盧佳，蘇瑞，閆慧敏，晏一淇，苗琳，張晗

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津 301617）

咽炎（Pharyngitis）是一種由咽部各種微生物引起的上呼吸道炎癥性疾病，屬于耳鼻喉科的常見病和多發(fā)病[1]，病程可長可短，亦可反復(fù)發(fā)作[2-3]。咽炎的發(fā)病因素復(fù)雜，主要包括細(xì)菌或病毒感染，除此之外各種有害刺激如過度煙酒、辛辣食物、煙霧、粉塵及有害氣體亦為可導(dǎo)致和加劇咽炎的發(fā)生和發(fā)展[4]。咽炎的主要臨床癥狀表現(xiàn)為咽部干癢、紅腫、疼痛及異物哽阻不適、喉底或有顆粒狀突起和不易咯出分泌物等[5-6]。中醫(yī)將咽炎稱為“喉痹”，如《素問·陰陽別論》記載：“一陰一陽結(jié)，謂之喉痹?！盵7]對于咽炎的病因病機，中醫(yī)理論認(rèn)為多為外淫或者內(nèi)傷導(dǎo)致的臟腑功能失調(diào)，循經(jīng)上擾咽喉而引發(fā)[8-9]。

中成藥“清感秋飲”（QGQY）是天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室團(tuán)隊研發(fā)的“清感飲”（系列）制劑之一。2020年，“清感飲”系列通過了天津市藥監(jiān)局的審批，成為了特色中藥院內(nèi)制劑，主治咳嗽，咽痛，鼻塞、流涕，或急慢性咽喉炎，急慢性鼻炎等呼吸道疾病見上述癥狀者。QGQY由牛蒡子（Arctium lappa L.）、射干[Belamcanda chinensis（L.）DC.]、桔梗[Platycodon grandiflorus（Jacq.）A.DC.]、赤芍（Paeonia lactiflora Pall.）、紫蘇葉[Perilla frutescens（L.）Britt.]、金銀花（Lonicera japonica Thunb）、山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、北沙參（Adenophora stricta Miq.）和桑葉（Morus alba L.）共10味中藥組成，具有養(yǎng)陰潤燥、疏風(fēng)散熱、芳香化濕，清喉利咽等功效，可用于風(fēng)燥襲肺證。課題組的前期臨床研究證實，QGQY可以預(yù)防和治療咽炎等呼吸系統(tǒng)感染性疾病[10]，但其機制尚不清楚。

文章首先應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測QGQY治療咽炎可能的分子靶點和信號通路，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行細(xì)胞水平抗炎實驗驗證，為QGQY的臨床應(yīng)用提供實驗證據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與藥物 人單核細(xì)胞（THP-1）由瑞士蘇黎世大學(xué)Michael Hottiger教授饋贈。小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。人腎上皮細(xì)胞（293T）由南開大學(xué)藥學(xué)院白鋼教授實驗室提供。感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）購自天根生化科技有限公司。

QGQY 提取物（批號：KG20200219-3），由天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥創(chuàng)新中心提供。將牛蒡子3 g，射干 2 g，桔梗 2 g，赤芍 2 g，蘇葉 2 g，金銀花 3 g，山楂1枚，烏梅1枚，甘草 1 g，沙參 3 g，桑葉 2 g混合，加入10倍量蒸餾水，浸泡40 min，煮沸，過濾，重復(fù)以上步驟1次，合并2次濾液，60℃以下濃縮至糖度為15-17Brix，噴霧干燥即得。臨用前用超純水溶解。

1.2 主要儀器與試劑 臺式震蕩培養(yǎng)箱購自伊孚森（中國）生物技術(shù)有限公司；Nikon倒置顯微鏡購自北京恒三江儀器銷售有限公司；酶標(biāo)儀購自北京海天友誠科技有限公司；實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀購自美國Bio-Rad公司；Multilabel Plate Reader功能讀板儀購自美國Perkins Elmer公司。

