葉明彬 馬艷平 梁志凌 馬江耀 馮國清 陳華靈 王付民 麥瑞瓊 劉振興*

(1.廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，惠東，516359；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣州，510640)

綠海龜(Cheloniamydas)是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要維護(hù)者[1-3]，具有極高的科研、觀賞、生態(tài)和文化價(jià)值。2004年綠海龜被IUCN列為瀕危物種，2007年又被CITES列為附錄Ⅰ，世界自然基金會(huì)(WWF)把綠海龜列為瀕危物種，我國也將其列為一級保護(hù)動(dòng)物[4-6]。

綠海龜保護(hù)中除需要應(yīng)對全球變暖導(dǎo)致的種群性別失衡及海平面上升導(dǎo)致的產(chǎn)卵場破壞、海洋垃圾污染、漁業(yè)生產(chǎn)導(dǎo)致海洋生物棲息地急劇減少等全球性難題外[7-10]，綠海龜自身還面臨著病毒、細(xì)菌、寄生蟲等多種病原的威脅[11-18]，尤其是稚龜，因其自身免疫系統(tǒng)不完善，更容易受到病原微生物感染，其中細(xì)菌是最為嚴(yán)重的感染性病原。目前對綠海龜細(xì)菌性病原的分離、致病力與耐藥性研究較少，影響了綠海龜繁育與保護(hù)的進(jìn)一步發(fā)展。

本研究針對廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)患病綠海龜(稚龜)疑似病原菌分離鑒定與抗生素耐藥性分析，并對部分分離菌株進(jìn)行致病力評價(jià)，為綠海龜細(xì)菌病防控及其綠海龜保護(hù)和救護(hù)提供了臨床數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采樣綠海龜(稚龜，體重30～100 g)均來自廣東省惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)?；疾↓敹啾憩F(xiàn)為鼻腔、口腔潰瘍，頸部皮膚、鰭狀肢皮膚潰爛，皮膚結(jié)節(jié)，背甲潰爛，部分病龜眼部分泌物增多、流膿。

1.2 試驗(yàn)材料

血瓊脂平板、TCBS(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar)培養(yǎng)基、MH(Mueller-Hinton)培養(yǎng)基、LB(Luria-Bertani)肉湯培養(yǎng)基及細(xì)菌生化鑒定管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司；ExTaqMix和pMD18-T載體購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自北京擎科生物科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離純化

2019—2021年，對100余只患病龜潰瘍鼻腔、潰瘍或潰爛口腔、潰瘍或紅腫泄殖腔、潰爛表皮、皮膚結(jié)節(jié)等病灶進(jìn)行細(xì)菌分離純化。用無菌剪刀剪開鼻黏膜、口腔黏膜、泄殖腔黏膜、眼黏膜潰瘍表皮，無菌拭子蘸取病變部位膿液，分別在血平板和TCBS平板上劃線；對于潰爛表皮、皮膚結(jié)節(jié)等處，先用75%乙醇擦拭表面，再用無菌解剖剪在病灶上剪開缺口，將無菌接種環(huán)深入其中，劃線于血平板與TCBS平板上。病龜取樣后創(chuàng)面用75%乙醇消毒隔離飼養(yǎng)。所有平板均于培養(yǎng)箱中30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并將優(yōu)勢單菌落接種至LB培養(yǎng)基，30 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 細(xì)菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增

取5 mL擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液，按照天隆細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA作為PCR擴(kuò)增模板。細(xì)菌通用16S rRNA基因引物(16S-27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；16S-1541R：5′-AAGGAGGTGA-TCCAGCCGCA-3′)[19]送北京擎科生物科技有限公司合成，作為PCR擴(kuò)增引物。PCR擴(kuò)增體系：2×TaqMix 25 μL，16S-27F引物(10 μmol/L)1 μL，16S-1541R引物(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。隨后，PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)分析擴(kuò)增片段是否符合預(yù)期。

1.4.2 16S rRNA T克隆載體的構(gòu)建與測序

確定擴(kuò)增片段符合預(yù)期后，切膠純化回收目的片段，取4 μL目的片段，加入1 μL pMD18-T載體，5 μL Solution Ⅰ，混合均勻，16 ℃作用2 h，取8 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp+LB固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，隨后挑取單克隆，利用16S rRNA引物進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測序，BLAST比對。同源性≥99.0%，可以定義到種；同源性97.0%～98.9%，可以定義到屬水平。

