尹忞強(qiáng)，焦宇知，黃露怡，袁華平，田青*

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223001；2.昆山市計(jì)量測(cè)試所，江蘇 昆山 215300)

根據(jù)參考文獻(xiàn)，肉制品最早源于古巴比倫和中國(guó)，已有3500年的歷史。不同地域地理環(huán)境、氣候條件、宗教、經(jīng)濟(jì)、飲食習(xí)慣等因素的差異，使各地形成許多不同形狀、質(zhì)地、外觀和具有獨(dú)特風(fēng)味的肉制品[1]。千百年來(lái)，傳統(tǒng)肉類發(fā)酵過(guò)程中微生物的作用機(jī)制并沒(méi)有被充分了解，而這些作用機(jī)制與不同發(fā)酵肉類產(chǎn)品的各種質(zhì)量屬性直接相關(guān)。自19世紀(jì)中葉以來(lái)，細(xì)菌、酵母菌及霉菌在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的重要作用逐漸被人們所了解，促使產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程更加可控和高效[2]。國(guó)內(nèi)著名的浙江金華火腿、江蘇如皋火腿、哈爾濱紅腸、廣東和湖南等地的臘肉和臘腸、貴州及江西一帶的酸肉、上海的咸肉等因其具有誘人的色澤、獨(dú)特的風(fēng)味和造型等特點(diǎn)深受當(dāng)?shù)叵M(fèi)者的喜愛(ài)[3]，正是由于發(fā)酵給肉制品帶來(lái)誘人感官、獨(dú)特風(fēng)味及豐富營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)，發(fā)酵肉制品在國(guó)內(nèi)的研究熱度和消費(fèi)者喜愛(ài)程度越來(lái)越高。

近年來(lái)，發(fā)酵肉制品中常用的發(fā)酵劑包括乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌屬、霉菌等[4]。乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)及過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、凝固酶陰性的葡萄球菌(coagulase negative Staphylococci, CNS)是最活躍的微生物發(fā)酵劑[5]。微生物發(fā)酵劑產(chǎn)酸較高和快速促使香腸水分活度(Aw)下降的能力有利于縮短香腸發(fā)酵成熟周期，抑制香腸中腐敗及致病微生物生長(zhǎng)繁殖，提高香腸衛(wèi)生品質(zhì)，也可促進(jìn)亞硝酸鹽與肌紅蛋白結(jié)合形成亞硝肌紅蛋白，提高香腸紅度色澤，分解蛋白形成低閾值、良好風(fēng)味的揮發(fā)性化合物[6]。本研究的目的是以腐生葡萄球菌CGMCC 3475和植物乳桿菌CGMCC 18217復(fù)配研究肌原纖維蛋白降解對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響，對(duì)改善發(fā)酵香腸風(fēng)味和品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)改進(jìn)發(fā)酵香腸生產(chǎn)與發(fā)展具有重要的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

腐生葡萄球菌CGMCC 3475菌株、植物乳桿菌CGMCC 18217菌株：由揚(yáng)州大學(xué)篩選及鑒定保藏；豬背部肌、豬肥膘、香辛料：揚(yáng)州歐尚超市；鹽漬腸衣：江蘇省如皋市壩新腸衣公司。

1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基：青島海博生物有限公司；葡萄糖、磷酸二氫鈉二水、磷酸氫二鈉十二水、SDS、β-巰基乙醇、甘油、穩(wěn)定型Lowry法試劑盒等：生工生物工程(上海)股份有限公司；亮氨酸(食品級(jí))：浙江一諾生物科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司；WFZ UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；手持式CR-400色差儀 日本Konica Minolta公司；手持式Testo 205 pH計(jì) 德圖Testo公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將1%的腐生葡萄球菌CGMCC 3475菌株和植物乳桿菌CGMCC 18217菌株的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2次。

1.4.2 發(fā)酵香腸制作及處理組制備

每1 kg豬肉按肥∶瘦為3∶7混合，加7%糖、3%鹽、0.2%味精、0.1%五香粉、0.15%生姜粉、20 mL/kg大曲，菌株接種量為107CFU/g，斬拌、混料均勻后灌腸，最后發(fā)酵28 d，發(fā)酵條件為自然風(fēng)干。3組香腸取樣時(shí)間分別是0，7，14，21，28 d，每次每組各取樣50.0 g。