脂多糖（LPS，貨號 L6529）購自美國 Sigma公司；胎牛血清（FBS，貨號 04-001-1A）、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號01-100-1ACS）、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（貨號 01-052-1ACS）、磷酸鹽緩沖液（PBS，貨號02-024-1A）購自以色列Biological Industries公司；CCK-8檢測試劑盒（貨號C6005）、LDH試劑盒（貨號CK12）購自日本Dojindo Lab公司；RNA提取試劑盒（貨號19211ES60）購自天津翌圣生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號AT341-02）購自北京全式金生物科技有限公司；定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒（貨號A6001）、螢火蟲熒光素酶報告基因載體 pGL4.32（貨號 E849A）、pGL4.75（貨號 E6931）購自美國Promega公司；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（貨號S0021M）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；地塞米松（貨號HY-14648）購自美國MedChemExpress公司；氨芐西林（貨號A6920）、LB液體培養(yǎng)基（貨號L1010）、LB 固體培養(yǎng)基（貨號 L1015）、甘油（貨號G8190）購自北京索萊寶公司；質(zhì)粒小提試劑盒（貨號DP103-02）購自天根生化科技有限公司。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

2.1.1 QGQY活性成分的篩選及作用靶點的獲得 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索QGQY方中牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、金銀花、甘草、北沙參、桑葉8味中藥的化合物，利用中醫(yī)藥證候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（SymMap，http：//www.symmap.org/）檢索紫蘇葉、山楂的化合物，并將獲取的全部化合物在TCMSP中檢索，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件獲得候選化合物。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取候選化合物的潛在靶點，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org/）將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點統(tǒng)一要求規(guī)范。

2.1.2 咽炎相關(guān)靶點篩選 在人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.GeneCards.org/）和與疾病相關(guān)的基因數(shù)據(jù)庫（DisGeNET，http：//www.disgenet.org/）中，以“Pharyngitis”作為關(guān)鍵詞，篩選咽炎相關(guān)的潛在靶點。其中Genecards數(shù)據(jù)庫以Relevance score的中位數(shù)的2倍為卡值，DisGeNET數(shù)據(jù)庫不作篩選，將兩個數(shù)據(jù)庫的靶點合并刪除重復(fù)值后獲得咽炎相關(guān)靶點。

2.1.3 中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過韋恩圖取交集，獲得藥物與疾病共同作用靶點，利用Cytoscape_v3.8.2軟件構(gòu)建“QGQY中藥化合物靶點-疾病咽炎靶點”網(wǎng)絡(luò)，使用其內(nèi)置工具Network Analyzer計算出度值（degree），篩選出主要活性化合物。

2.1.4 蛋白質(zhì)互作分析（PPI） 將共同作用靶點導(dǎo)入蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫（STRING，https：//string-db.org/），限定物種為“Homo sapiens（智人）”，設(shè)置最高置信度分?jǐn)?shù)score>0.7，隱藏?zé)o接觸節(jié)點，下載TSV結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.2軟件進(jìn)行可視化，制作PPI圖。

2.1.5 基因本體論分析（GO）和京都基因與基因組百科全書通路富集分析（KEGG） 將上述的共同靶點導(dǎo)入注釋可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（DAVID，https//david．ncifcrf．gov/），標(biāo)識符設(shè)置為“OFFICIAL GENE SYMBOL”，限定物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，保存結(jié)果。設(shè)定閾值P＜0．05，并按照涉及的靶點數(shù)目多少進(jìn)行排序，篩選排名靠前的生物過程或通路。

2.2 細(xì)胞實驗方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 THP-1細(xì)胞用含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，RAW264．7、293T 細(xì)胞用含 10%FBS 和 1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。THP-1細(xì)胞以1×106/mL密度接種于6孔板，24 h后分組處理。對照組（Ctrl組）：加入雙蒸水；模型組：加入 LPS（100 ng/mL）孵育 16 h；QGQY 組：QGQY（10 μg/mL）預(yù)孵育 4 h 再加入LPS（100 ng/mL）孵育16 h，進(jìn)行實時熒光定量PCR（RT-PCR）實驗。RAW 264．7 細(xì)胞以 2×105/mL密度接種于96孔板，24 h后分組處理。Ctrl組：無菌 PBS；模型組：加入 LPS（1 μg/mL）；QGQY 組：LPS（1 μg/mL）與 QGQY（1、10、100 μg/mL）共同孵育，24 h后檢測NO含量。293T細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于96孔板，轉(zhuǎn)染后分組處理。Ctrl組：無菌PBS；模型組：加入腫瘤壞死因子（TNF）-α（10 ng/mL）；地塞米松組（10 μmol/L）：TNF-α 與 Dex（0．01、0．1、1ng/mL）共同孵育；QGQY 組：TNF-α 與 QGQY（0．01、0．1、1ng/mL）共同孵育；6h 后檢測核因子 κB（NF-κB）啟動子活性。

