何琪，董怡，鄧莎，向燕，何培君，何強

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

兔肉是一種健康又經(jīng)濟的肉類，含有豐富的多不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、必需氨基酸等營養(yǎng)成分，蛋白質(zhì)含量高達70%，具有低脂肪、低熱量、低膽固醇的特點[1-2]?；谝陨蟽?yōu)點，兔肉產(chǎn)品在近十年來得到了迅速的發(fā)展，受到消費者的青睞。

腌制是肉類及肉制品加工和保鮮中廣泛使用的一種方法，具有提高肉質(zhì)風味、嫩化等作用[3]。NaCl是腌制肉的基礎(chǔ)用料，能夠賦予肉制品更好的口感；提高肉制品的保藏性。在肉制品中添加鹽還可以提高肉的保水能力，提高肉制品的風味，抑制有害微生物的生長和繁殖[4]。然而，在腌制過程中還會發(fā)生氧化和蛋白質(zhì)變性等化學反應(yīng)，肉品腌制過程中發(fā)生的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)是導致肉及肉制品劣變的主要非微生物因素[5]。兔肉因富含不飽和脂肪酸容易發(fā)生氧化反應(yīng)，添加NaCl也會促進脂肪氧化，脂質(zhì)氧化的次級產(chǎn)物進一步與蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸發(fā)生反應(yīng)，促進蛋白質(zhì)氧化，從而破壞其功能特性，肉制品的營養(yǎng)價值降低[6]。

兔肉的氧化程度會影響其保質(zhì)期，并受兔肉的內(nèi)在性質(zhì)和外部因素的影響。在肉制品生產(chǎn)加工過程中，絞碎、腌制、烹飪等步驟會促使活性氧(ROS)的產(chǎn)生，ROS能夠攻擊蛋白質(zhì)發(fā)生一系列鏈式反應(yīng)，從而誘導蛋白質(zhì)氧化,修飾其骨架和側(cè)鏈，導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變[7]。肉制品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變會影響氨基酸的利用率，較溫和的氧化過程使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，蛋白水解酶可以與底物結(jié)合，然而嚴重的氧化過程會使蛋白質(zhì)聚合，結(jié)構(gòu)更加緊密，從而導致結(jié)合位點的改變，降低蛋白水解酶的作用效果[8]。蛋白質(zhì)氧化會影響肉制品的質(zhì)地、口感、風味、可接受度和營養(yǎng)價值，因此控制好蛋白質(zhì)氧化程度才能讓產(chǎn)品質(zhì)量保持在較好的水平。

目前關(guān)于兔肉蛋白質(zhì)氧化與NaCl之間的關(guān)系研究較少，本實驗以兔肉作為研究對象，通過添加不同質(zhì)量濃度的NaCl對兔肉進行腌制處理，進一步探究NaCl對腌制過程中兔肉蛋白質(zhì)氧化的影響，為提高腌制兔肉的品質(zhì)、延長產(chǎn)品貯藏期提供了相關(guān)理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮兔肉購自四川省成都市當?shù)厥袌?，平均質(zhì)量約1.7 kg，取兔后腿作為實驗材料。

NaCl、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、無水乙醇、乙酸乙酯、尿素、2-硝基苯甲酸、氯化鎂、乙二胺四乙酸二鈉、溴酚藍:均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；牛血清蛋白：生化試劑，上海如吉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP電子分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;1736R高速冷凍離心機 ScanSpeed公司；JRJ300-D-1勻漿機 上海滬析實業(yè)有限公司；HH-1A恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;SHA-C水浴振蕩器 金壇市科析儀器有限公司;FiveEasy Plus pH計 德國梅特勒-托利多公司;F-7000熒光分光光度計 日本日立公司;MCR 302流變儀 奧地利安東帕(中國)有限公司;UV-6000PC 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取一定量兔后腿，剔骨留下肌肉部分，除去脂肪和肌膜，將兔肉切成約2 cm×3 cm×2 cm的立方體后分為6組，分別加入0%、3%、6%、9%、12%、15%的NaCl混合均勻，放入4 ℃的冰箱中腌制48 h。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取