1.4.3 發(fā)酵香腸處理組設(shè)置

第1組：香腸不接菌(CK組)；第2組：香腸接腐生葡萄球菌CGMCC 3475(L組)；第3組：香腸接腐生葡萄球菌CGMCC 3475∶植物乳桿菌CGMCC 18217為1∶1(LS組)。

1.4.4 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味測(cè)定

香腸樣品10.0 g除去腸衣并切碎置于250 mL錐形瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL(取0.02 g的辛酸甲酯用甲醇溶液稀釋至10-2)，在60 ℃水浴鍋預(yù)熱5 min后插入SPME萃取頭吸附40 min，然后在氣質(zhì)聯(lián)用儀的氣相色譜進(jìn)樣口解吸5 min，用于進(jìn)一步檢測(cè)。

檢測(cè)條件：氣相條件：非極性柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純氮?dú)?99.999%)，恒流且流量為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。輔助載氣為高純氫氣(99.999%)，檢測(cè)器溫度280 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃。初始溫度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至10 ℃，保持8 min，再以8 ℃/min升溫至240 ℃，保持5 min；質(zhì)譜條件：離子化方式為EI+，電子能量70 eV，掃描時(shí)間0.2 s，檢測(cè)器電壓500 V，掃描范圍30～500 m/z。

1.4.5 發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)測(cè)定

發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)測(cè)定參考劉浩等[7]的方法。將香腸樣品切成1 cm3的正方體，質(zhì)構(gòu)儀感應(yīng)源1000 N，初始力0.3 N，壓縮比60%，測(cè)定前速度2 mm/min，測(cè)定中速度2 mm/min，測(cè)定后速度1 mm/min，循環(huán)2次，測(cè)定指標(biāo)有硬度(N)、彈性(mm)、咀嚼性(mJ)、黏附性(mJ)。

1.4.6 發(fā)酵香腸感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)參考曹辰辰等[8]的方法。感官評(píng)價(jià)人員由10名食品專業(yè)的研究生組成(5男5女)，具體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。此過(guò)程香腸切片厚度為0.3 cm，樣本采用三位數(shù)編號(hào)，香腸提供順序隨機(jī)。

表1 發(fā)酵香腸感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

續(xù) 表

1.4.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016，圖表的繪制采用Origin 2018。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0，顯著性差異的分析選擇Duncan法進(jìn)行多重比較，并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 香腸發(fā)酵過(guò)程中pH的變化

發(fā)酵過(guò)程中微生物分解乳糖生成乳酸降低pH是香腸發(fā)酵必不可少的步驟，低pH能抑制不良微生物的生長(zhǎng)，降低蛋白質(zhì)的持水能力，從而降低水分活度，增加發(fā)酵香腸紅度值，確保干燥過(guò)程。發(fā)酵過(guò)程中香腸的pH變化見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵香腸pH的變化

由圖1可知，發(fā)酵起始，各處理組的pH在5.94～5.96之間，差異不顯著(P>0.05)，香腸發(fā)酵28 d后，各處理組的pH逐漸下降至最小值5.02，4.93，4.85，且LS組與L組和CK組有明顯差異，可能是由于植物乳桿菌CGMCC 18217和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的生長(zhǎng)和代謝形成的有機(jī)酸累積導(dǎo)致pH的下降，其他研究也發(fā)現(xiàn)接菌香腸由于LAB發(fā)酵劑具有很強(qiáng)的酸化活性，因此顯示出最低的pH值[9]。

2.2 香腸發(fā)酵過(guò)程中色澤的變化

顏色對(duì)發(fā)酵香腸的成熟度起著重要的作用。在發(fā)酵成熟過(guò)程中，發(fā)酵香腸的L*、a*和b*的內(nèi)部顏色變化見(jiàn)表2，所有的樣品均表現(xiàn)出發(fā)酵香腸的典型顏色特征。

表2 發(fā)酵香腸L*、a*、b*值

由表2可知，發(fā)酵過(guò)程中亮度值(L*)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，各處理組受發(fā)酵時(shí)間的影響顯著(P<0.05)，數(shù)值從49下降到31。Casaburi等[10]也發(fā)現(xiàn)香腸的L*值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。同樣，Kayaardi等[11]發(fā)現(xiàn)sucuk香腸的L*值普遍在成熟過(guò)程的15 d內(nèi)下降，L*的降低是由于水分的流失而形成深色。從各處理組看，發(fā)酵28 d時(shí)，接菌處理組L和LS的L*顯著低于對(duì)照組CK(P<0.05)。

