盧佳,蘇瑞,閆慧敏,晏一淇,苗琳,張晗
(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,天津 301617;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室,天津 301617;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教育部重點實驗室,天津 301617)
咽炎(Pharyngitis)是一種由咽部各種微生物引起的上呼吸道炎癥性疾病,屬于耳鼻喉科的常見病和多發(fā)病[1],病程可長可短,亦可反復(fù)發(fā)作[2-3]。咽炎的發(fā)病因素復(fù)雜,主要包括細(xì)菌或病毒感染,除此之外各種有害刺激如過度煙酒、辛辣食物、煙霧、粉塵及有害氣體亦為可導(dǎo)致和加劇咽炎的發(fā)生和發(fā)展[4]。咽炎的主要臨床癥狀表現(xiàn)為咽部干癢、紅腫、疼痛及異物哽阻不適、喉底或有顆粒狀突起和不易咯出分泌物等[5-6]。中醫(yī)將咽炎稱為“喉痹”,如《素問·陰陽別論》記載:“一陰一陽結(jié),謂之喉痹?!盵7]對于咽炎的病因病機,中醫(yī)理論認(rèn)為多為外淫或者內(nèi)傷導(dǎo)致的臟腑功能失調(diào),循經(jīng)上擾咽喉而引發(fā)[8-9]。
中成藥“清感秋飲”(QGQY)是天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室團(tuán)隊研發(fā)的“清感飲”(系列)制劑之一。2020年,“清感飲”系列通過了天津市藥監(jiān)局的審批,成為了特色中藥院內(nèi)制劑,主治咳嗽,咽痛,鼻塞、流涕,或急慢性咽喉炎,急慢性鼻炎等呼吸道疾病見上述癥狀者。QGQY由牛蒡子(Arctium lappa L.)、射干[Belamcanda chinensis(L.)DC.]、桔梗[Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.]、赤芍(Paeonia lactiflora Pall.)、紫蘇葉[Perilla frutescens(L.)Britt.]、金銀花(Lonicera japonica Thunb)、山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、北沙參(Adenophora stricta Miq.)和桑葉(Morus alba L.)共10味中藥組成,具有養(yǎng)陰潤燥、疏風(fēng)散熱、芳香化濕,清喉利咽等功效,可用于風(fēng)燥襲肺證。課題組的前期臨床研究證實,QGQY可以預(yù)防和治療咽炎等呼吸系統(tǒng)感染性疾病[10],但其機制尚不清楚。
文章首先應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測QGQY治療咽炎可能的分子靶點和信號通路,并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行細(xì)胞水平抗炎實驗驗證,為QGQY的臨床應(yīng)用提供實驗證據(jù)和理論依據(jù)。
1.1 細(xì)胞與藥物 人單核細(xì)胞(THP-1)由瑞士蘇黎世大學(xué)Michael Hottiger教授饋贈。小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。人腎上皮細(xì)胞(293T)由南開大學(xué)藥學(xué)院白鋼教授實驗室提供。感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)購自天根生化科技有限公司。
QGQY 提取物(批號:KG20200219-3),由天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥創(chuàng)新中心提供。將牛蒡子3 g,射干 2 g,桔梗 2 g,赤芍 2 g,蘇葉 2 g,金銀花 3 g,山楂1枚,烏梅1枚,甘草 1 g,沙參 3 g,桑葉 2 g混合,加入10倍量蒸餾水,浸泡40 min,煮沸,過濾,重復(fù)以上步驟1次,合并2次濾液,60℃以下濃縮至糖度為15-17Brix,噴霧干燥即得。臨用前用超純水溶解。
1.2 主要儀器與試劑 臺式震蕩培養(yǎng)箱購自伊孚森(中國)生物技術(shù)有限公司;Nikon倒置顯微鏡購自北京恒三江儀器銷售有限公司;酶標(biāo)儀購自北京海天友誠科技有限公司;實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀購自美國Bio-Rad公司;Multilabel Plate Reader功能讀板儀購自美國Perkins Elmer公司。
脂多糖(LPS,貨號 L6529)購自美國 Sigma公司;胎牛血清(FBS,貨號 04-001-1A)、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號01-100-1ACS)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號 01-052-1ACS)、磷酸鹽緩沖液(PBS,貨號02-024-1A)購自以色列Biological Industries公司;CCK-8檢測試劑盒(貨號C6005)、LDH試劑盒(貨號CK12)購自日本Dojindo Lab公司;RNA提取試劑盒(貨號19211ES60)購自天津翌圣生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號AT341-02)購自北京全式金生物科技有限公司;定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)試劑盒(貨號A6001)、螢火蟲熒光素酶報告基因載體 pGL4.32(貨號 E849A)、pGL4.75(貨號 E6931)購自美國Promega公司;一氧化氮(NO)檢測試劑盒(貨號S0021M)購自碧云天生物技術(shù)有限公司;地塞米松(貨號HY-14648)購自美國MedChemExpress公司;氨芐西林(貨號A6920)、LB液體培養(yǎng)基(貨號L1010)、LB 固體培養(yǎng)基(貨號 L1015)、甘油(貨號G8190)購自北京索萊寶公司;質(zhì)粒小提試劑盒(貨號DP103-02)購自天根生化科技有限公司。
