差異不顯著(Z=-1.550，P=0.121)，但1/4取樣A/B/C/D的Cv值要顯著大于縱向1/2取樣A+D/B+C[(8.7±9.2)%，Z=-2.769，P=0.006]。考慮到單一值對Cv值的整體影響，對數(shù)據(jù)優(yōu)化，將Cv>15%中的最大影響值剔除，共剔除4個數(shù)據(jù)(竹節(jié)便1個，竹葉便2個，混合便1個)。結(jié)果表明：優(yōu)化后的Cv值整體小于優(yōu)化前，優(yōu)化前后的差異均不顯著(-0.998≤Z≤-0.514，0.318≤P≤0.608)。此外，優(yōu)化后1/4取樣A/B/C/D的Cv值[(10.9±4.3)%]仍然大于橫向A+B/C+D[(8.1±4.4)%，Z=-1.596，P=0.111]，且顯著大于縱向1/2取樣A+D/B+C[(6.3±4.3)%，Z=-2.830，P=0.005]?？v向1/2取樣A+D/B+C的Cv值在優(yōu)化前和優(yōu)化后均是最小的。

圖3 不同取樣方式對糞便皮質(zhì)醇測定準(zhǔn)確性的影響Fig.3 Influence of different sampling methods on the measurement accuracy of fecal cortisol 注(Note)：**.P<0.01

3.3 糞便濕重與尺寸的關(guān)系

圖4顯示，3種糞便類型(竹節(jié)便、竹葉便與混合便)均不存在特殊分布，故對所有數(shù)據(jù)整合分析?；?03份糞便測量數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)糞便濕重與尺寸存在顯著正相關(guān)性(r=0.897，P<0.001)；回歸分析顯示，它們之間符合線性回歸關(guān)系(R2=0.804，F(xiàn)=418.846，P<0.001)，回歸直線方程為y=2.3x-29.3(y為糞便濕重，x為糞便尺寸大小即S值)。

3.4 糞便含水率與出粉率

不同類型糞便的含水率有差異，如表1所示，竹節(jié)便的含水率最低，為(67.4±3.8)%，顯著低于竹葉便與混合便(Z≤-2.626；P≤0.009)；竹節(jié)便的出粉率也是最高，為(2.4±0.9)%，顯著高于另外兩者(Z≤-3.977；P<0.001)。

表1 糞便含水率與出粉率情況

4 討論

大熊貓非損傷性取樣一直是熱點研究，野生大熊貓的糞便逐漸成為珍貴、重要的科研資源，糞便的有效、合理利用是未來大熊貓非損傷性取樣研究的重要方向。對于大型哺乳動物而言，糞便尺寸較大，為了取樣方便、節(jié)省樣品存放空間便于運輸與保存，往往采取部分取樣的方法[4，18]。本研究旨在分析大熊貓糞便皮質(zhì)醇激素的分布情況，進一步驗證部分取樣的準(zhǔn)確性與可行性，以及探討在不同條件下(糞便類型、尺寸、取樣量)的取樣對策。結(jié)果顯示，對糞便進行橫縱向分割后的每部分(1/4取樣)間的皮質(zhì)醇含量均不存在顯著差異(圖2)，表明糞便在該處理下的激素分布是比較均勻的，即每部分糞便激素水平均能在一定程度上代表整團糞便，但前提是所取糞樣的表層與內(nèi)部比例要能代表整團糞便[18]，否則會導(dǎo)致較大偏差，影響檢測準(zhǔn)確性。本研究還發(fā)現(xiàn)，糞便1/2取樣所產(chǎn)生的Cv值要明顯小于1/4取樣，并且縱向1/2取樣的Cv值小于橫向1/2取樣(圖3)，表明1/2取樣的準(zhǔn)確性比1/4取樣高，結(jié)果更具有代表性，縱向取樣比橫向取樣更有效。究其原因，可能是糞便不是完美的橢球體，取樣時較難保證糞便外層與內(nèi)部比例一致；大熊貓糞便中含有較多、較大的竹節(jié)或竹葉，況且竹節(jié)或竹葉也不是均勻分布，很難實現(xiàn)糞便的均勻分割。優(yōu)化前后Cv值的差異情況也可以說明，取樣分割的均勻性會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，取樣方式是影響大熊貓糞便皮質(zhì)醇激素測定的主要因素之一[18]，盡可能提高取樣的均勻性，所取樣品才更具代表性。

Hayward等[21]研究表明，糞便經(jīng)過干燥后，0.001～0.100 g樣品量可用于激素的提取與檢測，所以0.5 g大熊貓糞干粉量足以滿足相關(guān)試驗，此時大概需要25 g濕重的竹節(jié)便或50 g以上的竹葉/混合便(表1)，考慮到大熊貓糞便濕重在50～200 g(圖4)，因此1/2取樣或1/4取樣均可以滿足取樣條件，它們都是比較有效的取樣方式。在野外環(huán)境下，根據(jù)3.3中的回歸方程估測大熊貓糞便的濕重，進而采取相應(yīng)的取樣對策。若樣品比較稀少且可以保證均勻取樣的前提下，1/4取樣具有可行性；否則，建議采取縱向1/2取樣。由于本研究僅測定了糞便皮質(zhì)醇含量，對于其他類固醇激素如雌激素、孕激素和睪酮等未做相關(guān)分析，需要進一步驗證?？紤]到這些激素均屬于類固醇激素，激素代謝途徑相似，因此可以參考該取樣方式。本研究明確了大熊貓糞便皮質(zhì)醇激素分析的取樣對策，對野外采樣工作具有一定的指導(dǎo)意義，為大熊貓糞便類固醇激素研究提供一定的方法參考。

致謝：感謝中國大熊貓保護研究中心周世強高級工程師在數(shù)據(jù)處理及分析上的幫助，感謝魏榮平主任及吳凱、劉藝、胡蘭和楊欣等同事在樣品采集上的大力支持。