2.2.2 細(xì)胞活力檢測 分別取對數(shù)期的THP-1、RAW264．7、293T 細(xì)胞接種于 96 孔板，24 h 后加入不同濃度的QGQY，24 h后進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液移至新的96孔板內(nèi)，按LDH檢測試劑盒（CK12，九州島，日本）說明書步驟，每孔100 μL，后每孔加入 100 μL Working Solution，避光室溫反應(yīng)30 min后于492 nm處檢測吸光度值。用PBS潤洗細(xì)胞，按照CCK8檢測試劑盒（C6005，九州島，日本）說明書步驟，加入 100 μL/孔的 1×CCK8 工作液，37℃孵育1 h于450 nm處測定吸光度值。

2.2.3 RT-PCR 按照RNA提取試劑盒（19211ES60，天津，中國）說明書，提取THP-1細(xì)胞RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AT341-02，北京，中國）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，使用SYBR-Green（A6001，威斯康辛州，美國）擴(kuò)增 cDNA，檢測 TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IKBα和IP-10 mRNA水平的表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。具體引物序列如下，TNF-α：（上游）5’-GCGGTGCTTGTTCCTCAG-3’，5’-GGCTACAGG CTTGTCACTC-3’；白介素（IL）-1β：（上游）5’-CCA GGGACAGGTATGGAGCA-3’，5’-TTCAACACGCAG GACAGGTACAG-3’；IL-6：（上游）5，-GGCACTGGC AGAAAACAACC-3’，5’-GCAAGTCTCCTCATTGAA TCC-3’；IκBα：（上游）5’-GCACCTCCACTCCATCCTG AAGG-3’，5’-CCATTACAGGGCTCCTGAGCATTG-3’；IP-10：（上游）5’-GGTGAGAAGAGATGTCTGAATC-3’，5’-GTAGGGAAGTGATGGGAGAG-3’；GAPDH：（上游）5’-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3’，5’-CTGG AAGATGGTGATGGGTT-3’。

2.2.4 NO水平檢測 收集RAW264．7細(xì)胞上清液，根據(jù)NO試劑盒（S0021M，上海，中國）說明書步驟操作，按50 μL/孔，在96孔板中加入對照品溶液及樣品，室溫下再每孔依次加入Griess Ⅰ和Griess Ⅱ試劑各50 μL，于酶標(biāo)儀540 nm處測定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算出樣品中NO的濃度。

2.2.5 雙熒光素酶活性檢測 取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～80%時，使用PEI試劑（23966-1，沃靈頓，美國）共轉(zhuǎn)染NF-κB熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4．32和海腎熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4．75，培養(yǎng)24 h后裂解細(xì)胞，用Dual-Luciferase檢測試劑盒（E191O，沃爾瑟姆，美國）在酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光，記錄螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的活性數(shù)值，計算比值，即為相對熒光素酶活性（Relative luciferase activity）。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8．0．1軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討QGQY預(yù)防咽炎的靶點和通路

3.1.1 QGQY活性化合物-靶點預(yù)測 通過在TCMSP及SymMap平臺檢索得到QGQY已報道的化學(xué)成分，根據(jù)設(shè)置的篩選調(diào)節(jié)，經(jīng)整合QGQY方共獲得化學(xué)成分191個，對應(yīng)的靶點共1 269個，最后去除重復(fù)結(jié)果共得到276個潛在靶點，見表1。

表1 QGQY化合物成分和靶點Tab.1 Ingredients and targets situation of QGQY

3.1.2 QGQY預(yù)防咽炎的潛在靶點 檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫，根據(jù)篩選條件得到咽炎靶點共544個（Uniprot轉(zhuǎn)換后），DisGeNET數(shù)據(jù)庫共得到29個靶點，合并兩個數(shù)據(jù)庫靶點刪除重復(fù)后共得到562個。通過韋恩圖將QGQY活性成分預(yù)測靶點與咽炎相關(guān)疾病靶點取交集，共得到59個相關(guān)靶點，見圖1。將得到的共同作用靶點一一對應(yīng)QGQY的活性化合物，得到145個，導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.2軟件，構(gòu)建“中藥-化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)包括214個節(jié)點（10味中藥、145個活性成分、59個靶點），539條相互關(guān)系。從圖中可知，一個活性成分不只是對應(yīng)一個作用靶點，一個作用靶點也可對應(yīng)一個或多個活性成分，網(wǎng)絡(luò)圖充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點的相互作用的特征，網(wǎng)絡(luò)分析顯示3、槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、豆甾醇、黃芩素、金合歡素等成分degree值較高，見表2，可以作為QGQY防治咽炎關(guān)鍵活性成分進(jìn)一步研究。

