蘇 倡 高瑞芳 陳進(jìn)會 劉建麗 劉 葒 徐艷春，4，5*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.深圳海關(guān)動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，深圳，518045；3.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，東莞，523070；4.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；5.國家林業(yè)和草原局野生動物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040)

大象是非洲生態(tài)系統(tǒng)中的重要物種，象牙的非法貿(mào)易導(dǎo)致了非洲象種群數(shù)量的急速下降[1-3]，并引發(fā)一系列生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和安全問題[4]。為了保護(hù)非洲象，早在1989年，《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)就把大象及其制品的國際貿(mào)易進(jìn)行嚴(yán)格控制。2015年7月30日，聯(lián)合國大會通過了關(guān)于“打擊野生動植物非法交易”的歷史性決議。

識別非法象牙來源地，確定走私熱點(diǎn)地區(qū)，描繪走私通道是打擊象牙非法交易的重要前提[5]，這些工作都有賴于象牙的地理溯源，即通過對象牙的分析判斷其來源于哪個國家或地區(qū)。海關(guān)是查獲象牙非法貿(mào)易的主要部門，如果能夠?qū)Σ楂@象牙進(jìn)行地理溯源，則可以把走私行為與非洲來源地聯(lián)系起來，描繪國際走私通道。目前，國際上通用的象牙溯源方法有分子生物學(xué)方法和穩(wěn)定同位素分析方法。分子生物學(xué)方法是以各個地理種群的核DNA基因型[4-8]或線粒體DNA(mtDNA)單倍型[9-10]頻率為依據(jù)，通過象牙樣本的基因型計算屬于各個地理種群的概率。穩(wěn)定同位素分析方法是對象牙中的碳、氫、氧、氮、鍶和硫等同位素含量分析，再與來源地的背景數(shù)據(jù)比較，確定象牙的地理來源[11-15]。mtDNA是母系遺傳的，雄性非洲象成年后會離開它們出生的群體進(jìn)行擴(kuò)散，而雌性則始終留在出生時的群體中[16-18]，因此，每個地區(qū)的群體都會有其特征性的mtDNA多樣性，成為地理來源的信息[9，19-20]。由于在每個細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于核DNA，所以針對較低DNA豐度或較差質(zhì)量的象牙樣本時，通過mtDNA進(jìn)行溯源更具優(yōu)勢。LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫(www.loxodontalocalizer. org)[10]是一個開放獲取的非洲象mtDNA地理溯源數(shù)據(jù)庫，其基于線粒體控制區(qū)第一高變區(qū)(HVR1)的 316 bp序列，可以區(qū)分最近分化的譜系[21-23]。該數(shù)據(jù)庫的參考數(shù)據(jù)包括125個單倍型，涵蓋24個國家。這些單倍型中有62%是國家特有的[9]，可用于推斷象牙的地理來源。LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫的方法和可開放獲取的政策，目前已被大量應(yīng)用于非洲象牙地理來源追溯的工作中[24-26]。

本研究利用mtNDA溯源方法，分析象牙樣本HVR1的序列，利用LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫推斷可能的地理來源，建立國境口岸截獲象牙的地理信息數(shù)據(jù)庫，分析輸入中國的象牙遺傳特征，進(jìn)而推斷大象棲息地、獵捕地和走私通道等信息，為打擊國際象牙走私鏈條提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及其預(yù)處理

試驗所用象牙樣本和象牙DNA均由國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心和南京森林警察學(xué)院提供，合計126份。將象牙塊先在0.3%次氯酸鈉溶液中浸泡殺菌120 s，用無菌脫脂棉擦拭象牙塊，以去除象牙塊的表面污垢、殘留的組織和其他可能由于切割、裝樣等導(dǎo)致的來自其他樣品的粉末或人源DNA污染[27]。隨后用無菌水浸泡沖洗2次，無水乙醇浸泡沖洗1次，放置于超凈工作臺上使乙醇和水分完全揮發(fā)。使用SPEX 6770液氮研磨儀(SPEX SamplePrep，美國)將象牙塊研磨成粉，采用2 min預(yù)冷3 min研磨的方案，研磨后的象牙粉末置于10 mL頂空瓶中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 象牙樣品的脫鈣

