王帥，閆海峰，賈壯壯，3，王琳，3，張澤宇，3，王慈，3，王賢良，毛靜遠(yuǎn)

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381；2．河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000；3．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

肺動(dòng)脈高壓（PH）以肺血管重構(gòu)、肺循環(huán)阻力增加和肺動(dòng)脈壓升高[靜息時(shí)平均肺動(dòng)脈壓≥25 mmHg（1 mm Hg≈0．133 kPa，下同）]為特征，可導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡[1]。全球受PH影響的患者多達(dá)1%，其中，65歲以上人群患病率在10%左右[2]。肺動(dòng)脈高壓患者1年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)約為15%，3年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)為30%[3]。治療PH的藥物大多以舒張血管和抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖為主，其價(jià)格較貴，臨床依賴(lài)性較強(qiáng)[4]，而中醫(yī)藥防治PH具有一定優(yōu)勢(shì)。天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院毛靜遠(yuǎn)教授根據(jù)多年臨床實(shí)踐，總結(jié)出治療PH的臨床有效經(jīng)驗(yàn)處方——宣肺化瘀通脈方，由丹參、紅花、山茱萸、桔梗、地龍5味中藥組成，具有宣肺化瘀、養(yǎng)陰通脈之效，但其藥效機(jī)制尚不明確。研究基于野百合堿（MCT）誘導(dǎo)的PH大鼠模型，探討宣肺化瘀通脈方對(duì)大鼠PH的改善作用及對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響，為治療PH提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量230～250 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)為SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，室內(nèi)溫度與相對(duì)濕度分別為20～25℃、40%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 宣肺化瘀通脈方組成為丹參、紅花、山茱萸、桔梗、地龍，中藥飲片由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供；根據(jù)體表面積劑量換算法，宣肺化瘀通脈方大鼠給藥低劑量組為6．75 g 生藥/kg，高劑量組為 13．5 g 生藥/kg；西地那非（25 mg/kg），由上海源葉生物科技有限公司提供，批號(hào)X23A8Y42189。

1.3 造模、分組及給藥 將70只SPF級(jí)雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（20只）和MCT組（50只）；MCT組單次腹腔注射MCT（60 mg/kg），誘導(dǎo)14 d建立肺動(dòng)脈高壓模型，造模過(guò)程中大鼠未出現(xiàn)死亡。第15天對(duì)照組、MCT組各隨機(jī)抽取10只，檢測(cè)大鼠平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）的變化。將造模成功后的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、西地那非組、宣肺化瘀通脈方低劑量組及經(jīng)驗(yàn)方高劑量組，每組10只。各用藥組均灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥14 d，對(duì)照及模型組給予等容積蒸餾水。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)及方法

1.4.1 一般情況觀(guān)察 觀(guān)察各組大鼠體質(zhì)量、食量、活動(dòng)量、毛發(fā)光澤程度以及對(duì)外周刺激反應(yīng)程度等一般情況。

1.4.2 PH大鼠右心室收縮壓（RVSP）、mPAP測(cè)定 采用1．5%三溴乙醇（0．8 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，切開(kāi)頸部右半側(cè)皮膚，然后剝離頸外靜脈，并結(jié)扎其遠(yuǎn)心端。用眼科剪朝心室方向剪出一個(gè)2～3 mm的V形開(kāi)口，插入導(dǎo)管，根據(jù)多導(dǎo)生理儀所示波形，判斷導(dǎo)管所在位置，檢測(cè)大鼠RVSP、mPAP的變化。

1.4.3 右心室肥厚指數(shù)（RVHI）測(cè)定 大鼠開(kāi)胸，剪開(kāi)右心耳，用50 mL注射器抽取預(yù)冷的生理鹽水，插入腹主動(dòng)脈，灌流沖洗心臟及肺血管中的血液，用濾紙吸凈心臟周?chē)乃郑厥议g隔分離左、右心室，分別稱(chēng)量右心室（RV）及左心室+室間隔（LV+S），計(jì)算RVHI=RV/（LV+S）

