張勝久 李艷秋 孔重人 馬 勇 劉友林 張東旭 田甲申*

(1.大連圣亞旅游控股股份有限公司，大連，116023；2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連，116023)

腸道是細(xì)菌和宿主細(xì)胞相互作用調(diào)節(jié)個(gè)體對(duì)食物消化吸收的生態(tài)系統(tǒng)[1]，動(dòng)物消化結(jié)構(gòu)是由宿主和腸道菌群組成的復(fù)雜多變而又相對(duì)穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[2]。腸道菌群作為動(dòng)物的“第二基因組”，在宿主的腸道生理學(xué)、免疫系統(tǒng)、對(duì)抗致病菌、消化食物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等方面功能突出[3]，動(dòng)物腸道中厚壁菌門(Firmicutes)的富集有助于宿主更有效地吸收食物中的能量，在身體脂肪合成中發(fā)揮重要作用[4-5]，因此，研究腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。盡管哺乳動(dòng)物腸道菌群的研究非常多，但對(duì)鳥類腸道菌群的研究主要集中在家禽[6]，針對(duì)企鵝共生微生物的群落水平研究還非常有限。企鵝大部分時(shí)間都在海上度過，只有在脫毛和繁殖時(shí)才登上陸地[7-8]，企鵝可以儲(chǔ)存大量未消化的食物，并積累大量的脂肪組織，以幫助它們?cè)诿撁头敝称陂g長(zhǎng)期存活[9]。Banks等[10]使用克隆文庫(kù)技術(shù)分析地理隔離和宿主分類學(xué)對(duì)阿德利企鵝(Pygoscelisadeliae)腸道菌群的影響，帽帶企鵝(P.antarctica)和巴布亞企鵝(P.papua)腸道菌群的年齡差異也已經(jīng)被探索[11-12]，Yew等[13]分析和比較了阿德利企鵝與帽帶企鵝胃內(nèi)細(xì)菌群落組成的差異。因此，對(duì)企鵝的腸道菌群開展進(jìn)一步研究，能夠更全面地了解企鵝腸道菌群與其生理功能的關(guān)系。

宿主的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)受到多種遺傳和環(huán)境因素影響[14-15]。生活環(huán)境與食物改變動(dòng)物腸道菌群的現(xiàn)象在多種極地動(dòng)物的研究中被發(fā)現(xiàn)：在不同地區(qū)生活的澳洲海獅(Neophocacinerea)腸道菌群受到生活環(huán)境細(xì)菌的影響[16]；野生和豢養(yǎng)海狗(Arctocephalinae)的腸道菌群由于攝食食物不同也存在明顯的差異[17]；斑海豹(Phocalargha)幼崽的人工救助措施會(huì)改變其腸道菌群組成[18]。針對(duì)陸地哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與宿主的系統(tǒng)發(fā)育位置之間具有明顯的聯(lián)系[19-20]，選擇優(yōu)先在腸道定植的微生物形成初始的腸道菌群，然后腸道菌群的多樣性和組成才受到多種遺傳和環(huán)境因素的影響[14-15，21]。目前只有一項(xiàng)研究比較了王企鵝(Aptenodytespatagonicus)、巴布亞企鵝、馬可羅尼企鵝(Eudypteschrysolophus)和小藍(lán)企鵝(Eudyptulaminor)腸道菌群的差異[22]，分析的是南極洲野外環(huán)境下的企鵝個(gè)體，結(jié)果可能受到食物和生存環(huán)境等不可控因素的影響。

館養(yǎng)企鵝生活在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境中，攝食的食物種類基本一致，是研究企鵝腸道菌群與系統(tǒng)發(fā)育位置關(guān)系的理想模型。本研究分別采集同一水族館內(nèi)豢養(yǎng)的王企鵝(n=4)、帽帶企鵝(n=7)和巴布亞企鵝(n=6)糞便樣本，利用基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)分析樣本中微生物群落的多樣性及其組成，根據(jù)腸道菌群組成信息預(yù)測(cè)生物學(xué)功能，以期獲得腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，闡明宿主系統(tǒng)發(fā)育對(duì)企鵝腸道菌群的影響，探索不同企鵝腸道菌群的功能差異，為企鵝的研究和保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 糞便樣本采集