將200 mg象牙粉末置入2 mL離心管中，向其中加入1.5 mL EDTA溶液(0.5 mol/L，pH 8.0)，對于質(zhì)量較好的象牙樣本使用改進(jìn)的2 h快速脫鈣法[27-28]：在56 ℃下孵育1 h，轉(zhuǎn)移到37 ℃下繼續(xù)孵育1 h，每小時更換1次EDTA溶液，12 000 r/min離心3 min，棄上清1 000 μL，再補(bǔ)加1 000 μL EDTA溶液，最后一個孵育步驟后同樣方法離心，去除上清液1 000 μL，底部剩余液體及沉淀用于后續(xù)DNA提取。對于質(zhì)量較差的樣本，使用3～10 d的慢速脫鈣法[27]：象牙在4 ℃條件下震蕩孵育過夜，每天更換1次EDTA溶液，最后1次離心后，采用同樣方法保留底部剩余液體及沉淀用于后續(xù)DNA提取。

1.3 象牙總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

向原2 mL離心管中，加入320 μL TNE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，80 μL SDS溶液(10%)，50 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，漩渦震蕩混勻，56 ℃水浴中消化6 h以上直至象牙沉淀完全溶解，最后用動物基因組磁珠提取試劑盒(中科雷鳴，北京)提取象牙總DNA。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用Brandt等[29]的引物CR-F1(5′-TGGTCTTGTAAGCCATAAATGAAA-3′)，CR-R1(5′-GCTTTAATGTGCTATGTAAGACTATG-3′)；CR-F2(5′-TCGTGCATCACATTATTTACCC-3′)，CR-R2(5′-TGGT-CCTGAAGAAAGAACCAG-3′)。根據(jù)LoxodontaLocalizer說明書中的建議[10]，DNA質(zhì)量較好的樣本，用CR-F1/CR-R2引物對擴(kuò)增522 bp的mtDNA控制區(qū)片段；而DNA質(zhì)量較差的樣本則使用2個單獨(dú)的擴(kuò)增反應(yīng)，CR-F1/CR-R1引物對擴(kuò)增318 bp的mtDNA控制區(qū)片段，CR-F2/CR-R2引物對擴(kuò)增306 bp的mtDNA控制區(qū)片段，二者存在102 bp的重疊片段。

PCR反應(yīng)以10.0 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行，包含正反向引物各0.4 μL(10 μmol/L)，2×RapidTaqMaster Mix(諾唯贊，南京) 5.0 μL，ddH2O 2.2 μL，DNA 2.0 μL，混勻后瞬時離心。擴(kuò)增采用PE-9700型DNA擴(kuò)增儀(GeneAmp，美國)，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離(100 V 穩(wěn)壓，20 min)，將目的條帶明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物回收，采用原引物進(jìn)行雙向Sanger測序(委托吉林省庫美生物科技有限公司完成)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果使用DNASTAR軟件包中的SeqMan軟件校對測序峰圖，并將正反向測序結(jié)果拼接，得到最終序列。使用MEGA 5.2軟件將控制區(qū)序列剪切為316 bp的片段，利用DnaSP 6.0軟件分析確定單倍型，計算單倍型數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異。

從GenBank下載653條具有非洲地理位置信息的4 258 bp非洲象線粒體DNA序列 (JQ438119～JQ438771)，包含13個非洲國家的22個地點(diǎn)；下載1條猛犸象線粒體基因組(KX027533)作為外群，在MEGA 5.2軟件中將上述序列剪切為與試驗樣本測序序列相同的大小，與樣本序列分別使用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行分析。在MEGA 5.2軟件中構(gòu)建NJ樹，自舉檢驗1 000次。使用PhyloSuite[30]軟件中的MAFFT進(jìn)行所有序列之間的比對，使用ModelFinder中的AIC(akaike information criterion)選擇最佳的替代模型，HKY+I+G模型被評估為最優(yōu)模型，使用IQ-TREE構(gòu)建最大似然樹，自舉檢驗由5 000次重復(fù)檢驗獲得。采用同樣方法將LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫中下載的所有125個單倍型與修剪為316 bp片段的樣本序列構(gòu)建ML樹和NJ樹。使用iTOL軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的編輯和美化。