1.4.4 肺組織形態(tài)學(xué)變化 取大鼠相同部位的左肺中上葉，用生理鹽水漂洗固定于4%的多聚甲醛72 h，將標(biāo)本沿肺門(mén)做厚度為5 μm的石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀(guān)察各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4.5 氧化應(yīng)激水平測(cè)定 大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，低溫離心后取上層血清，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取3個(gè)血清樣本，根據(jù)相應(yīng)的試劑盒操作步驟分別檢測(cè)血清活性氧（ROS）、環(huán)氧合酶 1（COX-1）、環(huán)氧合酶 2（COX-2）的含量及過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26．0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若符合正態(tài)性分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布，多組間比較采用Kruskal-walis H檢驗(yàn)。P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 對(duì)照組大鼠體質(zhì)量逐日增加，飲食及活動(dòng)量正常，毛發(fā)光澤，對(duì)外周刺激反應(yīng)正常；與對(duì)照組比較，模型組大鼠活動(dòng)量與食量減少，對(duì)外周刺激反應(yīng)遲鈍，嗜睡倦臥，毛發(fā)枯燥少澤，呼吸頻率短促，口鼻及四肢發(fā)紺；西地那非組及宣肺化瘀通脈方各劑量組大鼠一般情況較模型組改善明顯。

2.2 宣肺化瘀通脈方對(duì)大鼠PH的影響 與對(duì)照組比較，模型組RVSP、mPAP、RVHI升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。與模型組比較，西地那非組、宣肺化瘀通脈方低、高劑量組mPAP、RVHI降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）；低劑量組RVSP降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；高劑量組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。與宣肺化瘀通脈方低劑量組比較，高劑量組RVSP、mPAP降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），見(jiàn)圖1。

圖1 宣肺化瘀通脈方對(duì)大鼠PH的影響Fig.1 Effect of Xuanfei Huayu Tongmai Decoction on PH in rats

2.3 宣肺化瘀通脈方對(duì)大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肺部動(dòng)脈管壁的結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肺部動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄明顯；各給藥組大鼠肺動(dòng)脈管壁厚度、血管腔狹窄程度比模型組得到改善，宣肺化瘀通脈方可顯著改善MCT誘導(dǎo)PH大鼠的肺部動(dòng)脈管壁厚度、改善血管狹窄程度，見(jiàn)圖2。

圖2 宣肺化瘀通脈方對(duì)PH大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響（×40）Fig.2 Effect of Xuanfei Huayu Dongmai Decoction on histomorphology of PH rats(×40)

2.4 宣肺化瘀通脈方對(duì)各組大鼠氧化應(yīng)激水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組ROS含量升高，CAT活性下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），COX-1、COX-2含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，西地那非組ROS含量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CAT活性、COX-1及COX-2含量上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；宣肺化瘀通脈方高劑量組ROS含量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），CAT活性上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），COX-1、COX-2含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。與宣肺化瘀通脈方低劑量組比較，高劑量組可降低ROS含量、上調(diào)CAT活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 宣肺化瘀通脈方對(duì)各組大鼠氧化應(yīng)激水平的影響Fig.3 Effect of Xuanfei Huayu Tongmai Decoction on oxidative stress level of rats in each group