1.4.3 弧菌細(xì)菌生化鑒定

挑取16S rRNA鑒定成功的弧菌單菌落至無菌生理鹽水中，制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管濃度(約1.5×108cfu/mL)，按照使用說明書接種到細(xì)菌生化鑒定管中，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]及廣東環(huán)凱微生物科技有限公司弧菌生化鑒定盒判定標(biāo)準(zhǔn)，對分離菌株生化鑒定。

1.5 分離菌株毒力分析

試驗(yàn)用中華草龜(Chinemysreevesii)，體重(90±10)g，購自廣州市某草龜養(yǎng)殖場。隨機(jī)采集5只試驗(yàn)龜，用無菌拭子分別刮取鼻腔、口腔和泄殖腔黏膜，劃線于血平板和TCBS平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，鑒定全部分離菌株，確保試驗(yàn)龜不攜帶溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。隨機(jī)分為36組，每組10只，在40 cm×40 cm×30 cm玻璃缸暫養(yǎng)2周，每天飼喂2次，換水1次。取擴(kuò)大培養(yǎng)的7株溶藻弧菌，接種TCBS液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，10倍梯度稀釋5個(gè)梯度，取100 μL涂布TCBS固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。7株菌液均調(diào)整至109、108、107、106、105cfu/mL，各濃度以0.5 mL劑量后腳窩部位腹腔注射攻毒，每天觀察攻毒龜發(fā)病癥狀，記錄死亡率。

1.6 藥敏試驗(yàn)

參照紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，檢測分離菌株對氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素、新霉素和復(fù)方新諾明的耐藥性。步驟：取200 μL 0.5麥?zhǔn)蠞岫?約1.5×108cfu/mL)劑量的菌懸液均勻涂布于含0.1% NaCl的MH瓊脂平板，每個(gè)平板均勻粘貼6個(gè)藥敏紙片，于30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h，測量并記錄抑菌圈直徑，依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司W(wǎng)S/T 125—1999紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判斷分離菌株的藥物敏感性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分離菌株LD50測定采用SPSS概率單位加權(quán)回歸法檢驗(yàn)。2019—2020年分離菌株耐藥率與2021年分離菌株差異分析采用SPSS交叉表卡方檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2019—2021年，從100余只患病龜病變部位劃線接種，分別挑取血瓊脂平板具有溶血活性的優(yōu)勢單菌落、TCBS平板上優(yōu)勢單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果顯示均為革蘭氏陰性菌。挑取優(yōu)勢單菌落接種至液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)，共分離得到疑似病原菌45株。以疑似病原菌提取DNA為模板，進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增，結(jié)果均擴(kuò)增得到1 515 bp的目的片段(圖1)。

圖1 分離菌株16S rRNA鑒定結(jié)果Fig.1 16S rRNA identification result of isolated strains 注：M.DL2000 DNA Marker；1～45.分離菌株；-.空白對照 Note：M，DL2000 DNA Marker.1-45，Isolated strain.-，Blank control

切膠回收目的片段，連接pMD18-T載體，經(jīng)PCR鑒定后，重組質(zhì)粒送測序公司測序。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫細(xì)菌16S rRNA基因序列同源性均在99.0%以上，可以確定為同一種。因此根據(jù)16S rRNA鑒定結(jié)果，從綠海龜體表潰瘍表皮、皮膚結(jié)節(jié)、口腔拭子、泄殖腔拭子、鼻拭子和眼拭子共分離鑒定了綠海龜疑似病原菌45株，涉及10個(gè)菌屬，其中占比最高的是弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌，共19株，占42.22%，分別為溶藻弧菌7株，哈維氏弧菌(V.harveyi)4株，副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)1株，弗尼斯弧菌(V.furnissii)2株，溶珊瑚弧菌(V.coralliilyticus)1株，河流弧菌(V.fluvialis)1株，錫那羅州弧菌(V.sinaloensis)1株，塔式弧菌(V.tubiashii)1株，東方弧菌(V.orientalis)1株；乳球菌屬(Lactococcus)細(xì)菌7株，占15.56%，其中乳酸乳球菌(L.lactis)5株，格氏乳球菌(L.garvieae)2株；其他菌株占比少(表1)。