1.5 Loxodonta Localizer 數(shù)據(jù)庫溯源分析

把前述分析中確定的各個單倍型，導(dǎo)入LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫中，與各個地理區(qū)域的參考序列進(jìn)行查詢比對。在數(shù)據(jù)庫中參看樣本序列的匹配情況，獲得其地理來源的相關(guān)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用鄰接法和最大似然法對象牙樣本和不同地理區(qū)域非洲象間親緣關(guān)系進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析樹(圖1)。126條象牙樣本的序列分屬2個大的支系和7個mtDNA進(jìn)化枝。F支系(F-clade)為所有非洲森林象(Loxodontacyclotis)和部分非洲草原象(L.africana)所有，共有31條序列，分屬中西部進(jìn)化枝(n=15)、中北部進(jìn)化枝(n=7)、中東部進(jìn)化枝(n=2)和中南部進(jìn)化枝(n=7)；S支系(S-clade)來自大部分草原象，共有95條序列，分屬北部大草原進(jìn)化枝(n=1)、大草原進(jìn)化枝(n=27)和東南大草原進(jìn)化枝(n=67)。由于缺乏更多的多態(tài)性位點(diǎn)，分屬于中西部進(jìn)化枝、大草原進(jìn)化枝和東南大草原進(jìn)化枝中的大部分樣本序列并沒有完全地匹配到各個國家和地區(qū)之間。

圖1 基于GenBank數(shù)據(jù)庫中有地理信息的序列與樣本序列構(gòu)建的ML樹Fig.1 The maximum likelihood phylogenetic tree based on sequences with geographic information in the GenBank database and ivory sample sequences in this study 注：外群為猛犸象，NJ樹與其具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不另做展示；進(jìn)化樹中紅點(diǎn)表示后驗概率大于95%，自舉值大于75；不同的進(jìn)化枝以不同的外圈顏色表示；mtDNA的F和S支系以黑色字體標(biāo)注；不同的國家地區(qū)以不同的進(jìn)化枝和文字顏色展示；本研究的126份樣本的樹枝標(biāo)為磚紅色；為方便展示，地理信息完全相同的亞進(jìn)化枝折疊處理 Note：The outgroup is mammoth.The Neighbor-joining tree has a similar topology and is not shown separately.The red dots indicate that the posterior probability is greater than 95% and the bootstrap value is greater than 75.Different clades are represented by different colors of the outer ring.The F and S clades of mtDNA are marked in black font.Different countries or regions are displayed in different branche and text colors.The branches of the 126 samples in this study are brick-red.For the convenience of display，the subclades with the same geographical information were folded

2.2 單倍型分析

從126條象牙樣本mtDNA控制區(qū)HVR1的316 bp的序列中，共定義和匹配了22個地理單倍型(表1)。在這22個單倍型中，共包含變異位點(diǎn)34個，單倍型多樣性為(0.742±0.039)，核苷酸多樣性為0.022，平均核苷酸差異為7.056。同樣，使用鄰接法和最大似然法對126條序列和LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫中的125個單倍型合并分析，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。所構(gòu)建進(jìn)化樹的系統(tǒng)發(fā)育分析與之前的單倍型分析結(jié)果完全一致。

圖2 基于Loxodonta Localizer 數(shù)據(jù)庫中125個單倍型與樣本序列構(gòu)建的ML樹Fig.2 The maximum likelihood phylogenetic tree based on sample sequences and 125 haplotypes in the Loxodonta Localizer database 注：外群為猛犸象，NJ樹與其具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不另作展示；進(jìn)化樹中紅點(diǎn)表示后驗概率大于95%，自舉值大于75；不同的進(jìn)化枝以不同的文字顏色和外圈顏色表示；本研究的126份樣本的樹枝標(biāo)為磚紅色 Note：The outgroup is mammoth.The Neighbor-joining tree has a similar topology and is not shown separately.The red dots indicate that the posterior probability is greater than 95% and the bootstrap value is greater than 75.Different clades are represented by different text and outer circle colors.The branches of the 126 samples in this study are brick-red

