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        響應(yīng)面法優(yōu)化黑皮雞樅總黃酮提取工藝

        2022-11-07 13:50:56張晨趙金嚴(yán)俊杰苗人云林俊彬李翔周向榮張攀甘炳成
        中國(guó)調(diào)味品 2022年11期
        關(guān)鍵詞:黃酮因素影響

        張晨,趙金,嚴(yán)俊杰,苗人云,林俊彬,李翔,周向榮,張攀,甘炳成*

        (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所,成都 610213;2.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,成都 610106;3.成都農(nóng)業(yè)科技中心,成都 610213;4.金堂縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備產(chǎn)業(yè)園管理委員會(huì),成都 610407;5.四川田嶺澗生物科技發(fā)展有限公司,成都 610400)

        黑皮雞樅(Oudemansiellaraphanipes)又名卵孢小奧德蘑、長(zhǎng)根菇,是一種適合工廠化栽培的高端珍稀食用菌[1-4]。黑皮雞樅香味濃郁、口感鮮嫩,不僅富含人體所需的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸,還含有多糖[5-7]、黃酮[8]等多種活性成分,而且具有極高的食用和藥用價(jià)值。目前,黑皮雞樅主要是以鮮品食用為主,包括炒菜、煲湯等,其子實(shí)體含有多種鮮味氨基酸、5′-核苷酸,具有成為天然健康型調(diào)味品原料的潛能[9]。

        黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于各種食用菌中,具有抑菌、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗過(guò)敏等功效[10-13],因而受到研究者及健康產(chǎn)品開(kāi)發(fā)人員的廣泛關(guān)注。然而,目前關(guān)于黑皮雞樅中黃酮的提取工藝研究較少且提取效率較低?;诖耍驹囼?yàn)擬采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化,利用超聲波輔助乙醇法探索從黑皮雞樅中提取總黃酮的工藝條件,以期獲得一種操作簡(jiǎn)單、提取率高的總黃酮提取工藝,為黑皮雞樅總黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        黑皮雞樅子實(shí)體:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所栽培基地;蘆丁:北京索萊寶科技有限公司;無(wú)水乙醇:成都市科隆化學(xué)品有限公司;亞硝酸鈉、氫氧化鈉、九水硝酸鋁:上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

        WP-UP-LH-20S理化分析型超純水機(jī) 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司;WGLL-125BE電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW177中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;TX323L電子天平 島津菲律賓制造有限公司;FlexA-200酶標(biāo)儀 杭州奧盛儀器有限公司;SB25-12DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 黃酮提取工藝

        黑皮雞樅子實(shí)體→烘干→粉碎→過(guò)篩(40目篩)→黑皮雞樅粉末→稱量→加入提取溶劑→超聲輔助提取→過(guò)濾→定容→測(cè)定黃酮。

        1.2.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

        以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品,參考孫瓊[14]的方法進(jìn)行黃酮的測(cè)定。以蘆丁對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度(OD)值為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0016x-0.0031,相關(guān)系數(shù)R2=0.9929。

        1.2.3 黑皮雞樅總黃酮含量的測(cè)定

        準(zhǔn)確稱取1.00 g黑皮雞樅粉末,在一定體積、濃度的乙醇溶液基礎(chǔ)上,添加一定料液比的蒸餾水。通過(guò)功率300 W的超聲波處理,按照不同的超聲時(shí)間、超聲溫度提取黑皮雞樅總黃酮,過(guò)濾后收集提取液,定容至50 mL,搖勻,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。移取2 μL溶液至96孔板中,按照孫瓊的方法測(cè)定其吸光度,計(jì)算黑皮雞樅總黃酮的提取率,公式如下:

        W=C×V/1000m×100%。

        式中:W為黑皮雞樅菌總黃酮提取率(mg/g);C為提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度(μg/mL);V為供試總黃酮樣品液體積(mL);m為黑皮雞樅粉末質(zhì)量(g)。