在成熟期間，紅度值(a*)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，0～7 d輕微下降(P<0.05)，14 d時(shí)開(kāi)始上升。而a*值的降低可能是亞硝基紅蛋白因?yàn)槿樗岬漠a(chǎn)生發(fā)生變性[12]。該結(jié)果與Ge等[13]的研究結(jié)果相一致，在探究植物乳桿菌NJAU-01對(duì)發(fā)酵香腸品質(zhì)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)a*值先下降后上升。從各處理組看，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，接菌組L和LS的a*值顯著高于對(duì)照組CK(P<0.05)。

在成熟期間，黃度值(b*)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，各處理組受發(fā)酵時(shí)間的影響顯著(P<0.05)，數(shù)值從16下降到5。b*值的降低表明香腸的顏色趨于藍(lán)色，而不是變成黃色。這可能是由于褐變反應(yīng)產(chǎn)生具有褐色的黑色素。西班牙的干腌香腸的b*在發(fā)酵和成熟階段呈下降趨勢(shì)[14]，b*值的下降是由于微生物消耗氧氣，導(dǎo)致氧合肌紅蛋白減少，而氧合肌紅蛋白是呈黃色的重要組成部分。從各處理組看，發(fā)酵10 d后，接菌組LS的b*值與顯著低于對(duì)照組CK(P<0.05)。

2.3 香腸發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)的變化

質(zhì)構(gòu)(TPA)是發(fā)酵香腸感官品質(zhì)最重要的指標(biāo)之一。硬度是指第一個(gè)壓縮循環(huán)中的峰值力，單位為N。受發(fā)酵時(shí)間的影響，香腸的硬度值顯著增加(P<0.05)。

由表3可知，在發(fā)酵0 d時(shí)各組間硬度差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵的28 d，接菌組L、LS的香腸硬度顯著高于對(duì)照組CK(P<0.05)，主要是由于pH值的降低會(huì)逐漸誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的聚集，從而形成有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，增加硬度[15]。

表3 發(fā)酵香腸質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

黏附性是指第一次壓縮曲線達(dá)到零點(diǎn)到第二次壓縮曲線開(kāi)始之間的曲線負(fù)面積，反映探頭由于測(cè)試樣品的黏著作用所消耗的功，單位為mJ。在發(fā)酵過(guò)程中以0 d的黏附性最大；7 d時(shí)黏附性最??；14～21 d黏附性顯著增加(P<0.05)；在28 d時(shí)，黏附性又減小。從各個(gè)處理組看，發(fā)酵28 d時(shí)，所有接菌組的黏附性均顯著高于對(duì)照組CK(P<0.05)，接菌組L和LS的黏附性顯著高于對(duì)照組CK(P<0.05)。

彈性是指食物在第一次咬合結(jié)束到第二次咬合開(kāi)始之間恢復(fù)的高度。從發(fā)酵時(shí)間上看，14 d時(shí)各處理組彈性顯著增加(P<0.05)，發(fā)酵的21 d和28 d彈性保持不變。從各處理組看，添加發(fā)酵劑并沒(méi)有影響彈性變化(P>0.05)。

咀嚼性是硬度和膠黏性的乘積，單位為mJ。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，由于咀嚼性的變化不僅受硬度的影響也與水分活度呈負(fù)相關(guān)，各處理組的咀嚼性顯著增加(P<0.05)。從處理組看，發(fā)酵28 d時(shí)，接菌組LS和L的咀嚼性要顯著低于對(duì)照組CK(P<0.05)，可能是由于菌株對(duì)蛋白水解的作用減小了咀嚼性。