2.3 溯源定位結(jié)果

經(jīng)LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫溯源分析，有21個單倍型共109份樣本可進(jìn)行有效的地理溯源，共涉及13個國家，包含42個國家公園或保護(hù)區(qū)(表2，圖3)。單倍型LL062分布極廣(圖4)，從北非的厄立特里亞，到東非中部的烏干達(dá)、肯尼亞和坦桑尼亞，再到中南部的納米比亞、博茨瓦納、贊比亞、津巴布韋和莫桑比克，直至南非的最南端，因此所提供的有效地理溯源信息不足，屬于這一單倍型的17份樣品均無法確定確切的地理來源。這一點(diǎn)在LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫的說明中也有提示。

續(xù)表2

圖3 匹配的地理單倍型在非洲的地理分布(地圖來源Loxodonta Localizer數(shù)據(jù)庫)Fig.3 The geographic distribution map of African elephant mtDNA geographical haplotypes matched by the samples of this study (map source：Loxodonta Localizer database) 注：不同顏色的圓點(diǎn)表示不同的地理單倍型，餅圖表示一個地區(qū)存在多個單倍型 Note：Different geographical haplotypes are displayed with dots of different colors，and when there are multiple haplotypes in a region，it is represented by a pie chart

圖4 地理單倍型LL062在非洲的地理分布(地圖來源Loxodonta Localizer 數(shù)據(jù)庫)Fig.4 Geographical distribution map of the geographic haplotype LL062 in Africa (map source：Loxodonta Localizer database)

圖3顯示，126份象牙樣本主要來源于3個熱點(diǎn)地區(qū)，第1個地區(qū)為中非剛果盆地的Tridom (Tri-National Dja-Odzala-Minkébé) 跨境生態(tài)保護(hù)區(qū)及其周邊地區(qū)，包括加蓬、剛果(布)、喀麥隆、中非共和國和剛果(金)等國，該地區(qū)也是非洲森林象的主要分布區(qū)[31]；第2個地區(qū)是東非的肯尼亞、坦桑尼亞和烏干達(dá)等國；第3個地區(qū)是非洲南部的Kavango-Zambezi (KAZA)跨境保護(hù)區(qū)，包括納米比亞、津巴布韋、博茨瓦納和莫桑比克。此外，也有少量樣品被溯源到其他國家和地區(qū)，如厄立特里亞和南非等。但樣品數(shù)量較少，未能反映來源地是否有集中連片的態(tài)勢。

3 討論

3.1 提高地理溯源的精度和準(zhǔn)確性

本研究首次對我國國境口岸截獲的部分象牙進(jìn)行地理溯源。因為象牙樣本的質(zhì)量變化較大，采用核基因微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量不夠高[4-5，32-33]，故此，最終采用mtDNA控制區(qū)的序列溯源。

雖然LoxodontaLocalizer數(shù)據(jù)庫的信息檢索中有62%的單倍型是特定國家或地區(qū)獨(dú)有的[9-10]，如本研究中的LL042和LL116等，但有很多單倍型在多個國家或地區(qū)廣泛分布，如LL062單倍型。分布越廣泛的單倍型溯源有效性越低，追溯的地理來源信息越不可靠。mtDNA單倍型的多樣性與所檢測的序列長度有關(guān)，越長的序列可能包含的多態(tài)性位點(diǎn)越多，定義的單倍型也越多。本研究中采用了316 bp的控制區(qū)序列溯源，125個單倍型在該區(qū)域內(nèi)有42個多態(tài)性位點(diǎn)。但是在LoxodontaLocalizer 數(shù)據(jù)庫中的653條4 258 bp的序列中有多達(dá)424個多態(tài)性位點(diǎn)[9]，如果把檢測的范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，采用多區(qū)域聯(lián)合溯源，可能會提高溯源的精準(zhǔn)度。

另一方面，還可以通過采用多種方法聯(lián)合溯源的策略來獲得更多的地理來源信息，提高溯源精準(zhǔn)度，mtDNA與核DNA標(biāo)記的進(jìn)化模式不同，可以從兩個側(cè)面提供譜系地理學(xué)的信息[34-36]；穩(wěn)定同位素提供了各地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)元素構(gòu)成的信息[11-15]。因此，如果3種方法聯(lián)合使用將會極大地提高地理溯源的精準(zhǔn)性[9，15]。