試驗(yàn)企鵝均出生在大連圣亞海洋世界，在相同的環(huán)境下成長(zhǎng)。采集健康狀態(tài)企鵝糞便樣本，采集前3個(gè)月未投喂任何藥物。3種企鵝每日食物均為毛鱗魚(Osmerusmordax)和南極磷蝦(Euphausiasuperba)，投喂比例為7∶1。每天每只企鵝的攝食量約為其體重的8%。2021年6月，隨機(jī)采集不同性別的成年王企鵝(4只)、帽帶企鵝(7只)和巴布亞企鵝(6只)的糞排樣本，-80 ℃保存。

1.2 DNA提取和高通量測(cè)序

使用QIAamp PowerFecal DNA Kit (QIAGEN，USA)提取企鵝糞便樣本細(xì)菌基因組DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher，USA)測(cè)定DNA的濃度和純度，提取成功的DNA在-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

應(yīng)用341F、806R引物擴(kuò)增每個(gè)DNA樣品中的16S rRNA基因，在擴(kuò)增引物的末端分別添加接頭序列和標(biāo)簽序列[23]，所有的擴(kuò)增反應(yīng)均為25.00 μL體系，其中包括5.00 μL的5 × reaction buffer、5.00 μL的5 × GC buffer、2.00 μL的dNTP(2.5 mmol/L)、0.25 μL的Q5 DNA 聚合酶(NEB，USA)、各1.00 μL的正向和反向引物(10 μmol/L)和2.00 μL的模板DNA。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)。所有PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN，GER)切膠回收，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen，USA)測(cè)定回收PCR產(chǎn)物的濃度。等量混合所有樣品的PCR產(chǎn)物，使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit (Illumina，USA)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，最后使用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除含有模糊堿基、質(zhì)量得分低以及含有嵌合體的序列[24]，得到的高質(zhì)量序列應(yīng)用FLASH按照重疊區(qū)拼接成tags[25]，根據(jù)tags中的標(biāo)簽序列將其分配給對(duì)應(yīng)的樣品并去除標(biāo)簽和引物序列。使用QIIME2的DADA2插件對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量控制、拼接和擴(kuò)增子序列變體(amplicon sequence variants，ASVs)聚類[26]。應(yīng)用默認(rèn)的方法挑選每個(gè)ASV中的代表序列，使用SILVA v138數(shù)據(jù)庫(kù)[27]對(duì)每一個(gè)ASV進(jìn)行分類學(xué)注釋，根據(jù)每個(gè)ASV對(duì)應(yīng)的序列條數(shù)構(gòu)建ASV豐度表格，隨后去除序列條目為1的ASV。按照測(cè)序最小的樣本序列數(shù)目對(duì)ASV豐度表格標(biāo)準(zhǔn)化。使用PICRUSt2[28]預(yù)測(cè)企鵝腸道菌群基于KEGG的功能路徑豐度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用QIIME計(jì)算alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1、Shannon、Pielou和Faith’s PD指數(shù)[29]。應(yīng)用R語言的ggplot2包繪制箱線圖并使用Turkey’s HSD test展示不同企鵝腸道菌群alpha多樣性指數(shù)和功能路徑分類的差異。使用R語言的vegan包計(jì)算企鵝腸道菌群的Bray-Cutis距離，用主坐標(biāo)分析(principal co-ordinate analysis，PCoA)和非參數(shù)多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA)區(qū)分不同企鵝腸道菌群組成和功能結(jié)構(gòu)的差異。根據(jù)不同糞便樣本細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行UPGMA聚類分析，同時(shí)通過堆疊條形圖比較腸道菌群中主要細(xì)菌門的豐度差異，利用LEfSe分析識(shí)別不同企鵝糞便樣品中顯著差異的微生物[30]，使用三元相圖識(shí)別不同企鵝腸道菌群的差異代謝路徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種企鵝腸道菌群的多樣性差異

通過Illumina高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定3種17只企鵝糞便內(nèi)包含的細(xì)菌16S rRNA基因，經(jīng)過拼接和質(zhì)量控制后，共獲得1 002 687條有效序列(tags)，每個(gè)樣本中有效序列數(shù)目為87 670～140 660，形成8 404個(gè)ASVs。根據(jù)物種分類學(xué)注釋結(jié)果，每一個(gè)糞便樣本中，分別注釋到5～14個(gè)細(xì)菌門、7～26個(gè)細(xì)菌綱、12～57個(gè)細(xì)菌目、19～96個(gè)細(xì)菌科和23～206個(gè)細(xì)菌屬(表1)。