2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法
2.1.1 QGQY活性成分的篩選及作用靶點的獲得 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索QGQY方中牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、金銀花、甘草、北沙參、桑葉8味中藥的化合物,利用中醫(yī)藥證候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(SymMap,http://www.symmap.org/)檢索紫蘇葉、山楂的化合物,并將獲取的全部化合物在TCMSP中檢索,以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件獲得候選化合物。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取候選化合物的潛在靶點,利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Uniprot,https://www.uniprot.org/)將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點統(tǒng)一要求規(guī)范。
2.1.2 咽炎相關(guān)靶點篩選 在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.GeneCards.org/)和與疾病相關(guān)的基因數(shù)據(jù)庫(DisGeNET,http://www.disgenet.org/)中,以“Pharyngitis”作為關(guān)鍵詞,篩選咽炎相關(guān)的潛在靶點。其中Genecards數(shù)據(jù)庫以Relevance score的中位數(shù)的2倍為卡值,DisGeNET數(shù)據(jù)庫不作篩選,將兩個數(shù)據(jù)庫的靶點合并刪除重復(fù)值后獲得咽炎相關(guān)靶點。
2.1.3 中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過韋恩圖取交集,獲得藥物與疾病共同作用靶點,利用Cytoscape_v3.8.2軟件構(gòu)建“QGQY中藥化合物靶點-疾病咽炎靶點”網(wǎng)絡(luò),使用其內(nèi)置工具Network Analyzer計算出度值(degree),篩選出主要活性化合物。
2.1.4 蛋白質(zhì)互作分析(PPI) 將共同作用靶點導(dǎo)入蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫(STRING,https://string-db.org/),限定物種為“Homo sapiens(智人)”,設(shè)置最高置信度分?jǐn)?shù)score>0.7,隱藏?zé)o接觸節(jié)點,下載TSV結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.2軟件進(jìn)行可視化,制作PPI圖。
2.1.5 基因本體論分析(GO)和京都基因與基因組百科全書通路富集分析(KEGG) 將上述的共同靶點導(dǎo)入注釋可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(DAVID,https//david.ncifcrf.gov/),標(biāo)識符設(shè)置為“OFFICIAL GENE SYMBOL”,限定物種為“Homo sapiens”,進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析,保存結(jié)果。設(shè)定閾值P<0.05,并按照涉及的靶點數(shù)目多少進(jìn)行排序,篩選排名靠前的生物過程或通路。
2.2 細(xì)胞實驗方法
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 THP-1細(xì)胞用含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),RAW264.7、293T 細(xì)胞用含 10%FBS 和 1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。THP-1細(xì)胞以1×106/mL密度接種于6孔板,24 h后分組處理。對照組(Ctrl組):加入雙蒸水;模型組:加入 LPS(100 ng/mL)孵育 16 h;QGQY 組:QGQY(10 μg/mL)預(yù)孵育 4 h 再加入LPS(100 ng/mL)孵育16 h,進(jìn)行實時熒光定量PCR(RT-PCR)實驗。RAW 264.7 細(xì)胞以 2×105/mL密度接種于96孔板,24 h后分組處理。Ctrl組:無菌 PBS;模型組:加入 LPS(1 μg/mL);QGQY 組:LPS(1 μg/mL)與 QGQY(1、10、100 μg/mL)共同孵育,24 h后檢測NO含量。293T細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于96孔板,轉(zhuǎn)染后分組處理。Ctrl組:無菌PBS;模型組:加入腫瘤壞死因子(TNF)-α(10 ng/mL);地塞米松組(10 μmol/L):TNF-α 與 Dex(0.01、0.1、1ng/mL)共同孵育;QGQY 組:TNF-α 與 QGQY(0.01、0.1、1ng/mL)共同孵育;6h 后檢測核因子 κB(NF-κB)啟動子活性。
2.2.2 細(xì)胞活力檢測 分別取對數(shù)期的THP-1、RAW264.7、293T 細(xì)胞接種于 96 孔板,24 h 后加入不同濃度的QGQY,24 h后進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液移至新的96孔板內(nèi),按LDH檢測試劑盒(CK12,九州島,日本)說明書步驟,每孔100 μL,后每孔加入 100 μL Working Solution,避光室溫反應(yīng)30 min后于492 nm處檢測吸光度值。用PBS潤洗細(xì)胞,按照CCK8檢測試劑盒(C6005,九州島,日本)說明書步驟,加入 100 μL/孔的 1×CCK8 工作液,37℃孵育1 h于450 nm處測定吸光度值。
