楊熙凱，王耀光

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

慢性腎臟病（CKD）作為一個世界性的公共衛(wèi)生問題，目前仍然沒有治療疾病的特效藥物或者其他根治手段，并且隨著疾病的發(fā)展，2%的患者會發(fā)展為終末期腎臟病（ESRD）[1]，給世界各國的衛(wèi)生資源帶來了沉重的壓力。腎間質(zhì)纖維化（RIF）是慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎衰竭必經(jīng)的病變過程，以腎臟間質(zhì)中病理性的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失為特征[2]，是攻克慢性腎臟病的一個重要難關(guān)。其中上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是一個重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，腎小管上皮細(xì)胞受刺激表型轉(zhuǎn)化后分泌促纖維因子并形成間質(zhì)成纖維細(xì)胞[3]，是形成RIF的重要途徑，值得進(jìn)一步探明其機(jī)制。

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是一種在缺血或缺氧條件下適應(yīng)性反應(yīng)的因子[4]，在缺氧狀態(tài)下血管平滑肌大量分泌HIF-1α亞基，直接刺激其下游靶蛋白血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）高表達(dá)，從而參與血管再生、其次通過介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、GSK/βcatenin信號通路的表達(dá)等方式調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的生成與重塑[5]，并且有研究表明，在HIF-1α高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，觀察到了ECM的沉積以及間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化，提示了RIF的發(fā)生[6]。所以研究其在RIF方面的相互作用及機(jī)制也存在較大意義，可能為RIF乃至CKD的診斷、治療提供新的作用靶點(diǎn)。

“腎疏寧”為全國名中醫(yī)黃文政教授根據(jù)“疏利少陽三焦”學(xué)說創(chuàng)立，在治療腎系疾病方面有著不錯的臨床療效[7-9]，同時基于療效的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)也從不同角度不同機(jī)制證明了“腎疏寧”的有效性，如腎疏寧能抑制系膜增生性腎炎大鼠模型細(xì)胞外基質(zhì)的合成并促進(jìn)其降解[10-12]。同時，本方蘊(yùn)含了“補(bǔ)中寓消，消中有補(bǔ)”的治療思路，結(jié)合了補(bǔ)氣法及消瘀法。中醫(yī)以“癥瘕”論述RIF，補(bǔ)氣活血是最直接的治療手段。其中補(bǔ)氣、活血法代表藥物“黃芪-丹參”藥對則最可能為針對性藥物，也是實(shí)驗(yàn)選擇藥物的理論依據(jù)。

故實(shí)驗(yàn)基于“腎疏寧”對RIF的有效性，對方中補(bǔ)氣活血藥對“黃芪-丹參”進(jìn)行分析，利用Masson染色、免疫組化等方法對單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠腎臟各指標(biāo)進(jìn)行檢測，旨在研究UUO模型HIF-1α的改變以及“黃芪-丹參”藥對的腎保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與試劑 脫水機(jī)，武漢俊杰公司（JJ-12J）、包埋機(jī)，金華科迪公司（KD-BM）、梯度 PCR儀，美國ABI ProFlex公司（4484073）、熒光定量PCR 儀，瑞士 Roche公司（LightCycler96）、HP Total RNA Kit，美國 Omega Bio-Tek 公司（R6812-01）、HiFiScript cDNA Synthesis Kit，北京康為世紀(jì)公司（CW2569）、UltraSYBR Mixture（Low ROX），北京康為世紀(jì)公司（CW2601S）、Smooth Muscle Actin Rabbit Polyclonal Antibody，武漢 Proteintech公司（14395-1-AP）、GAPDH Rabbit Polyclonal antibody， 武 漢Proteintech公司（10494-1-AP）、Rabbit Anti-HIF-1 alpha antibody，英國 abcam 公司（ab179483）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋公司（ZB-2301）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 選用大鼠為SPF級健康SD大鼠72只，雄性，體質(zhì)量（190±10）g，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物房，實(shí)驗(yàn)期間飲用水為清潔自來水、自由攝食，實(shí)驗(yàn)室自然光照，室溫20～24℃左右，通風(fēng)濕度良好，隔兩日更換1次墊料，大鼠購回后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周狀態(tài)良好后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 黃芪、丹參均購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國藥堂?！包S芪-丹參”藥對依照腎疏寧[7]的中藥配伍比例，成人每日服藥用量為黃芪30 g，丹參30 g，每日總生藥量為60 g。旋蒸濃縮，將藥液濃度濃縮至1．8 g/mL，4℃保存，灌胃依照不同劑量稀釋。氯沙坦鉀片（科素亞）購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》通過人與大鼠間體表面積換算大鼠等效劑量，將氯沙坦鉀片用生理鹽水溶解，配制為1 mg/mL濃度溶液，4℃保存，灌胃時稀釋使用。