表1 企鵝腸道菌群測(cè)序數(shù)據(jù)分類學(xué)注釋結(jié)果

根據(jù)Turkey’s HSD test的結(jié)果，王企鵝、帽帶企鵝和巴布亞企鵝腸道菌群的Chao1和Faith’s PD指數(shù)無顯著差異(圖1A、D)，說明企鵝宿主的系統(tǒng)發(fā)育地位并不會(huì)顯著改變腸道菌群的豐富度和物種進(jìn)化程度。相比之下，不同種企鵝腸道菌群的Shannon和Pielou指數(shù)具有顯著差異(P<0.05)，在王企鵝腸道菌群中這2個(gè)指數(shù)最高，其次為帽帶企鵝，巴布亞企鵝最低(圖1B、C)，表明企鵝宿主的系統(tǒng)發(fā)育地位顯著影響腸道菌群的均勻程度，進(jìn)而改變腸道菌群的多樣性，說明不同種企鵝的腸道內(nèi)可能會(huì)特異性富集不同種微生物。

圖1 館養(yǎng)3種企鵝腸道菌群多樣性Fig.1 Differences in the diversity of gut microbiota in different captive penguins

2.2 不同種企鵝腸道菌群組成的結(jié)構(gòu)差異

應(yīng)用基于Bray-Curtis距離的PCoA區(qū)分不同種企鵝腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的差異(圖1E)，前2個(gè)主坐標(biāo)解釋了49.1%的腸道菌群變化，其中PCo1解釋了32.1%的腸道群落變化，PCo2解釋了17.0%的腸道菌群變化。3種企鵝腸道菌群在PCoA結(jié)果圖中分別聚類，其中巴布亞企鵝與王企鵝和帽帶企鵝腸道菌群的距離較遠(yuǎn)，分別位于PCo1軸的兩側(cè)，同時(shí)王企鵝和帽帶企鵝的腸道菌群同樣分別分布在PCo2軸的兩側(cè)。PERMANOVA的結(jié)果表明，不同種企鵝的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)具有顯著差異(P<0.05)。宿主系統(tǒng)發(fā)育可以解釋46.8%的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)變化。針對(duì)研究樣本的層次聚類分析表明，來自于王企鵝、帽帶企鵝和巴布亞企鵝的腸道菌群按其宿主系統(tǒng)發(fā)育分別聚為3類(圖2)。綜上，可以證明不同系統(tǒng)發(fā)育地位的企鵝腸道菌群具有顯著的差異。

圖2 館養(yǎng)3種企鵝腸道菌群層級(jí)聚類及主要門水平豐度Fig.2 Hierarchical clustering and relative abundances of dominant bacterial phyla in gut microbiota from the three different penguin species

2.3 不同種企鵝腸道細(xì)菌的豐度差異

圖2顯示，王企鵝、帽帶企鵝和巴布亞企鵝腸道菌群門水平的豐度，其中厚壁菌門、梭桿菌門(Fusobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)是企鵝糞便中的主要微生物。但這3個(gè)主要菌門在不同企鵝個(gè)體中豐度變化幅度較大，厚壁菌門的豐度為0.3%～98.6%，梭桿菌門的豐度為0.1%～99.5%，變形菌門的豐度為0.1%～66.9%，且豐度變化并沒有明顯的宿主系統(tǒng)發(fā)育地位規(guī)律，表明在門水平評(píng)估企鵝腸道菌群的組成豐度變化可能并不適合。

LEfSe分析結(jié)果(圖3)表明：放線菌門(Actinobacteria)的類谷氨酸桿菌屬(Paeniglutamicibacter)、變形菌門的嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)以及厚壁菌門的肉桿菌屬(Carnobacterium)、狹義的梭菌屬(Clostridiumsensu stricto 1)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、戈特沙爾克氏屬(Gottschalkia)和蒂西耶氏菌屬(Tissierella)在王企鵝腸道菌群中特異性富集；變形菌門的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)和梭桿菌門的鯨桿菌屬(Cetobacterium)在帽帶企鵝腸道菌群中特異性富集；變形菌門的薩特氏菌屬(Sutterella)和屬于厚壁菌門的毛螺菌科(Lachnospiraceae)在巴布亞企鵝腸道菌群中特異性富集。

圖3 LEfSe分析識(shí)別不同種企鵝腸道菌群豐度差異Fig.3 Biomarkers in gut microbiota among different penguin species identified by LEfSe analysis 注：A.差異物種系統(tǒng)發(fā)育樹；B.差異物種LDA得分 Note：A，Cladogram of biomarkers.B，LDA score of biomarkers