圖1 疾病靶點-藥物靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of disease target and drug target

圖2 QGQY中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Target network of main components of QGQY

表2 QGQY中degree排名前8的關(guān)鍵活性成分信息Tab.2 Basic information of the top 8 main active ingredients in QGQY

3.1.3 PPI互作分析 采用Cystoscope3.8.2軟件對59個重疊靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中節(jié)點代表靶點，靶點之間的關(guān)聯(lián)用邊表示[11]，該PPI網(wǎng)絡(luò)共包含59個節(jié)點、376條邊，節(jié)點大小代表degree值，每個節(jié)點的重要性與degree值呈正相關(guān)。對排名前10位靶點的degree值進(jìn)行排序，見圖4，其中，對這些靶點進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)大多與炎癥相關(guān)，包括預(yù)測信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-6、IL-1β、IL-10、趨化因子 10（CXCL 10）等，推測這些可能是QGQY預(yù)防咽炎的潛在靶點。

圖3 QGQY-咽炎-核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction（PPI）network of QGQY targets on acute upper respiratory tract infection

圖4 QGQY-咽炎-核心靶點條形圖Fig.4 Bar graph of QGQY action targets on acute upper respiratory tract infections

3.1.4 QGQY預(yù)防咽炎的信號通路分析 將獲得的59個共同作用靶點導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析和KEGG信號通路分析。QGQY影響咽炎的生物過程（BP）涉及302條（P<0.05），主要富集在藥物反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對有機環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、對乙醇的反應(yīng)、對抗生素的反應(yīng)、老化等方面；細(xì)胞組分（CC）涉及26處（P<0.05），主要富集在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、胞質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、線粒體等方面；分子功能（MF）涉及44個（P<0.05），主要富集酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、相同的蛋白集合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等。選取GO功能各部分排名靠前的項目構(gòu)建柱狀圖進(jìn)行展示，見圖5。QGQY預(yù)防咽炎的KEGG信號通路共確定85條信號通路（P<0.05），篩選排名靠前的12條通路進(jìn)行展示，見表3、圖6，其中與炎癥和免疫相關(guān)通路有7條：包括TNF信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路，預(yù)測QGQY預(yù)防咽炎可能通過這些信號通路發(fā)揮作用。

圖5 QGQY對作用靶點的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of QGQY action targets on pharyngitis

表3 KEGG信號通路富集分析Tab.3 KEGG signal pathway analysis

圖6 QGQY對咽炎作用靶點的KEGG分析的氣泡圖Fig.6 Bubble pattern of KEGG analysis of QGQY action targets on pharyngitis

3.2 基于細(xì)胞實驗探究QGQY的抗炎作用

3.2.1 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子的表達(dá) 如圖7A所示，與對照組相比，5、10μg/mL QGQY對THP-1細(xì)胞活力無顯著影響，25 μg/mL QGQY可以顯著抑制THP-1細(xì)胞活力（P＜0.01），后續(xù)采用10 μg/mL濃度在THP-1細(xì)胞中進(jìn)行抗炎作用研究。如圖7B所示，與對照組相比，LPS刺激可以明顯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IKBα 和 IP-10 的表達(dá)（P＜0.01）；與LPS 組相比，10 μg/mL的QGQY可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示QGQY具有抗炎作用。

圖7 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)（±s，n=3）Fig.7 QGQY inhibits LPS-induced expression of inflammatory factors in THP-1 cells（±s，n=3）

3.2.2 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放 如圖8A所示，與對照組相比，0.01、0.1、1、10、100 μg/mL QGQY 組對 RAW264.7 細(xì)胞活力無影響，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），后續(xù)采用1、10、100 μg/mL濃度在RAW264.7細(xì)胞中探討QGQY的抗炎作用。如圖8B所示，與對照組比較，LPS組NO釋放顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與LPS組相比，100 μg/mL的QGQY顯著降低LPS誘導(dǎo)的NO釋放，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放（±s，n=3）Fig.8 QGQY inhibits LPS-induced production of NO in RAW264.7 cells（±s，n=3）