參考Zhang等[9]的方法，并進行適當?shù)男薷?。?0 g兔肉絞碎，加入40 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0，100 mmol/L的NaCl、2 mmol/L的MgCl2和1 mmol/L的EDTA-2Na)。然后在冰浴下以8000 r/min均質(zhì)1 min，用紗布過濾后得到總的蛋白溶液。以牛血清蛋白為標準，用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的濃度。

1.3.3 羰基含量測定

參考Wang等[10]的方法，并進行適當?shù)男薷?。?0 mmol/L的PBS (pH 6.0)稀釋樣品至5 mg/mL。從每組樣品中取兩份400 μL的稀釋液，其中一份用800 μL含0.2% 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L鹽酸處理，另一份用800 μL的2 mol/L鹽酸處理。樣品在室溫下反應(yīng)30 min后，加入三氯乙酸(0.4 g/mL)400 μL，混合物于4 ℃離心(5000 r/min, 5 min)，除去上清液。然后加入1 mL乙醇-乙酸乙酯混合液(1∶1，體積比)與沉淀物混合，隨后在4 ℃、5000 r/min條件下離心5 min，重復洗滌3次。加入1.5 mL含有6 mol/L鹽酸胍的PBS(20 mmol/L，pH 6.5)溶解沉淀。放置過夜后，在370 nm波長處測定吸光度，根據(jù)摩爾消光系數(shù)22000 L/(mol·cm)計算求得，公式如下：

式中：A表示在370 nm波長處的吸光度值；C表示蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；n表示稀釋倍數(shù)。

1.3.4 巰基含量測定

參考Wang等的方法，并進行適當?shù)男薷?。用PBS(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋樣品至5 mg/mL。取1 mL樣品溶液，用9 mL PBS(50 mmol/L，pH 7.0，含8 mol/L尿素，0.6 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA-2Na)稀釋。然后取3 mL稀釋后的溶液與0.4 mL 0.1%的2-硝基苯甲酸混合，在40 ℃下避光靜置25 min。冷卻至室溫后在412 nm波長處測量吸光度，巰基含量計算公式如下：

式中：A表示在412 nm波長處的吸光度值；C表示蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；n表示稀釋倍數(shù)。

1.3.5 表面疏水性測定

參考Zhang等的方法，并進行適當?shù)男薷?。用PBS(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋樣品至5 mg/mL。將1 mL稀釋液與0.2 mL溴酚藍溶液(BPB，1 mg/mL)混合。對照組加入PBS 1 mL，BPB溶液0.2 mL。所有樣品于25 ℃搖勻10 min，然后于4 ℃、2000×g離心15 min。離心后取上清液0.4 mL，加入PBS(20 mmol/L, pH 6.0)3.6 mL稀釋，在595 nm處測定吸光度。蛋白表面疏水性的計算公式如下:

1.3.6 紫外吸收光譜測定

參考Wang等[11]的方法。用 PBS(20 mmol/L，pH 6.0)稀釋樣品至0.5 mg/mL，在室溫下記錄230～320 nm稀釋溶液的吸收光譜。PBS(20 mmol/L，pH 6.0)為空白。

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜測定

參考Wang等的方法。用20 mmol/L的PBS(pH 6.0)稀釋樣品至0.5 mg/mL，使用熒光分光光度計在激發(fā)波長為295 nm的條件下，記錄在300～400 nm之間的發(fā)射光譜，電壓為700 V。

1.3.8 流變學特性測定

將樣品稀釋至15 mg/mL，測定其流變學特性。流變儀的測定條件：測試溫度25 ℃，頻率0.1 Hz，剪切速率0.1～100 s-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)的方差分析采用SPSS 26.0軟件進行，顯著性分析采用Duncan's多重比較，在p<0.05時為差異顯著，使用Origin 2021軟件進行繪圖。所有實驗重復3次，樣品至少設(shè)置3組重復。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaCl對蛋白質(zhì)巰基和羰基含量的影響

巰基含量是評判蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標，蛋白質(zhì)氧化程度越高，巰基含量越少。羰基是蛋白質(zhì)氧化的另一重要生成物，也可以反映蛋白質(zhì)的氧化程度[12]。NaCl對兔肉蛋白質(zhì)羰基和巰基含量的影響見圖1。