2.4 不同種企鵝腸道菌群功能結(jié)構(gòu)的差異

應(yīng)用PICRUSt2對(duì)企鵝腸道菌群進(jìn)行基于KEGG代謝路徑的功能預(yù)測(cè)，基于Bray-Curtis距離的PCoA結(jié)果與群落組成相一致，來自不同企鵝的腸道菌群功能結(jié)構(gòu)同樣分別聚類(圖4)，不同種企鵝腸道菌群功能結(jié)構(gòu)的前2個(gè)主坐標(biāo)共解釋了69.4%的變化，但不同種企鵝腸道菌群功能結(jié)構(gòu)的分布并不像其組成結(jié)構(gòu)一樣，整體變化幅度比組成結(jié)構(gòu)低。

圖4 館養(yǎng)3種企鵝腸道菌群功能結(jié)構(gòu)PCoA分析結(jié)果Fig.4 PCoA of gut microbiota functions among different penguin species

2.5 不同種企鵝腸道菌群功能豐度差異

在level 1水平分析了6大類KEGG代謝路徑的豐度在不同種企鵝腸道菌群中的差異(圖5)。細(xì)胞過程、遺傳信號(hào)過程和新陳代謝路徑的豐度在王企鵝、帽帶企鵝和巴布亞企鵝腸道菌群中無顯著差異；環(huán)境信號(hào)過程的相對(duì)豐度在巴布亞企鵝腸道菌群中顯著高于王企鵝和帽帶企鵝(Turkey’s HSD test，P<0.05)；疾病相關(guān)通路的相對(duì)豐度在巴布亞企鵝腸道菌群中顯著低于王企鵝；有機(jī)體系統(tǒng)相關(guān)通路的相對(duì)豐度在巴布亞企鵝腸道菌群中顯著低于王企鵝和帽帶企鵝。進(jìn)一步對(duì)level 3水平KEGG路徑的豐度進(jìn)行比較(圖6)，在王企鵝腸道菌群中屬于遺傳信號(hào)通路的蛋白酶體和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子路徑，以及屬于環(huán)境信號(hào)通路的cAMP信號(hào)路徑的豐度顯著升高。疾病相關(guān)的百日咳路徑和有機(jī)體系統(tǒng)相關(guān)的碳水化合物降解與代謝路徑在帽帶企鵝腸道菌群中顯著富集，屬于新陳代謝的N-聚糖生物合成、鞘糖脂生物合成和鞘脂類代謝路徑在巴布亞企鵝腸道菌群中豐度明顯升高。

圖5 館養(yǎng)3種企鵝腸道菌群KEGG level 1功能路徑相對(duì)豐度Fig.5 Differences in the relative abundances of KEGG level 1 pathways in gut microbiota of different penguin species 注：箱線圖上方不同的小寫字母代表不同組間具有顯著差異(Turkey’s HSD test，P<0.05) Note：Different lowercase letters above each box in the same subfigure represent significant differences among groups (Turkey’s HSD test，P<0.05)

圖6 館養(yǎng)3種企鵝腸道菌群KEGG代謝路徑豐度的三元相圖Fig.6 Ternary diagram analysis of the difference in the abundance of KEGG metabolic pathways in the gut microbiota of king，chinstrap，and gentoo penguins

3 討論

本研究對(duì)館養(yǎng)的王企鵝、帽帶企鵝和巴布亞企鵝腸道菌群進(jìn)行了測(cè)序和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種企鵝的腸道菌群組成和功能具有顯著差異。細(xì)菌在鳥類孵化過程中在腸道內(nèi)定植，之后腸道菌群的組成受到多種遺傳性和環(huán)境因素影響[14-15]。館養(yǎng)企鵝生活在相同的環(huán)境條件下，食物種類相同，推測(cè)企鵝腸道菌群差異可能是與其宿主系統(tǒng)發(fā)育位置相關(guān)的一種遺傳特性。