2.2.3 RT-PCR 按照RNA提取試劑盒(19211ES60,天津,中國)說明書,提取THP-1細(xì)胞RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AT341-02,北京,中國)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板,使用SYBR-Green(A6001,威斯康辛州,美國)擴(kuò)增 cDNA,檢測 TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IKBα和IP-10 mRNA水平的表達(dá)情況,以GAPDH為內(nèi)參。具體引物序列如下,TNF-α:(上游)5’-GCGGTGCTTGTTCCTCAG-3’,5’-GGCTACAGG CTTGTCACTC-3’;白介素(IL)-1β:(上游)5’-CCA GGGACAGGTATGGAGCA-3’,5’-TTCAACACGCAG GACAGGTACAG-3’;IL-6:(上游)5,-GGCACTGGC AGAAAACAACC-3’,5’-GCAAGTCTCCTCATTGAA TCC-3’;IκBα:(上游)5’-GCACCTCCACTCCATCCTG AAGG-3’,5’-CCATTACAGGGCTCCTGAGCATTG-3’;IP-10:(上游)5’-GGTGAGAAGAGATGTCTGAATC-3’,5’-GTAGGGAAGTGATGGGAGAG-3’;GAPDH:(上游)5’-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3’,5’-CTGG AAGATGGTGATGGGTT-3’。
2.2.4 NO水平檢測 收集RAW264.7細(xì)胞上清液,根據(jù)NO試劑盒(S0021M,上海,中國)說明書步驟操作,按50 μL/孔,在96孔板中加入對照品溶液及樣品,室溫下再每孔依次加入Griess Ⅰ和Griess Ⅱ試劑各50 μL,于酶標(biāo)儀540 nm處測定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算出樣品中NO的濃度。
2.2.5 雙熒光素酶活性檢測 取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞生長密度達(dá)到70%~80%時,使用PEI試劑(23966-1,沃靈頓,美國)共轉(zhuǎn)染NF-κB熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4.32和海腎熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4.75,培養(yǎng)24 h后裂解細(xì)胞,用Dual-Luciferase檢測試劑盒(E191O,沃爾瑟姆,美國)在酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光,記錄螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的活性數(shù)值,計算比值,即為相對熒光素酶活性(Relative luciferase activity)。
2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8.0.1軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計量資料多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。
3.1.1 QGQY活性化合物-靶點預(yù)測 通過在TCMSP及SymMap平臺檢索得到QGQY已報道的化學(xué)成分,根據(jù)設(shè)置的篩選調(diào)節(jié),經(jīng)整合QGQY方共獲得化學(xué)成分191個,對應(yīng)的靶點共1 269個,最后去除重復(fù)結(jié)果共得到276個潛在靶點,見表1。
表1 QGQY化合物成分和靶點Tab.1 Ingredients and targets situation of QGQY
3.1.2 QGQY預(yù)防咽炎的潛在靶點 檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫,根據(jù)篩選條件得到咽炎靶點共544個(Uniprot轉(zhuǎn)換后),DisGeNET數(shù)據(jù)庫共得到29個靶點,合并兩個數(shù)據(jù)庫靶點刪除重復(fù)后共得到562個。通過韋恩圖將QGQY活性成分預(yù)測靶點與咽炎相關(guān)疾病靶點取交集,共得到59個相關(guān)靶點,見圖1。將得到的共同作用靶點一一對應(yīng)QGQY的活性化合物,得到145個,導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.2軟件,構(gòu)建“中藥-化合物-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò),見圖2。該網(wǎng)絡(luò)包括214個節(jié)點(10味中藥、145個活性成分、59個靶點),539條相互關(guān)系。從圖中可知,一個活性成分不只是對應(yīng)一個作用靶點,一個作用靶點也可對應(yīng)一個或多個活性成分,網(wǎng)絡(luò)圖充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點的相互作用的特征,網(wǎng)絡(luò)分析顯示3、槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、豆甾醇、黃芩素、金合歡素等成分degree值較高,見表2,可以作為QGQY防治咽炎關(guān)鍵活性成分進(jìn)一步研究。