1.4 UUO模型制備 選取RIF常用大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，術(shù)前禁食不禁水12 h，將大鼠稱質(zhì)量并記錄。使用生理鹽水將水合氯醛配置成10%水合氯醛溶液，按照0．3 mL/100 g的劑量對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后仰臥位固定，下腹部正中偏左備皮、后進(jìn)行無菌操作，于大鼠左側(cè)肋腰點(diǎn)切開皮膚層、肌層至腹腔，翻開腸，找到左腎，在左腎下極鈍性剝離左側(cè)輸尿管，假手術(shù)組（Sham）剝離后不作處理，縫合肌層及皮膚層，碘伏及酒精消毒；其余組大鼠使用手術(shù)縫合線在輸尿管近腎盂段及輸尿管遠(yuǎn)端分別結(jié)扎，縫合線間斷縫合肌層及皮膚層，碘伏及乙醇消毒，術(shù)后3 d予劑量為每鼠8萬單位的青霉素腹腔注射防止感染，以腎臟組織Masson染色觀察腎小管萎縮、RIF、間質(zhì)浸潤、小管擴(kuò)張的形成判定UUO模型造模成功。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將72只大鼠依次編號，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為Sham、模型組（UUO）、芪參低劑量組（UUO+TCM-L）、芪參中劑量組（UUO+TCMM）、芪參高劑量組（UUO+TCM-H）、氯沙坦組（UUO+Losartan）共6組，每組12只。各組大鼠在手術(shù)后1 d開始灌胃，中藥參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》換算藥物濃度進(jìn)行灌胃，具體如下：1）Sham與UUO組灌服生理鹽水。2）UUO+TCM-L：依照1/2等效劑量[2．7 g/（kg·d）]灌胃。3）UUO+TCM-M：依照等效劑量[5．4 g/（kg·d）]灌胃。4）UUO+TCM-H：依照2倍等效劑量[10．8 g/（kg·d）]灌胃。5）UUO+Losartan：依照等效劑量[9 mg/（kg·d）]灌胃。大鼠于給藥第13日灌胃后開始禁食不禁水，次日灌胃2 h后開始取材檢測。

2.2 腎臟病理標(biāo)本的制作及Masson染色 使用4%多聚甲醛對腎臟組織進(jìn)行固定，后經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制作病理標(biāo)本，切片后進(jìn)行Masson染色，之后將染色后切片置于光鏡下觀察腎臟組織膠原纖維形成情況。對每個樣品，進(jìn)行400×的顯微照相，鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀察，借助Image J軟件，計算腎組織膠原纖維占整個腎組織面積的百分比，得出膠原容積。