已有研究報(bào)道了部分企鵝的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，最早由Banks等[10]使用克隆文庫(kù)技術(shù)從多個(gè)阿德利企鵝樣本中獲得了52個(gè)相似度為99%的操作分類單位(operational taxonomic units，OTU)；Dewar等[22]使用焦磷酸測(cè)序比較4種企鵝的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)在巴布亞企鵝、馬可羅尼企鵝、王企鵝和小藍(lán)企鵝中，分別有2 195、1 362、1 331和561個(gè)相似度為97%的OTU。還有2項(xiàng)研究使用基于細(xì)菌16S rRNA基因的高通量測(cè)序方法，分析帽帶企鵝中腸道菌群的組成，其中Barbosa等[31]從53只野生帽帶企鵝的糞便樣本中檢索到3 621個(gè)相似度為97%的OUT，Lee等[32]將來自27個(gè)個(gè)體的16S rRNA序列分配給19 990個(gè)相似度為97%的OTU。本研究測(cè)定了3種17只企鵝的腸道菌群組成，并獲得了8 404個(gè)ASVs，該方法基于100%的相似性分配序列，因此可以提供更準(zhǔn)確的分類和豐度結(jié)果[28]。

飲食和環(huán)境是各種動(dòng)物腸道菌群的重要影響因素[33]，澳洲海獅腸道菌群的差異可能是由于不同居住地海水中環(huán)境細(xì)菌的差異所致[16]，鯨魚和陸生食肉動(dòng)物的腸道菌群表現(xiàn)出相似的氨基酸合成和蛋白質(zhì)分解代謝，鯨魚腸道中與發(fā)酵代謝相關(guān)的微生物與陸生食草動(dòng)物更相似[34]，然而，這種相關(guān)性在鳥類中還不清楚[35]。已發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和梭桿菌門是野生帽帶企鵝的主要腸道細(xì)菌門[31-32]，本研究的結(jié)果與其一致，但在本研究中，部分企鵝腸道菌群中發(fā)現(xiàn)了豐度較高的變形菌門，這種差異可能與野生和館養(yǎng)企鵝的飲食不同有關(guān)。在自然環(huán)境中，企鵝傾向于專門攝食南極磷蝦[36]，館養(yǎng)的企鵝則以魚為主要食物，盡管兩種食物的蛋白質(zhì)和脂肪含量相似，但降解這些食物的細(xì)菌可能存在顯著差異。在哺乳動(dòng)物腸道菌群成熟的過程中，微生物群落是通過糞便、陰道微生物及母乳接觸而從母親那里遺傳的[37]，但是，在鳥類中，新孵化的雛鳥可從多種來源獲得微生物，包括卵的表面、周圍的環(huán)境和食物等[38]。館養(yǎng)企鵝生活在微生物有限的人工環(huán)境中，這可能限制腸道菌群的獲得；此外，性別差異已經(jīng)在巴布亞企鵝中被證實(shí)是可能影響腸道菌群組成的宿主遺傳因素之一[11]。本研究重點(diǎn)關(guān)注不同企鵝系統(tǒng)發(fā)育對(duì)腸道菌群的影響，由于王企鵝個(gè)體數(shù)量十分稀少，無法得到能夠滿足宿主系統(tǒng)發(fā)育和性別雙因素研究的個(gè)體，故本研究使用隨機(jī)性別采樣的方式盡可能消除性別的影響。

在王企鵝腸道菌群中，有多種不同的細(xì)菌富集，這與其具有更高的腸道菌群多樣性結(jié)果一致；同時(shí)，王企鵝中多種信號(hào)傳遞通路基因豐度的上升，可能是為了更好地在復(fù)雜的微生物群落中傳遞信號(hào)以調(diào)控菌群功能。在帽帶企鵝腸道菌群中富集了巴斯德氏屬和鯨桿菌屬，主要生態(tài)功能分別為潛在的致病微生物[39]和利用碳水化合物合成維生素B12[40]，這與其具有更高的疾病和碳水化合物相關(guān)代謝路徑的豐度相一致。巴布亞企鵝腸道菌群中具有更高豐度的毛螺菌科，主要負(fù)責(zé)將碳水化合物轉(zhuǎn)化為丁酸鹽，用于微生物和宿主上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[41]。鞘磷脂代謝相關(guān)的功能路徑在巴布亞企鵝腸道菌群中的豐度明顯高于王企鵝和帽帶企鵝。鞘磷脂是腸道菌群分泌的一類重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要功能是調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應(yīng)狀態(tài)[42]。以上信息表明，巴布亞企鵝腸道菌群相比于王企鵝和帽帶企鵝，與宿主免疫能力的關(guān)系更為密切。

綜上所述，厚壁菌門、梭桿菌門和變形菌門是企鵝腸道菌群的主要細(xì)菌門。本研究的結(jié)果表明，不同種企鵝腸道菌群具有不同的特性，不同種企鵝固有的系統(tǒng)發(fā)育差異顯著影響其腸道內(nèi)定植和形成的腸道菌群的組成和功能。