圖1 NaCl添加量對兔肉蛋白質(zhì)巰基和羰基含量的影響

由圖1可知，未加NaCl的兔肉蛋白巰基含量最高，而添加NaCl后，兔肉蛋白中巰基的含量顯著下降(p<0.05),下降了約20%。隨著NaCl添加量的增加，兔肉蛋白中羰基含量顯著上升(p<0.05)，最大值達到5.03 nmol/mg，這與Zhao等[13]結(jié)果保持一致，NaCl能夠顯著促進蛋白質(zhì)的氧化，加速兔肉蛋白質(zhì)中巰基的損失和羰基的形成。兔肉蛋白質(zhì)巰基含量下降的原因是半胱氨酸中巰基基團氧化轉(zhuǎn)化為二硫鍵和半胱氨酸含氧酸，二硫鍵的形成會導致蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)[14]。同時，兔肉在腌制后會釋放一些血紅素，從而促進過渡金屬如Fe2+、Fe3+參與反應(yīng)，蛋白質(zhì)則可以通過金屬催化氧化(MCO)途徑形成ROS進一步羰基化。由于鏈式反應(yīng)的活化能較高，反應(yīng)開始較慢，隨后蛋白質(zhì)迅速氧化，并在精氨酸、賴氨酸、脯氨酸和蘇氨酸的側(cè)鏈產(chǎn)生羰基[15]。脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)形成的加合物也可形成蛋白質(zhì)羰基化，如丙二醛、4-羥基壬烯醛等。

2.2 NaCl對蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)能夠維持三級結(jié)構(gòu)的要素是疏水基團之間存在一種非共價鍵作用力，絕大多數(shù)非極性氨基酸側(cè)鏈都隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，而部分非極性基團會暴露在蛋白質(zhì)分子表面，具有疏水性[16]。溴酚藍與蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出良好的疏水相互作用，通過二者的結(jié)合量可以反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，以此判斷氧化變性程度[17]。NaCl對兔肉蛋白質(zhì)表面疏水性的影響見圖2。

圖2 NaCl添加量對兔肉蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

由圖2可知，不添加NaCl的兔肉組別表面疏水性最弱，僅為38.76 μg，隨著NaCl添加量的增加，蛋白質(zhì)表面疏水性顯著增強(p<0.05)，而在NaCl添加量為9%以上時蛋白質(zhì)表面疏水性增加的不明顯(p>0.05)。NaCl添加量為9%以下時，NaCl破壞了蛋白質(zhì)親水基團和疏水基團的平衡，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)展開，構(gòu)象發(fā)生劇烈的改變，隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團暴露出來，所以蛋白質(zhì)的表面疏水作用顯著增強[18]。隨著NaCl添加量的進一步增加，兔肉蛋白疏水性變化不顯著，可能是高鹽抑制了蛋白質(zhì)的疏水和二硫鍵作用，也可能是過度氧化導致蛋白質(zhì)通過疏水相互作用發(fā)生聚集，使得表面疏水性的增加有所減弱。

2.3 NaCl對蛋白質(zhì)紫外吸收光譜的影響

蛋白質(zhì)中含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基具有紫外吸收特性，所以紫外吸收光譜可以反映芳香族氨基酸側(cè)鏈的變化，從而揭示蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。不同NaCl添加量下兔肉蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜見圖3。

圖3 NaCl添加量對兔肉蛋白質(zhì)紫外吸收光譜的影響

由圖3可知，經(jīng)過不同添加量NaCl腌制處理后，兔肉蛋白質(zhì)紫外吸收光譜趨勢相似，都在280 nm處出現(xiàn)了峰的拐點。由此可知，NaCl對兔肉蛋白質(zhì)有促氧化作用，但是氧化不會改變蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)，隨著NaCl添加量的增加，蛋白質(zhì)的吸收峰輕微下降。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的最大紫外吸收峰隨著氧化強度的增大而減小，這是因為蛋白質(zhì)表面酪氨酸和色氨酸殘基的氧化修飾作用。酪氨酸容易被ROO·攻擊，在雜原子取代物處發(fā)生氫原子提取反應(yīng)，然后產(chǎn)生酪氨酸苯氧基，兩個酪氨酸自由基發(fā)生偶聯(lián)，并進一步通過共價鍵生成二聚酪氨酸。色氨酸殘基也會發(fā)生類似的反應(yīng)，從而增強分子內(nèi)或分子間的蛋白質(zhì)交聯(lián)。