3.2.3 QGQY抑制293T細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的啟動子活性 如圖9A所示，與對照組相比，0.01、0.1、1、10、100、1 000 ng/mL QGQY 組對 293T細(xì)胞活力無影響，10、100、1 000 ng/mL QGQY 可以顯著抑制293T細(xì)胞活力（P＜0.01），后續(xù)采用0.01、0.1、1 ng/mL濃度在293T細(xì)胞中進(jìn)行NF-κB的啟動子活性研究。如圖9B所示，與對照組相比，TNF-α刺激可以明顯誘導(dǎo)293T細(xì)胞中NF-κB啟動子的活性；與 TNF-α 組相比，0.01、0.1、1 ng/mL 的 QGQY可劑量依賴性地抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB啟動子的活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示QGQY具有較好的抗炎活性。

圖9 QGQY抑制293T細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的啟動子活性（±s，n=3）Fig.9 QGQY inhibits TNF-α-induced NF-κB activity of promoter activity in 293T cells（±s，n=3）

4 討論

咽炎的病因復(fù)雜，病程往往遷延日久，纏綿難愈，給患者的生活和工作帶來了極大困擾。中醫(yī)對咽炎的認(rèn)識可謂源遠(yuǎn)流長，歷代醫(yī)家針對本病所提出的治療方案亦是多種多樣，包括內(nèi)治法、外治法、針灸療法以及其他療法等[9]。實踐證明在中醫(yī)藥整體觀念和辨證論治思想指導(dǎo)下，中醫(yī)藥治療咽炎具有一定優(yōu)勢，尤其是中藥代茶飲具有療效確切、不良反應(yīng)少、安全性高、簡單經(jīng)濟(jì)等特點[12-13]。現(xiàn)代臨床研究已經(jīng)證實QGQY制劑對咽炎防治具有較好的療效，方中牛蒡子味辛性涼，疏散風(fēng)邪，解毒利咽；金銀花甘寒芳香，疏散風(fēng)熱，清熱解毒，共為君藥。臣以辛溫不燥之蘇葉，發(fā)表散邪兼以宣發(fā)肺氣；專入肺經(jīng)之桔梗，宣肺祛痰，利咽止咳；赤芍涼血散瘀為佐藥。甘草止咳化痰，調(diào)和諸藥，以為佐使。諸藥合用，共奏清咽潤喉，疏風(fēng)解毒之功。此外，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子、金銀花、桔梗、甘草等均有抗炎、解熱的作用[14-17]。故在此中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，文章進(jìn)一步探究QGQY防治咽炎的作用機制。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，在QGQY中共鑒定出191種活性成分，主要包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、豆甾醇、黃芩素、金合歡素等?，F(xiàn)代研究顯示，這些成分與咽炎關(guān)系密切，如槲皮素具有抗炎和抗病毒活性，可以抑制組胺釋放、減少炎癥因子產(chǎn)生[18]；槲皮素還可以降低哮喘小鼠模型中支氣管肺泡灌洗液、血液和肺實質(zhì)中的白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的含量，是治療鼻炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的有效抑制劑[19]。木犀草素可以改變巨噬細(xì)胞的M1/M2極化，通過下調(diào)p-STAT3和上調(diào)p-STAT6發(fā)揮抗炎作用[20]。山奈酚可以通過阻斷TLR4激活來抑制LPS誘導(dǎo)的氣道上皮BEAS-2B細(xì)胞的炎癥，并通過調(diào)節(jié)IL-8-Tyk2-STAT1/3信號傳導(dǎo)來減輕哮喘小鼠氣道炎癥[21-22]；其次山奈酚對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等病原菌也有較好的抑制作用[23]。以上的結(jié)果表明，QGQY可能通過多組分、多途徑協(xié)同作用，發(fā)揮治療咽炎的作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，STAT3、TNF、IL-6、IL-1β、IL-10、CXCL 10（IP-10）等可能是 QGQY 預(yù)防咽炎的關(guān)鍵靶點。其中，STAT3在互作關(guān)系中出現(xiàn)的頻次最多，STAT3屬于細(xì)胞信號傳導(dǎo)與激活因子STAT蛋白家族（STATs）的成員，是多種炎性細(xì)胞因子利用的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[24]。研究表明，STAT3及其上游激酶在LPS誘導(dǎo)的炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[25-26]。此外，STAT3還參與鼻咽炎、鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展[27-28]。TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子，由TNF引發(fā)的信號傳導(dǎo)控制著呼吸道內(nèi)的多種病理生理功能，如炎癥細(xì)胞的募集和病原體的激活等[29]；高水平的TNF可通過上調(diào)小毛細(xì)血管上的黏附分子，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)入氣道，增加疾病的嚴(yán)重程度[30]，藥理研究亦證實了在急性咽炎大鼠模型中，TNF-α 高表達(dá)[31]。此外，IL-1β、IL-6、IP-10與TNF-α同樣作為經(jīng)典的炎癥因子，在炎癥表達(dá)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是宿主免疫和針對感染的免疫監(jiān)視的主要貢獻(xiàn)者，一旦機體受到外部感染，它們將通過釋放細(xì)胞因子和趨化因子發(fā)揮重要作用，這些細(xì)胞因子和趨化因子反過來將其他免疫細(xì)胞募集到炎癥部位，故常用作為體外炎癥模型[32-34]。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激THP-1細(xì)胞后產(chǎn)生大量白介素類、TNF-α，引起炎癥反應(yīng)和組織損傷[35-36]。以此為基礎(chǔ)，筆者以LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞為模型，探究QGQY對炎癥因子表達(dá)的影響，結(jié)果表明，QGQY可抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IP-10 的水平，提示QGQY具有抗炎活性。