2.3 免疫組織化學(xué)法 將已固定的腎臟組織切片后脫蠟，使用0．01 mmol檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，山羊血清封閉后加入一抗體α-SMA（1∶100稀釋），4℃過夜。使用生物素化二抗在37℃下孵育30 min，鏈霉卵白素工作液反應(yīng)后。加二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色，后使用蘇木素復(fù)染，封片后鏡下觀察，本實(shí)驗(yàn)使用免疫組化評分（IHS）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該方法所得結(jié)果近似于基于圖像分析軟件的評分系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)[13]。通過將出現(xiàn)免疫反應(yīng)細(xì)胞的百分比（數(shù)量得分）與染色強(qiáng)度的估計值（染色強(qiáng)度得分）相結(jié)合得出結(jié)果。如：數(shù)量得分以0～1%=0、1～10%=1、10～50%=2、50～80%=3、80～100%=4 記分；細(xì)胞染色強(qiáng)度得分以 0（陰性）、1（弱陽性）、2（陽性）、3（強(qiáng)陽性）計分。通過5個視野的閱片得出數(shù)量得分以及染色強(qiáng)度得分，兩者相乘為免疫組化積分。

2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 使用試劑盒提取法提取腎臟組織總RNA，運(yùn)用HiFiScript cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時定量PCR由Roche LC96系統(tǒng)進(jìn)行。反應(yīng)程序如下進(jìn)行PCR：預(yù)變性95℃10 min，然后40個循環(huán)，每個循環(huán)包括變性95℃15 s，退火/延伸60℃1 min。PCR通過計算基因的相對表達(dá)量（2-ΔΔCt）分析結(jié)果：以GAPDH為內(nèi)參基因，計算方法為：ΔΔCt＝ΔCt實(shí)驗(yàn)組（目的基因 Ct值-內(nèi)參基因Ct值）-ΔCt對照組（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）。引物序列通過NCBI網(wǎng)站查詢，運(yùn)用BLAST進(jìn)行序列比對、檢驗(yàn)引物特異性。所獲得序列由上海生工公司代為合成。序列如下：

2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測UUO大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達(dá) RIPA裂解腎臟組織，定量后制備蛋白樣品后上樣，通過10%SurePAGE預(yù)制膠電泳分離樣品，采用濕式電轉(zhuǎn)膜法將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。快速封閉液封閉后，將PVDF膜4℃下與一抗孵育過夜。一抗Rabbit Anti-HIF-1 alpha antibody（1∶500 稀釋）、GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（1∶10 000 稀釋）。過夜后二抗孵育 1 h，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG（1∶10 000 稀釋）。之后使用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在成像儀平臺可視化蛋白質(zhì)。應(yīng)用Image J軟件測定目的條帶及相應(yīng)內(nèi)參的灰度值。結(jié)果以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 26．0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)比較前先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。多組間差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），符合正態(tài)分布且方差齊時組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布時使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Masson染色 染色藍(lán)色區(qū)域主要為膠原成分。Sham的膠原纖維主要出現(xiàn)在基底膜和系膜區(qū)，而與Sham比較，UUO大鼠可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積，充斥于腎間質(zhì)區(qū)域。治療組大鼠腎間質(zhì)內(nèi)的藍(lán)色膠原較模型組減少。通過對膠原容積的計算可知，UUO 與 Sham 比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001），UUO+TCM-L較UUO有改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；UUO+TCM-M、UUO+TCM-H 與 UUO 比較纖維化有改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；UUO+Losartan與UUO及UUO+TCM-H比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001）。見圖1。

圖1 Masson 染色及膠原容積情況（±s，×400）Fig.1 Masson staining and collagen volume（±s，×400）

3.2 免疫組化法檢測各組大鼠α-SMA蛋白表達(dá)情況 UUO手術(shù)后出現(xiàn)了α-SMA的高表達(dá)，蛋白的沉積主要出現(xiàn)在腎間質(zhì)及腎小管上皮細(xì)胞。根據(jù)免疫組化積分，大鼠UUO相較Sham蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001），在服用芪參中、高劑量以及氯沙坦后蛋白表達(dá)均有改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），UUO+TCM-L與UUO比較有改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見圖2。

圖2 α-SMA蛋白表達(dá)及免疫組化反應(yīng)積分（±s，×400）Fig.2 Expression level of α-SMA and IHS（±s，×400）