表1 綠海龜分離疑似病原菌匯總

續(xù)表1

2.2 分離弧菌生化鑒定結(jié)果

根據(jù)19株分離弧菌的16S rRNA鑒定結(jié)果選取生化鑒定管進(jìn)一步生化鑒定(表2)。按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及廣東環(huán)凱微生物科技有限公司弧菌科(Vibrionaceae)細(xì)菌生化鑒定盒判定標(biāo)準(zhǔn)，生化鑒定結(jié)果與16S rRNA鑒定結(jié)果一致。

2.3 分離菌株毒力分析

溶藻弧菌CMT90807、CMC21032031、CMC21032032、CMC21032131、CMC2103216、CMLU908162、CMC2103-2081株均以109、108、107、106、105cfu/mL、0.5 mL劑量腹腔注射中華草龜，每天記錄死亡率。除CMC21032031株處理在第4天出現(xiàn)死亡外，其他6株處理均在第2天就出現(xiàn)死亡，7株弧菌109cfu/mL劑量處理死亡率均達(dá)到100%(表3)，據(jù)SPSS軟件概率單位加權(quán)回歸法分析，CMT90807、CMC21032031、CMC21-032032、CMC21032131、CMC2103216、CMLU908162、CMC21032081株LD50分別為7.40×107、2.59×108、6.35×106、7.22×107、7.22×107、2.99×106、7.22×106cfu/mL。發(fā)病龜為鰭狀肢皮膚潰爛，背甲潰爛，剖解死亡龜，均肝臟充血壞死；腸道出血，腸腔充滿炎性膿液；脾臟腫脹壞死(圖2)。對病變組織制作石蠟切片，腸道表現(xiàn)為腸絨毛增粗，結(jié)構(gòu)紊亂，損傷脫落，基底層腫脹，炎性細(xì)胞浸潤；肝臟有廣泛團(tuán)狀出血灶，肝細(xì)胞腫大；脾臟有明顯的壞死灶，淋巴鞘結(jié)構(gòu)損壞(圖3)。在腸道、肝臟和脾臟均能重新分離并鑒定到溶藻弧菌優(yōu)勢菌落。

表3 分離菌株攻毒后中華草龜死亡率

圖2 攻毒后死亡中華草龜剖解結(jié)果Fig.2 Anatomical symptoms of dead Chinemys reevesii post infection

2.4 細(xì)菌耐藥性

2019—2021年，在患病的綠海龜病變組織、器官中分離并鑒定45株疑似病原菌，用K-B藥敏紙片法檢測了分離的疑似病原菌對氟苯尼考、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性。45株菌株對鹽酸多西環(huán)素和復(fù)方新諾明2種抗生素的耐藥性較高，耐藥率分別為55.56%和53.33%。對硫酸新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和環(huán)丙沙星耐藥性較低，耐藥率分別為37.78%、31.11%、28.89%和15.56%(圖4)，結(jié)果表明，分離菌株對水產(chǎn)養(yǎng)殖允許使用的抗生素產(chǎn)生了不同的耐藥性。

圖4 45株分離菌株耐藥性Fig.4 Antibiotic resistance of 45 isolated strains 注：R.耐藥；I.中度敏感；S.敏感；A.氟苯尼考；B.恩諾沙星；C.復(fù)方新諾明；D.鹽酸多西環(huán)素；E.硫酸新霉素；F.環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星指維生素C磷酸酯鎂鹽酸環(huán)丙沙星預(yù)混劑，其他抗生素均指水產(chǎn)用抗生素粉劑。下同 Note：R，Resistance.I，Intermediate.S，Sensitive.A，F(xiàn)lorfenicol.B.Enrofloxacin.C，Compound sulfamethoxazole.D，Doxycycline.E，Neomycin sulfate.F，Ciprofloxacin.Ciprofloxacin refers to magnesium ascorbic acid phosphate and ciprofloxacin hydrochloride premix, other antibiotics refer to aquatic antibiotic powders. The same as below

2.5 2019—2020年與2021年分離菌株耐藥率差異

通過對2019—2020年與2021年分離菌株耐藥率對比分析可見(表4)，2019—2020年，分離的21株菌對氟苯尼考、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為47.62%、38.10%、61.90%、57.14%、76.19%、23.81%。2021年，分離的24株菌，對氟苯尼考、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為16.67%、20.83%、45.83%、54.17%、4.17%、8.33%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，除鹽酸多西環(huán)素外，2021年分離菌株對氟苯尼考、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、硫酸新霉素、環(huán)丙沙星耐藥率較2020年有極顯著性降低(P<0.01)。