圖1 疾病靶點-藥物靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of disease target and drug target
圖2 QGQY中藥-化合物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Target network of main components of QGQY
表2 QGQY中degree排名前8的關(guān)鍵活性成分信息Tab.2 Basic information of the top 8 main active ingredients in QGQY
3.1.3 PPI互作分析 采用Cystoscope3.8.2軟件對59個重疊靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3。圖中節(jié)點代表靶點,靶點之間的關(guān)聯(lián)用邊表示[11],該PPI網(wǎng)絡(luò)共包含59個節(jié)點、376條邊,節(jié)點大小代表degree值,每個節(jié)點的重要性與degree值呈正相關(guān)。對排名前10位靶點的degree值進(jìn)行排序,見圖4,其中,對這些靶點進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)大多與炎癥相關(guān),包括預(yù)測信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6、IL-1β、IL-10、趨化因子 10(CXCL 10)等,推測這些可能是QGQY預(yù)防咽炎的潛在靶點。
圖3 QGQY-咽炎-核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction(PPI)network of QGQY targets on acute upper respiratory tract infection
圖4 QGQY-咽炎-核心靶點條形圖Fig.4 Bar graph of QGQY action targets on acute upper respiratory tract infections
3.1.4 QGQY預(yù)防咽炎的信號通路分析 將獲得的59個共同作用靶點導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析和KEGG信號通路分析。QGQY影響咽炎的生物過程(BP)涉及302條(P<0.05),主要富集在藥物反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對有機環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、對乙醇的反應(yīng)、對抗生素的反應(yīng)、老化等方面;細(xì)胞組分(CC)涉及26處(P<0.05),主要富集在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、胞質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、線粒體等方面;分子功能(MF)涉及44個(P<0.05),主要富集酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、相同的蛋白集合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合等。選取GO功能各部分排名靠前的項目構(gòu)建柱狀圖進(jìn)行展示,見圖5。QGQY預(yù)防咽炎的KEGG信號通路共確定85條信號通路(P<0.05),篩選排名靠前的12條通路進(jìn)行展示,見表3、圖6,其中與炎癥和免疫相關(guān)通路有7條:包括TNF信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路,預(yù)測QGQY預(yù)防咽炎可能通過這些信號通路發(fā)揮作用。
圖5 QGQY對作用靶點的GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of QGQY action targets on pharyngitis
表3 KEGG信號通路富集分析Tab.3 KEGG signal pathway analysis
圖6 QGQY對咽炎作用靶點的KEGG分析的氣泡圖Fig.6 Bubble pattern of KEGG analysis of QGQY action targets on pharyngitis
3.2.1 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子的表達(dá) 如圖7A所示,與對照組相比,5、10μg/mL QGQY對THP-1細(xì)胞活力無顯著影響,25 μg/mL QGQY可以顯著抑制THP-1細(xì)胞活力(P<0.01),后續(xù)采用10 μg/mL濃度在THP-1細(xì)胞中進(jìn)行抗炎作用研究。如圖7B所示,與對照組相比,LPS刺激可以明顯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IKBα 和 IP-10 的表達(dá)(P<0.01);與LPS 組相比,10 μg/mL的QGQY可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的高表達(dá),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示QGQY具有抗炎作用。
圖7 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)(±s,n=3)Fig.7 QGQY inhibits LPS-induced expression of inflammatory factors in THP-1 cells(±s,n=3)