3 討論

中醫(yī)沒(méi)有明確記載PH的病名，根據(jù)中醫(yī)運(yùn)用理法方藥對(duì)類(lèi)似癥狀、疾病預(yù)后的記載及胸悶、氣促、乏力、呼吸困難等臨床表現(xiàn)，多將其歸屬為“喘證”“肺脹”“咳嗽”等范疇，大多以“肺脹”立論?！鹅`樞·脹論》曰：“肺脹者，虛滿(mǎn)而喘咳?！薄端貑?wèn)·大奇論》曰：“肺之壅，喘而兩脅滿(mǎn)?！薄兜は姆āた人浴份d“肺脹而咳，或左或右不得眠，此痰夾瘀血礙氣而為病?！盤(pán)H基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，本虛以氣虛為主，肺氣虛是其根本。標(biāo)實(shí)以痰濁、水飲、血瘀等為主；其中，痰濁、血瘀為PH發(fā)展的主要病理產(chǎn)物，易阻塞肺絡(luò)，引起氣血運(yùn)行不暢，肺循環(huán)受阻，導(dǎo)致肺絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)改變，表現(xiàn)出血管痙攣、收縮、重構(gòu)的特征。天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院毛靜遠(yuǎn)教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出治療PH宣肺化瘀通脈方，由丹參、紅花、山茱萸、桔梗、地龍5味藥組成，其中丹參活血祛瘀，紅花活血通經(jīng)，桔梗宣肺祛痰，山茱萸補(bǔ)益肝腎，地龍通絡(luò)平喘，諸藥共奏宣肺化瘀、養(yǎng)陰通脈之效，可有效改善PH患者的臨床癥狀。

氧化應(yīng)激是PH進(jìn)程中的關(guān)鍵因素，患有PH的人類(lèi)和動(dòng)物的肺組織中各氧化應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)發(fā)生了不同程度變化[5-8]。細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成與清除之間不平衡，ROS的數(shù)量超過(guò)生物系統(tǒng)可以對(duì)抗和中和的數(shù)量時(shí)，就會(huì)引起氧化應(yīng)激損傷[9]。ROS蓄積過(guò)多可激活/抑制一系列信號(hào)通路，進(jìn)而引起內(nèi)皮功能障礙、肺血管收縮及重構(gòu)，造成肺部血管管腔狹窄，阻力增加，肺動(dòng)脈壓進(jìn)行性升高，并且增加右心室后負(fù)荷，最終可導(dǎo)致右心室衰竭[10]。CAT屬于酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，可催化過(guò)氧化氫（H2O2）為氧和水，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能完整性。抑制氧化應(yīng)激水平可下調(diào)肺平滑肌細(xì)胞增殖程度，改善PH肺血管重塑[11]。

宣肺化瘀通脈方中丹參包含的化合物主要包括二萜類(lèi)和酚酸類(lèi)，研究表明丹酚酸A、丹酚酸B、丹參酮IIA具有較強(qiáng)的抗氧化活性[12-14]。紅花的主要成分包括紅花色素類(lèi)、紅花苷類(lèi)，可以上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）活性、抑制丙二醛（MDA）及ROS積累，改善氧化應(yīng)激損傷[15]，尤其是紅花中的黃酮類(lèi)成分對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)具有良好的調(diào)控作用[16]，可通過(guò)下調(diào)一氧化氮合酶（iNOS）及COX-2基因表達(dá)，抑制一氧化碳（NO）產(chǎn)生及炎癥反應(yīng)水平[17-18]。山茱萸可增加SOD、CAT和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）的活性[19-20]。莫羅忍冬苷是山茱萸的重要活性成分，可通過(guò)調(diào)控核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路調(diào)控COX-2表達(dá)[21]。地龍主要含蚯蚓解熱堿、蚯蚓素、蚯蚓毒素、琥珀酸等，具有抗炎、抗血栓、降壓、改善氣道重構(gòu)、抗肺纖維化及免疫調(diào)節(jié)等作用。桔梗及其組分可通過(guò)調(diào)控ROS相關(guān)信號(hào)通路抑制慢性氣道炎癥及氧化應(yīng)激損傷，降低肺泡隔厚度，改善心肺的多種病理變化[22-24]。

本研究采用宣肺化瘀通脈方干預(yù)MCT誘導(dǎo)的大鼠PH模型，結(jié)果表明宣肺化瘀通脈方可有效降低PH大鼠mPAP、RVSP、RVHI水平，減輕肺動(dòng)脈管壁厚度、血管腔狹窄程度，改善肺組織病理學(xué)變化，降低PH大鼠血清ROS含量，上調(diào)COX-1、COX-2表達(dá)水平，升高CAT活性，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，為PH的臨床治療提供了新的思路及數(shù)據(jù)支持。