但在實踐中材料的消耗量也是一個重要的考量因素。象牙中的DNA都是孤獨(dú)片段化的，且含量較少。需要較多的材料才能獲得足夠用的DNA。如果mtDNA分析采用傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物Sanger測序，不得不把每個區(qū)段分別擴(kuò)增，而每個區(qū)段能支持的擴(kuò)增長度都在400 bp以下[37]，故此所考察的區(qū)域越長，擴(kuò)增的次數(shù)越多，DNA的耗費(fèi)量也隨之越大。微衛(wèi)星的分析雖然采用復(fù)合擴(kuò)增，但不同位點(diǎn)的擴(kuò)增程序差異較大，無法完全復(fù)合到一個反應(yīng)中，DNA的消耗量也很大[4-5，32-33]。今后如果采用二代測序技術(shù)，可以把不同區(qū)段的擴(kuò)增復(fù)合到一個體系中，從而節(jié)省大量的DNA。

3.2 國境口岸截獲象牙的地理來源

本研究成功獲得了109份國境口岸截獲象牙樣本的地理來源，推測了3個熱點(diǎn)地區(qū)：地區(qū)一是中非剛果盆地的Tridom生態(tài)保護(hù)區(qū)及其周邊地區(qū)；地區(qū)二主要是東非的肯尼亞、坦桑尼亞和烏干達(dá)等國；地區(qū)三是非洲南部的KAZA跨境保護(hù)區(qū)，這與Wasser等[5，33，38]的研究結(jié)果基本一致。Wasser等[5，33，38]對2006年以來緝獲的大宗非洲象牙溯源結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，該時期的非洲象牙主要來源于兩大熱點(diǎn)地區(qū)和一個新興熱點(diǎn)地區(qū)，其中坦桑尼亞東南部和毗鄰的莫桑比克北部及其周邊地區(qū)為一塊熱點(diǎn)地區(qū)；非洲森林象牙的偷盜獵主要來源于Tridom跨境生態(tài)保護(hù)區(qū)域[5，38]；KAZA跨境保護(hù)區(qū)是近幾年發(fā)現(xiàn)的又一塊新興的象牙盜獵熱點(diǎn)地區(qū)[33，39-40]。

根據(jù)Wasser等[33]的研究，非洲象牙盜獵的3個主要國際跨國犯罪組織分別在肯尼亞的蒙巴薩、烏干達(dá)的坎帕拉和多哥的洛美。本研究推測的熱點(diǎn)地區(qū)——Tridom跨境生態(tài)保護(hù)區(qū)，盜獵象牙主要是從多哥的洛美向外出口走私；地區(qū)二肯尼亞、坦桑尼亞和烏干達(dá)等國，偷盜獵象牙主要從肯尼亞的蒙巴薩或烏干達(dá)的恩德培向外出口走私；地區(qū)三KAZA跨境保護(hù)區(qū)是近年新出現(xiàn)的偷盜獵熱點(diǎn)地區(qū)，該地區(qū)象牙大多是在剛果民主共和國的金沙薩裝入集裝箱開始走私運(yùn)輸。同時，非洲跨國犯罪組織間存在廣泛地聯(lián)系，走私出境港口也隨著執(zhí)法打擊的深入不斷變化，如在東非走私的集裝箱運(yùn)輸港口近年從坦桑尼亞轉(zhuǎn)移到肯尼亞再轉(zhuǎn)移到烏干達(dá)，通過卡車或鐵路運(yùn)輸至蒙巴薩。而西非的走私網(wǎng)絡(luò)也從多哥突然轉(zhuǎn)移到尼日利亞，成為西非走私出口業(yè)務(wù)的主要樞紐[33]。

跨國犯罪組織利用世界貿(mào)易的快速增長及全球化發(fā)展，在每年全球運(yùn)輸?shù)?0億個集裝箱中隱藏其違禁品，他們將來自非洲各地偷盜獵的大量象牙合并且集裝箱化，出口國家通常不是偷獵大象所在國，而是其他的非洲國家[8，33]。因此，通過識別緝獲象牙的地區(qū)，結(jié)合跨國犯罪組織象牙走私的販運(yùn)網(wǎng)絡(luò)，可以增加走私象牙的緝獲率，有利于未來在走私象牙離開非洲之前阻止其貿(mào)易。

致謝：感謝南京森林警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供DNA樣本。