        1.2.4 單因素試驗(yàn)

        在1.2.1的提取工藝下,準(zhǔn)確稱取黑皮雞樅粉末1.00 g,將黑皮雞樅總黃酮提取率作為指標(biāo),通過(guò)單因素試驗(yàn)探究乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)、超聲時(shí)間(30,60,90,120,150 min)、超聲溫度(40,50,60,70,80 ℃)4個(gè)因素對(duì)黑皮雞樅菌總黃酮提取率的影響,并篩選出各因素的最適范圍,為響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)做好水平選取,每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.2.5 黑皮雞樅總黃酮提取工藝優(yōu)化

        采用Design Expert 8.0.6.1軟件,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),對(duì)黑皮雞樅總黃酮的提取率進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),因素水平見(jiàn)表1。

        表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        每組試驗(yàn)處理重復(fù)3次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Excel 2020、Design Expert 8.0.6.1和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 不同乙醇濃度對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        由圖1可知,為探究不同乙醇濃度對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響,選擇50%~90%乙醇濃度進(jìn)行試驗(yàn)。乙醇濃度從70%增加到80%時(shí),提取率顯著提高,從2.28 mg/g提高到3.69 mg/g,可能是由于黑皮雞樅總黃酮的極性與乙醇極性接近[15]。但當(dāng)乙醇濃度超過(guò)80%時(shí),黑皮雞樅總黃酮提取率呈現(xiàn)降低趨勢(shì),可能是因?yàn)楹谄るu樅中其他醇溶性雜質(zhì)浸出的比例升高,降低了黃酮的溶解[16]。因此,選擇乙醇濃度為80%。

        圖1 乙醇濃度對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        2.1.2 不同液料比對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        由圖2可知,液料比對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響先增加后減小。當(dāng)液料比在20∶1~40∶1 (mL/g)的范圍內(nèi)時(shí),黑皮雞樅總黃酮提取率顯著上升,這可能是接觸面積增加產(chǎn)生的結(jié)果。當(dāng)液料比為40∶1~60∶1 (mL/g)時(shí),黑皮雞樅總黃酮提取率緩慢下降,因?yàn)楹谄るu樅總黃酮溶出完全,且可能會(huì)造成其他雜質(zhì)的溶出,抑制了總黃酮的提取[17]。因此,選擇液料比為40∶1 (mL/g)。

        圖2 液料比對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        2.1.3 不同超聲時(shí)間對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        由圖3可知,超聲時(shí)間對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響先增加后減少。因?yàn)槌晻r(shí)間增加會(huì)導(dǎo)致黑皮雞樅的細(xì)胞膜破壞程度增大,細(xì)胞膜內(nèi)外會(huì)形成梯度差,有利于總黃酮類(lèi)物質(zhì)向乙醇溶液中擴(kuò)散,因此提取率會(huì)增加[18]。當(dāng)超聲時(shí)間為120 min時(shí),黑皮雞樅中提取的總黃酮含量達(dá)到最大值4.08 mg/g。當(dāng)超聲時(shí)間高于120 min時(shí),黃酮具有的酚羥基會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致總黃酮提取率下降[19]。因此,選擇超聲時(shí)間為120 min。

        圖3 超聲時(shí)間對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        2.1.4 不同超聲溫度對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        由圖4可知,超聲溫度對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響較為明顯。當(dāng)超聲溫度在40~70 ℃范圍內(nèi)時(shí),由于超聲溫度顯著增加,小分子間流動(dòng)加快,有利于黑皮雞樅總黃酮的溶出。當(dāng)超聲溫度在70~80 ℃范圍內(nèi)時(shí),黑皮雞樅的總黃酮溶出急劇減少。這可能是由于乙醇本身易揮發(fā),溫度過(guò)高,黑皮雞樅總黃酮發(fā)生氧化分解,同時(shí)乙醇濃度加速降低,導(dǎo)致提取率陡然下降[20]。因此,選擇超聲溫度為70 ℃。