3.3 Real-time qPCR檢測各組大鼠Col1、FN mRNA的表達(dá) UUO大鼠對比Sham，Col1、FNmRNA表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；UUO+TCM-L與UUO比較時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；對于Col1 mRNA表達(dá)的改善，UUO+TCM-M、UUO+Losartan均有較好效果，與UUO比較，有下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；在抑制FN mRNA表達(dá)方面UUO+TCM-M、UUO+TCM-H與UUO相比，均有改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；UUO+Losartan與UUO+TCM-H比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表1。

表1 Col1、FN mRNA 表達(dá)水平（±s）Tab.1 Col1 and FN mRNA expression levels（±s）

表1 Col1、FN mRNA 表達(dá)水平（±s）Tab.1 Col1 and FN mRNA expression levels（±s）

注：與Sham 比較，***P＜0.001；與 UUO 比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與 UUO+TCM-H 比較，△△△P＜0.001。

分組 動物數(shù) Col1 FN Sham 3 1.009±0.156 1.002±0.078 UUO 3 4.483±0.264*** 15.585±1.766***UUO+TCM-L 3 3.552±0.549## 2.987±0.136##UUO+TCM-M 3 2.543±0.135### 2.349±0.142##UUO+TCM-H 3 4.057±0.293 4.186±0.124##UUO+Losartan 3 1.846±0.239### 7.251±0.257#△△△

3.4 Western Blot檢測各組大鼠腎組織HIF-1α蛋白表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)以觀察中藥在HIF-1α蛋白在腎臟組織中的表達(dá)，不涉及療效觀察，故不設(shè)置UUO+Losartan。UUO術(shù)后大鼠的HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯升高，UUO大鼠對比Sham，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；同時芪參組對于HIF-1α蛋白表達(dá)水平的升高具有一定的抑制作用，UUO+TCM-M較UUO有明顯改變，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；UUO+TCM-H較UUO有一定改善，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 HIF-1α 蛋白表達(dá)水平（±s，n=3）Fig.3Hif-1α protein expression level（±s，n=3）

4 討論

腎纖維化是所有CKD的發(fā)展過程，腎臟疾病的進(jìn)展，本質(zhì)上是腎纖維化的一步步加重，直至最終腎臟萎縮，失去其應(yīng)有功能。腎纖維化過程中存在腎小球硬化、RIF、血管纖維化等方面的病理改變，RIF作為重要的一個環(huán)節(jié)存在著深入研究的價值。UUO模型，是通過結(jié)扎一側(cè)輸尿管引起尿路梗阻，造成腎臟結(jié)構(gòu)的進(jìn)行性破壞，出現(xiàn)RIF的模型。在嚙齒類動物中，UUO被認(rèn)為是研究非免疫性腎小管間質(zhì)纖維化機(jī)制最廣泛使用的模型[14]。其特點(diǎn)在于能夠快速的形成管狀萎縮和間質(zhì)纖維化，出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積[15]。能迅速形成與人類疾病相似的纖維化事件[16]，故本研究使用SD大鼠的UUO模型進(jìn)行RIF的研究。