2.4 發(fā)酵香腸肌原纖維蛋白變化

0，7，14，21，28 d發(fā)酵過(guò)程中肌原纖維蛋白有輕微的降解，見(jiàn)圖2中(a)～(e)。

圖2 發(fā)酵香腸肌原纖維蛋白變化

由圖2可知，在10～28 kDa處條帶強(qiáng)度略有增加，此外，在發(fā)酵的第7天和第14天發(fā)生明顯的蛋白氧化現(xiàn)象，造成肌球蛋白重鏈的消失，而肌動(dòng)蛋白在氧化的情況下條帶強(qiáng)度變化程度較小。接菌組并沒(méi)有在濃縮膠頂部出現(xiàn)明顯的高分子蛋白聚集體即蛋白氧化現(xiàn)象，腐生葡萄球菌CGMCC 3475和植物乳桿菌CGMCC 18217在發(fā)酵的第4天蛋白降解顯著，復(fù)配菌株則是在發(fā)酵的第2 天，220，95，45 kDa等主要條帶蛋白降解程度明顯強(qiáng)于其他處理組，發(fā)現(xiàn)復(fù)配菌株在香腸發(fā)酵結(jié)束后蛋白水解程度更為強(qiáng)烈。

2.5 發(fā)酵香腸風(fēng)味物質(zhì)分析

對(duì)發(fā)酵28 d后的香腸進(jìn)行揮發(fā)性化合物的鑒定，見(jiàn)表4。

表4 發(fā)酵28 d時(shí)香腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類

由表4可知，對(duì)照組中CK檢測(cè)到17 種化合物，接菌LS組檢測(cè)到20 種化合物，說(shuō)明接種腐生葡萄球菌CGMCC 3475及植物乳桿菌CGMCC 18217和腐生葡萄球菌CGMCC 3475的復(fù)配菌株影響了揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生。

由圖3和表5可知，3組之間檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)種類差異顯著，含量也有明顯差異，在對(duì)照和接菌的香腸中共鑒定出28 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酯類14種、醛類3種、氨類1種、醇類1種、烷烴類3種、烯烴類3種、酮類1種和其他化合物2種。這些揮發(fā)性化合物主要來(lái)源于脂質(zhì)氧化、氨基酸分解代謝、碳水化合物發(fā)酵、微生物活動(dòng)和香辛料。

圖3 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖和風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

表5 發(fā)酵香腸揮發(fā)性物質(zhì)含量

2.6 發(fā)酵香腸的感官評(píng)價(jià)

由表6可知，香腸形態(tài)方面，接菌組的差異不顯著(P>0.05)，接菌組L、LS的色澤要顯著高于對(duì)照組CK(P<0.05)，而接菌組與對(duì)照組的形態(tài)評(píng)分無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在香腸香味評(píng)分結(jié)果中，接菌組L、LS表現(xiàn)出良好的風(fēng)味，顯著高于對(duì)照組CK(P<0.05)。根據(jù)滋味評(píng)分可以得到，接菌組L、LS的滋味顯著優(yōu)于對(duì)照組CK(P<0.05)。對(duì)照組的感官評(píng)分低于接菌組，可能是接菌可以促進(jìn)水解蛋白質(zhì)和油脂，產(chǎn)生肽、游離氨基酸和游離脂肪酸，這些都是發(fā)酵風(fēng)味和滋味所必需的。添加菌株發(fā)酵劑可顯著提高香腸的感官品質(zhì)，尤其是復(fù)配菌株LS不僅產(chǎn)生更高含量特征性風(fēng)味，并且在色澤、香味和滋味的評(píng)價(jià)上優(yōu)于其他處理組。

表6 發(fā)酵香腸的感官評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

本文研究的目的是將腐生葡萄球菌CGMCC 3475單菌株以及腐生葡萄球菌CGMCC 3475和植物乳桿菌CGMCC 18217復(fù)配菌株運(yùn)用于發(fā)酵香腸中，探究添加發(fā)酵劑對(duì)發(fā)酵香腸品質(zhì)和風(fēng)味的影響。研究發(fā)現(xiàn)，接菌組香腸的硬度、彈性、黏附性、L*值、a*值、乳酸菌和葡萄球菌菌落數(shù)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)都有所增加，香腸的感官品質(zhì)明顯改善，pH值、Aw和b*值降低。復(fù)配菌株LS組在產(chǎn)生特征性風(fēng)味物質(zhì)酯類、醛類物質(zhì)含量和感官評(píng)價(jià)中起到明顯的促進(jìn)作用。說(shuō)明添加菌株及復(fù)配菌株對(duì)發(fā)酵香腸的風(fēng)味、色澤、質(zhì)地起到促進(jìn)作用，可以改善香腸的品質(zhì)及風(fēng)味。