        圖4 超聲溫度對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響

        2.2 黑皮雞樅菌總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)

        2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

        以總黃酮提取率為響應(yīng)值,使用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

        根據(jù)Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。4個(gè)因素的編碼值二次回歸方程為:Y=4.82+0.45A+0.33B-0.17C-0.10D-7.500E-003AB-2.500E-003AC+0.14AD+0.21BC+0.20BD-0.28CD-0.99A2-0.64B2-0.56C2-0.34D2。

        2.2.2 響應(yīng)面回歸模型方差分析

        通過(guò)Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 回歸模型方差分析

        由表3可知,模型的P值<0.0001,表明模型顯著。失擬項(xiàng)的P值=0.0550>0.05(不顯著),說(shuō)明該模型誤差小。R2=0.9070,RAdj2=0.8141,說(shuō)明模型擬合度較高,有18.59%的情況該模型無(wú)法解釋[21-23]。其中A、A2、B2、C2高度顯著地影響黑皮雞樅總黃酮提取率(P<0.0001);B極顯著地影響黑皮雞樅總黃酮提取率(P<0.01);D2顯著地影響黑皮雞樅總黃酮提取率(P<0.05);其余因素對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響不顯著。根據(jù)F值與P值的大小分析,試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)總黃酮提取率的影響大小為A(乙醇濃度)>B(液料比)>C(超聲時(shí)間)>D(超聲溫度)。

        2.2.3 響應(yīng)面分析

        為考察各因素交互作用對(duì)黑皮雞樅總黃酮提取率的影響,采用Design Expert 8.0.6.1軟件繪制響應(yīng)面圖,見(jiàn)圖5。響應(yīng)面平面圖中,若等高線為圓形,則兩因素之間的交互作用較弱;若等高線為橢圓形,則兩因素之間的交互作用較強(qiáng)[24]。

        圖5 各因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線

        由圖5可知,黑皮雞樅總黃酮提取率的優(yōu)化工藝條件中各因素等高線趨于圓形,結(jié)合模型方差分析結(jié)果,各因素的交互作用相對(duì)較弱(P>0.05)[25]。

        2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

        根據(jù)上述分析,發(fā)現(xiàn)各因素間的響應(yīng)面和等高線與回歸方程分析結(jié)果吻合,根據(jù)Design Expert軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果,得到黑皮雞樅總黃酮最優(yōu)提取參數(shù)。結(jié)果顯示:乙醇濃度82.30%、液料比42.44∶1、超聲時(shí)間116.68 min、超聲溫度70.15 ℃時(shí),黑皮雞樅總黃酮提取率預(yù)測(cè)值為4.91767 mg/g。結(jié)合理論預(yù)測(cè)和實(shí)際應(yīng)用,優(yōu)化結(jié)果表明,以82%乙醇為溶劑,42∶1 (mL/g)液料比處理117 min,超聲輔助提取總黃酮,重復(fù)3次試驗(yàn),黑皮雞樅總黃酮提取率平均值為4.89 mg/g。利用選定的最優(yōu)條件檢驗(yàn)?zāi)P头匠填A(yù)測(cè)最優(yōu)響應(yīng)值的適用性,結(jié)果吻合度較高,表明該優(yōu)化工藝具有穩(wěn)定性和可行性。

        3 結(jié)論

        本研究采用超聲輔助乙醇法,以最大限度地提高黑皮雞樅中總黃酮的提取率。通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì),對(duì)乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間和超聲溫度4個(gè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,得到最佳提取條件:乙醇濃度82%,液料比42∶1 (mL/g),超聲時(shí)間117 min,超聲溫度70 ℃。此條件下黑皮雞樅總黃酮提取率達(dá)到4.89 mg/g。該方法的黃酮提取量高且方法簡(jiǎn)單,為黑皮雞樅黃酮在食藥用品、功能性調(diào)味品方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),提高了黑皮雞樅的附加價(jià)值。

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