2.4 NaCl對兔肉蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強度的影響

內(nèi)源熒光光譜通常用來表征蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。不同NaCl添加量下兔肉蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強度見圖4。

圖4 NaCl添加量對兔肉蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強度的影響

由圖4可知，添加NaCl之后，兔肉蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強度有所降低，當NaCl添加量為9%時熒光強度最低，并發(fā)生了輕微的紅移，說明NaCl有促進兔肉蛋白質(zhì)氧化的作用。這可能是因為氧化會導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)展開，暴露了內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)的色氨酸殘基，色氨酸具有較高的熒光強度，當?shù)鞍踪|(zhì)展開、色氨酸暴露于外部環(huán)境時熒光強度反而會降低，這與趙亞南等[19]的研究結(jié)果相似。

2.5 NaCl對蛋白質(zhì)流變學特性的影響

NaCl對兔肉蛋白質(zhì)剪切應(yīng)力的影響變化曲線見圖5。

由圖5可知，不同NaCl添加量的兔肉蛋白質(zhì)剪切應(yīng)力隨著剪切速率的增大而增大。在低剪切速率階段，蛋白質(zhì)溶液的剪切應(yīng)力幾乎呈線性上升的趨勢，蛋白質(zhì)溶液表現(xiàn)出牛頓流體的性質(zhì)，這是因為蛋白質(zhì)的高分子鏈段在剪切速率較低時沒有表現(xiàn)出黏彈性形變。在相同的剪切速率下，添加NaCl的樣品剪切應(yīng)力高于未添加NaCl的樣品，且在添加量為6%時達到最大。這可能是由于鹽能促進肌原纖維蛋白的溶解，形成致密的三維網(wǎng)絡(luò)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用力得以增強，在低鹽環(huán)境下肌球蛋白間有較強的作用力，如氫鍵、離子鍵等，降低了溶液的流動性，所以需要更大的剪切應(yīng)力[20]。而高鹽會導致蛋白質(zhì)過度氧化并發(fā)生聚集現(xiàn)象，分子間作用力有所降低。

圖5 NaCl添加量對兔肉蛋白質(zhì)流變學特性的影響

3 結(jié)論

本研究通過添加不同質(zhì)量濃度的NaCl腌制兔肉，以探討NaCl對兔肉蛋白質(zhì)氧化的影響。結(jié)果表明，隨著NaCl添加量的增加，兔肉蛋白質(zhì)中巰基含量降低了約20%，羰基含量升高至5.03 nmol/mg，表面疏水性得到增強，表明NaCl作為促氧化劑使蛋白質(zhì)氧化程度有所增加。不同NaCl添加量腌制處理后的兔肉蛋白質(zhì)紫外吸收光譜相似，都在280 nm處出現(xiàn)了峰的拐點，而隨著NaCl添加量的增加，蛋白質(zhì)的紫外最大吸收峰會略微下降。添加NaCl后，兔肉蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強度也有降低的現(xiàn)象，在添加量為9%時熒光強度最低，并發(fā)生了輕微的紅移，這說明NaCl的促氧化作用導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。兔肉的肌原纖維蛋白在NaCl的作用下溶解，蛋白溶液的流動性減弱，剪切應(yīng)力增大，且在NaCl添加量為6%時最大，而高鹽腌制的兔肉蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，分子間作用力減小，導致剪切應(yīng)力減小?？傮w而言，NaCl會促進蛋白質(zhì)的氧化，但是高鹽會導致蛋白質(zhì)過度氧化，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，降低兔肉的食用品質(zhì)，所以在實際生產(chǎn)中要注意調(diào)控鹽的用量。