3.2.2 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放 如圖8A所示,與對照組相比,0.01、0.1、1、10、100 μg/mL QGQY 組對 RAW264.7 細(xì)胞活力無影響,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),后續(xù)采用1、10、100 μg/mL濃度在RAW264.7細(xì)胞中探討QGQY的抗炎作用。如圖8B所示,與對照組比較,LPS組NO釋放顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與LPS組相比,100 μg/mL的QGQY顯著降低LPS誘導(dǎo)的NO釋放,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
圖8 QGQY抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的釋放(±s,n=3)Fig.8 QGQY inhibits LPS-induced production of NO in RAW264.7 cells(±s,n=3)
3.2.3 QGQY抑制293T細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的啟動子活性 如圖9A所示,與對照組相比,0.01、0.1、1、10、100、1 000 ng/mL QGQY 組對 293T細(xì)胞活力無影響,10、100、1 000 ng/mL QGQY 可以顯著抑制293T細(xì)胞活力(P<0.01),后續(xù)采用0.01、0.1、1 ng/mL濃度在293T細(xì)胞中進(jìn)行NF-κB的啟動子活性研究。如圖9B所示,與對照組相比,TNF-α刺激可以明顯誘導(dǎo)293T細(xì)胞中NF-κB啟動子的活性;與 TNF-α 組相比,0.01、0.1、1 ng/mL 的 QGQY可劑量依賴性地抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB啟動子的活性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示QGQY具有較好的抗炎活性。
圖9 QGQY抑制293T細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的啟動子活性(±s,n=3)Fig.9 QGQY inhibits TNF-α-induced NF-κB activity of promoter activity in 293T cells(±s,n=3)
咽炎的病因復(fù)雜,病程往往遷延日久,纏綿難愈,給患者的生活和工作帶來了極大困擾。中醫(yī)對咽炎的認(rèn)識可謂源遠(yuǎn)流長,歷代醫(yī)家針對本病所提出的治療方案亦是多種多樣,包括內(nèi)治法、外治法、針灸療法以及其他療法等[9]。實踐證明在中醫(yī)藥整體觀念和辨證論治思想指導(dǎo)下,中醫(yī)藥治療咽炎具有一定優(yōu)勢,尤其是中藥代茶飲具有療效確切、不良反應(yīng)少、安全性高、簡單經(jīng)濟(jì)等特點[12-13]。現(xiàn)代臨床研究已經(jīng)證實QGQY制劑對咽炎防治具有較好的療效,方中牛蒡子味辛性涼,疏散風(fēng)邪,解毒利咽;金銀花甘寒芳香,疏散風(fēng)熱,清熱解毒,共為君藥。臣以辛溫不燥之蘇葉,發(fā)表散邪兼以宣發(fā)肺氣;專入肺經(jīng)之桔梗,宣肺祛痰,利咽止咳;赤芍涼血散瘀為佐藥。甘草止咳化痰,調(diào)和諸藥,以為佐使。諸藥合用,共奏清咽潤喉,疏風(fēng)解毒之功。此外,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子、金銀花、桔梗、甘草等均有抗炎、解熱的作用[14-17]。故在此中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上,文章進(jìn)一步探究QGQY防治咽炎的作用機制。
通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,在QGQY中共鑒定出191種活性成分,主要包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、豆甾醇、黃芩素、金合歡素等?,F(xiàn)代研究顯示,這些成分與咽炎關(guān)系密切,如槲皮素具有抗炎和抗病毒活性,可以抑制組胺釋放、減少炎癥因子產(chǎn)生[18];槲皮素還可以降低哮喘小鼠模型中支氣管肺泡灌洗液、血液和肺實質(zhì)中的白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的含量,是治療鼻炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的有效抑制劑[19]。木犀草素可以改變巨噬細(xì)胞的M1/M2極化,通過下調(diào)p-STAT3和上調(diào)p-STAT6發(fā)揮抗炎作用[20]。山奈酚可以通過阻斷TLR4激活來抑制LPS誘導(dǎo)的氣道上皮BEAS-2B細(xì)胞的炎癥,并通過調(diào)節(jié)IL-8-Tyk2-STAT1/3信號傳導(dǎo)來減輕哮喘小鼠氣道炎癥[21-22];其次山奈酚對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等病原菌也有較好的抑制作用[23]。以上的結(jié)果表明,QGQY可能通過多組分、多途徑協(xié)同作用,發(fā)揮治療咽炎的作用。
PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明,STAT3、TNF、IL-6、IL-1β、IL-10、CXCL 10(IP-10)等可能是 QGQY 預(yù)防咽炎的關(guān)鍵靶點。其中,STAT3在互作關(guān)系中出現(xiàn)的頻次最多,STAT3屬于細(xì)胞信號傳導(dǎo)與激活因子STAT蛋白家族(STATs)的成員,是多種炎性細(xì)胞因子利用的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[24]。研究表明,STAT3及其上游激酶在LPS誘導(dǎo)的炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[25-26]。此外,STAT3還參與鼻咽炎、鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展[27-28]。TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子,由TNF引發(fā)的信號傳導(dǎo)控制著呼吸道內(nèi)的多種病理生理功能,如炎癥細(xì)胞的募集和病原體的激活等[29];高水平的TNF可通過上調(diào)小毛細(xì)血管上的黏附分子,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)入氣道,增加疾病的嚴(yán)重程度[30],藥理研究亦證實了在急性咽炎大鼠模型中,TNF-α 高表達(dá)[31]。此外,IL-1β、IL-6、IP-10與TNF-α同樣作為經(jīng)典的炎癥因子,在炎癥表達(dá)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)是宿主免疫和針對感染的免疫監(jiān)視的主要貢獻(xiàn)者,一旦機體受到外部感染,它們將通過釋放細(xì)胞因子和趨化因子發(fā)揮重要作用,這些細(xì)胞因子和趨化因子反過來將其他免疫細(xì)胞募集到炎癥部位,故常用作為體外炎癥模型[32-34]。研究發(fā)現(xiàn),脂多糖刺激THP-1細(xì)胞后產(chǎn)生大量白介素類、TNF-α,引起炎癥反應(yīng)和組織損傷[35-36]。以此為基礎(chǔ),筆者以LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞為模型,探究QGQY對炎癥因子表達(dá)的影響,結(jié)果表明,QGQY可抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IP-10 的水平,提示QGQY具有抗炎活性。
GO生物富集分析表明QGQY影響咽炎的生物過程與藥物反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對雌二醇、乙醇、抗生素的反應(yīng)、對有機環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)、老化、NO生物合成過程的正調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),飲酒等不良的生活習(xí)慣增大了人群患急慢性咽炎的概率[37],過度酗酒會增加對咽喉黏膜的刺激性,導(dǎo)致咽喉發(fā)炎疼痛。西醫(yī)治療GAS感染引起的慢性咽炎通常首選抗生素,但其重復(fù)使用會導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)[38-39]。NO是由一氧化氮合酶催化氨基L-精氨酸產(chǎn)生的一種高活性生物介質(zhì),參與機體生理過程和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié),在炎癥過程中,阻斷NO釋放及其催化酶的激活,可有效抑制炎癥反應(yīng)[40]。在呼吸系統(tǒng)中,NO在肺泡、近端和上呼吸道以及鼻腔中產(chǎn)生,通過濃度梯度擴(kuò)散到細(xì)胞膜上并釋放到氣道中[41]。有研究證實,患有上呼吸道感染的成人患者呼出的空氣中NO水平升高,2011年美國胸科學(xué)會(ATS)指南指出NO可被視為上調(diào)氣道炎癥的間接標(biāo)志物[42],本實驗研究證實QGQY可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的炎癥巨噬細(xì)胞中NO的釋放,猜測QGQY可能通過NO途徑防治咽炎。
KEGG富集分析結(jié)果表明,QGQY預(yù)防咽炎關(guān)鍵靶點主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Jak-STAT信號通路、NF-kappa B信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體等信號通路。研究表明,NF-κB是一個高度保守的多功能轉(zhuǎn)錄因子家族,包含5個成員,分別為p65(RelA)、RelB、c-Rel、NF-κB1 和 NF-κB2,它們會組成不同的同源或異源二聚體而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)許多重要的細(xì)胞行為,特別是炎癥反應(yīng)[43]。由病毒和細(xì)菌感染或細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的TNF-α和細(xì)胞產(chǎn)物會激活NF-κB信號通路,激活的NF-κB會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[44]。動物實驗表明,抑制NF-κB磷酸化,可減少TNF-α、IL-1β等促炎因子的分泌,改善咽炎模型大鼠的癥狀[45-47],本研究通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)初步證實QGQY可以顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB啟動子的活性,并且可以抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中IKBα因子的表達(dá)。綜上,這些結(jié)果表明QGQY制劑具有一定的抗炎作用,其機制可能與抑制NF-κB激活有關(guān)。
研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和細(xì)胞實驗相結(jié)合的方法,證實了QGQY具有抗炎和防治咽炎的潛在作用,同時也預(yù)測了可能的機制,為QGQY用于臨床咽炎等上呼吸道感染相關(guān)疾病的治療提供的數(shù)據(jù)支持,也為后續(xù)進(jìn)一步開展體內(nèi)藥理學(xué)實驗提供了重要參考。
致謝:文章獲2022年國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)臨床療效提升項目支持。