在中醫(yī)理論研究中，RIF被歸為“癥瘕”的范疇[17]。葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中強(qiáng)調(diào)“大凡經(jīng)主氣，絡(luò)主血，久病血瘀”。說明瘀血是形成癥瘕的主要病機(jī)，治療時最宜補(bǔ)氣活血治之。就如唐容川《血證論》中強(qiáng)調(diào)：“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，則結(jié)為癥瘕……即虛人久積，不便攻治者，亦宜攻補(bǔ)兼施，以求克敵?！蹦I疏寧雖以“疏利三焦”法立方，但腎臟疾病患者久病血瘀，雖有癥瘕不便破血行氣，故應(yīng)當(dāng)攻補(bǔ)兼施，補(bǔ)氣活血。選用黃芪、丹參作為方中臣藥，黃芪益衛(wèi)固表，升陽舉陷，補(bǔ)養(yǎng)元?dú)狻⒛I氣；丹參活血祛瘀，安神寧心。作為腎疏寧方中祛瘀“重臣”，“黃芪-丹參”藥對長于補(bǔ)氣活血，兩藥配伍，消補(bǔ)結(jié)合，祛除腎臟癥瘕。為“黃芪-丹參”藥對治療RIF提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，UUO術(shù)后的大鼠出現(xiàn)了明顯的腎臟損傷，Masson染色提示腎臟組織中膠原纖維的產(chǎn)生，在Sham中可以看到少量膠原纖維出現(xiàn)在腎間質(zhì)，用于穩(wěn)定腎臟結(jié)構(gòu)，是正常的生理結(jié)構(gòu)。當(dāng)輸尿管梗阻術(shù)后大量的膠原纖維產(chǎn)生，出現(xiàn)在了腎間質(zhì)以及腎小球內(nèi)。通過膠原容積的計算發(fā)現(xiàn)，中藥組在術(shù)后減輕了纖維化的沉積。長期以來，慢性缺氧一直被認(rèn)為是各種類型慢性腎病的最終共同病理狀態(tài)。RIF造成了對腎小管周毛細(xì)血管的包圍與擠壓，血流的減少使得腎間質(zhì)周圍各類細(xì)胞出現(xiàn)了缺氧，在本次UUO模型中也檢測到了缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)，UUO對比Sham HIF-1α的表達(dá)明顯升高，同時越來越多的證據(jù)表明，HIF-1α是RIF的關(guān)鍵因素[18-20]。過表達(dá)的HIF-1α進(jìn)一步加重了纖維化的進(jìn)展[21]，并在臨床上展現(xiàn)了與慢性腎臟病的病情進(jìn)展的相關(guān)性[22]。有證據(jù)顯示，在纖維化過程中，HIF-1α可誘導(dǎo)纖維化標(biāo)志物（Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原）和轉(zhuǎn)分化標(biāo)志蛋白（波形蛋白、平滑肌動蛋白）的改變[23-24]。實(shí)驗(yàn)通過免疫組化觀察到，本應(yīng)在腎小球系膜區(qū)少量表達(dá)的α-SMA在UUO術(shù)后高表達(dá)，并且異常出現(xiàn)在了腎小管上皮細(xì)胞，提示了UUO術(shù)后腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化。說明了肌成纖維細(xì)胞的形成。同時利用PCR技術(shù)也檢測到了腎臟組織中Col1、FN出現(xiàn)了升高，作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)成成分，以上兩指標(biāo)的升高也提示了腎臟組織細(xì)胞外基質(zhì)的異常增多。

而在UUO大鼠接受“黃芪-丹參”藥物治療后，RIF情況得到改善。目前已有人對“黃芪-丹參”藥對在腎間質(zhì)纖維化的作用進(jìn)行了研究[25]，周萍等[26]同樣使用大鼠UUO模型進(jìn)行觀察，對成模大鼠進(jìn)行“黃芪-丹參”藥對顆粒劑溶液灌胃治療，治療后大鼠腎功能水平較UUO改善，并促進(jìn)了par-3蛋白表達(dá)，從而延緩腎間質(zhì)纖維化。而在本次研究中，結(jié)果顯示當(dāng)經(jīng)過“黃芪-丹參”治療后，膠原纖維沉積減少，說明了“黃芪-丹參”藥對在治療RIF方面的作用；藥物治療可能一定程度緩解了受損腎臟組織的缺氧情況，HIF-1α的表達(dá)較UUO出現(xiàn)下降，且下降趨勢明顯；細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的過表達(dá)得到抑制、表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)降低，證明了中藥在抑制腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化上的良好作用。綜上所述，“黃芪-丹參”藥對可能通過改善缺氧情況，下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的生成及減輕腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而延緩RIF的進(jìn)展。