表4 2019—2020年與2021年分離菌株耐藥率

3 討論

生態(tài)意識、環(huán)保意識的逐漸增強(qiáng)推動(dòng)了中國(大陸)的綠海龜保護(hù)研究，廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)是目前亞洲大陸唯一的海龜保護(hù)區(qū)，中國的綠海龜保護(hù)成為全球綠海龜保護(hù)的重要組成部分。2017年廣東惠東海龜國家級自然保護(hù)區(qū)成功實(shí)現(xiàn)了綠海龜人工繁殖，為綠海龜?shù)谋Ｗo(hù)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，伴隨著稚龜?shù)姆N群密度不斷增加，細(xì)菌性病害成為人工種群稚龜發(fā)病死亡的首要因素[21-22]，但是長期以來，均未有南海海域綠海龜細(xì)菌性疾病流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)道，極不利于我國綠海龜?shù)谋Ｗo(hù)。

本研究對惠東縣海龜國家級自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行了為期3年的細(xì)菌性疾病流行病學(xué)調(diào)查，共分離到疑似病原菌45株，其中弧菌屬細(xì)菌19株，屬絕對優(yōu)勢，占42.22%?；【鷮偌?xì)菌多為重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌，可感染多種魚類、蝦類和貝類，均能導(dǎo)致海洋生物高死亡率[1，22-26]。本研究從綠海龜口腔拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子以及表皮潰瘍組織中均分離到溶藻弧菌優(yōu)勢菌落。墨西哥海域的綠海龜中分離了82株細(xì)菌，62株為弧菌屬細(xì)菌，其中39株為溶藻弧菌，17株為副溶血弧菌[22]。臺灣海域的綠海龜分離了47株革蘭氏陰性細(xì)菌，其中15株為弧菌屬細(xì)菌[1]，證明弧菌是綠海龜最為主要的流行致病菌株。

綠海龜?shù)牟≡芏酁榄h(huán)境常在條件致病菌[22]，目前研究報(bào)道的細(xì)菌均未進(jìn)行回歸試驗(yàn)，對其毒力評價(jià)確定其致病力在綠海龜病害防控中尤為迫切。為此，本研究對分離到的溶藻弧菌開展了中華草龜毒力試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，7株溶藻弧菌均能造成中華草龜死亡，LD50分別為7.40×107、2.59×108、6.35×106、7.22×107、7.22×107、2.99×106、7.22×106cfu/mL，并且在死亡病龜中均能重新分離到菌株，7株溶藻弧菌對中華草龜具有明顯的毒力。以中華草龜為攻毒模型，也可以為評價(jià)綠海龜細(xì)菌性病原的毒力以及防控研究提供數(shù)據(jù)支撐。

細(xì)菌的耐藥性分析對抗菌藥物選擇至關(guān)重要，是科學(xué)用藥的基礎(chǔ)。本研究對45株分離菌株進(jìn)行了抗生素敏感試驗(yàn)，分離菌株對6種水產(chǎn)養(yǎng)殖允許使用的抗生素具有不同程度的耐藥性?？股厥堑湫秃Ｑ笪廴疚镏?，耐藥菌更是容易在海洋動(dòng)植物中定植、生存和繁殖。綠海龜作為一種洄游性生物，攜帶細(xì)菌抗生素耐藥分析也成為評價(jià)海洋抗生素污染水平的指標(biāo)[4，26-31]。本研究顯示，我國惠東綠海龜自然保護(hù)區(qū)綠海龜(稚龜)攜帶疑似病原菌耐藥性普遍存在。值得注意的是，2021年分離菌株耐藥率相比2019—2020年有明顯地降低，這可能與本課題組從2019年開始根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)綠海龜病害防控過程中的抗生素使用有關(guān)，有效降低了綠海龜攜帶病原的耐藥率，進(jìn)一步保護(hù)了綠海龜保護(hù)區(qū)的生物安全與生態(tài)安全。

本研究對綠海龜(稚龜)病原菌分離鑒定以及抗生素耐藥性分析，將有效提升綠海龜?shù)娜斯し庇?，為海龜自然保護(hù)區(qū)提供生物安全保障，對體現(xiàn)中國在綠海龜保護(hù)領(lǐng)域的國際影響力、促進(jìn)海洋生態(tài)保護(hù)具有重要的意義。