GO生物富集分析表明QGQY影響咽炎的生物過程與藥物反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對雌二醇、乙醇、抗生素的反應(yīng)、對有機環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)、老化、NO生物合成過程的正調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，飲酒等不良的生活習(xí)慣增大了人群患急慢性咽炎的概率[37]，過度酗酒會增加對咽喉黏膜的刺激性，導(dǎo)致咽喉發(fā)炎疼痛。西醫(yī)治療GAS感染引起的慢性咽炎通常首選抗生素，但其重復(fù)使用會導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)[38-39]。NO是由一氧化氮合酶催化氨基L-精氨酸產(chǎn)生的一種高活性生物介質(zhì)，參與機體生理過程和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在炎癥過程中，阻斷NO釋放及其催化酶的激活，可有效抑制炎癥反應(yīng)[40]。在呼吸系統(tǒng)中，NO在肺泡、近端和上呼吸道以及鼻腔中產(chǎn)生，通過濃度梯度擴(kuò)散到細(xì)胞膜上并釋放到氣道中[41]。有研究證實，患有上呼吸道感染的成人患者呼出的空氣中NO水平升高，2011年美國胸科學(xué)會（ATS）指南指出NO可被視為上調(diào)氣道炎癥的間接標(biāo)志物[42]，本實驗研究證實QGQY可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的炎癥巨噬細(xì)胞中NO的釋放，猜測QGQY可能通過NO途徑防治咽炎。

KEGG富集分析結(jié)果表明，QGQY預(yù)防咽炎關(guān)鍵靶點主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、NF-kappa B信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體等信號通路。研究表明，NF-κB是一個高度保守的多功能轉(zhuǎn)錄因子家族，包含5個成員，分別為p65（RelA）、RelB、c-Rel、NF-κB1 和 NF-κB2，它們會組成不同的同源或異源二聚體而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞行為，特別是炎癥反應(yīng)[43]。由病毒和細(xì)菌感染或細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的TNF-α和細(xì)胞產(chǎn)物會激活NF-κB信號通路，激活的NF-κB會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[44]。動物實驗表明，抑制NF-κB磷酸化，可減少TNF-α、IL-1β等促炎因子的分泌，改善咽炎模型大鼠的癥狀[45-47]，本研究通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)初步證實QGQY可以顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB啟動子的活性，并且可以抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中IKBα因子的表達(dá)。綜上，這些結(jié)果表明QGQY制劑具有一定的抗炎作用，其機制可能與抑制NF-κB激活有關(guān)。

研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和細(xì)胞實驗相結(jié)合的方法，證實了QGQY具有抗炎和防治咽炎的潛在作用，同時也預(yù)測了可能的機制，為QGQY用于臨床咽炎等上呼吸道感染相關(guān)疾病的治療提供的數(shù)據(jù)支持，也為后續(xù)進(jìn)一步開展體內(nèi)藥理學(xué)實驗提供了重要參考。

致謝：文章獲2022年國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)臨床療效提升項目支持。