陳金泉，趙 龍，丁渲恒，王令達，文 艷，謝 昊，彭 惠

400016 重慶，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科，眼科學重慶市市級重點實驗室，重慶市眼科研究所

糖尿病性視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者眼部的并發(fā)癥，同時也是導(dǎo)致患者失明的主要原因[1-2]。研究表明，血糖升高會導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管損傷，從而使得血視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)破裂、視網(wǎng)膜內(nèi)出血[3-4]。

中性粒細胞是血液中最豐富的免疫細胞，在先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，是細胞防御第一道防線[5]。中性粒細胞受到刺激后，會釋放中性粒細胞外捕獲網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)來清除病原體。釋放NETs的過程被稱為NETosis[6-7]。NETosis是中性粒細胞特有的細胞死亡形式，其形態(tài)學特征是核膜與胞質(zhì)顆粒膜溶解，染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)顆粒組合，核膜破裂，隨后釋放至細胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)稱為NETs[8]。NETs是由解旋染色質(zhì)和多種蛋白組成，其中包括髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、蛋白酶3 (proteinase 3, PR3)、LL37和4種組蛋白[9]。目前缺乏對NETs直接定量的方法。既往研究中使用免疫熒光觀察NETs的形態(tài)，然后檢測培養(yǎng)基中NETs的標志性蛋白和dsDNA來間接評估NETs的含量[10]。雖然NETs的產(chǎn)生有利于應(yīng)對病原體的入侵，但過量的NETs會導(dǎo)致一系列的自身免疫性疾病[11]。研究表明，NETs會導(dǎo)致新生血管形成，并且NETs還參與了干眼癥、葡萄膜炎等疾病[12]。DR患者在使用anti-VEGF治療后，玻璃體中的NETs含量下降。提示NETs參與了DR的發(fā)病[13]。

研究表明，傳統(tǒng)中草藥川芎的有效成分川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)具有較強的抗炎能力[14]。TMP因具有抗氧化、抗炎作用，被推薦用于治療各種視網(wǎng)膜病[15]。TMP可以通過MAPK通路改善IL-1β誘導(dǎo)的血視網(wǎng)膜屏障破壞[16]。然而TMP對DR患者視網(wǎng)膜保護作用的分子機制尚不清楚。本研究進一步探討TMP對中性粒細胞產(chǎn)生NETs的影響，為闡述TMP對DR患者的保護作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 2021年3月至2022年3月，從本院眼科實驗室選取5位健康受試者，各抽取10 mL外周血用以提取中性粒細胞。本研究獲得患者知情同意，并獲得重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批(審查批號:2021-711)。

1.1.2 主要試劑與儀器 中性粒細胞分離試劑盒購于中國TBD公司；高糖培養(yǎng)基、低糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；CCK-8試劑購于美國Bryotime公司；細胞計數(shù)板購于上海睿鈺生物科技有限公司；Pico-Green Kit購于美國Sigma公司；人MPO-DNA復(fù)合物酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒購于中國酶科公司；TMP、ML385購于美國陶素生物公司；特性抗體HO-1、NRF2、β-actin購于中國Affinity公司；特異性抗體H3-cit購于美國Abcam公司；DHE和DCFH-DA試劑購于中國碧云天公司；DPI購于美國MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 分離人中性粒細胞 取中性粒細胞分離液4 mL于離心管中，然后使用滴管將人外周血小心加入離心管中離心(600×g，25 min，21 ℃)。離心結(jié)束后，小心吸取試管中的中性粒細胞于另一支試管。使用PBS洗滌細胞，21 ℃，1 050 r/min，離心5 min。使用紅細胞裂解液去除殘余的紅細胞。使用低糖培養(yǎng)基1 mL重懸，臺盼藍檢測活細胞比例。

1.2.2 CCK-8測定中性粒細胞活性 將中性粒細胞(104/孔)接種在96孔板中，加入低糖培養(yǎng)液置于37 ℃孵箱。培養(yǎng)30 min后，加入CCK-8試劑10 μL，隨后加入0、5、10、20、40、80 μmol/L的TMP處理中性粒細胞4 h，使用多功能酶標儀測量波長450 nm處光密度值[D(450)]，實驗重復(fù)3～4次。

1.2.3 主要試劑及細胞處理方法 TMP處理方法：取1 mg的TMP粉末溶解于730 μL的DMSO中，配置為10 mmol/L終濃度的TMP原液，培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。NADPH氧化酶(NOX)抑制劑DPI處理方法：取1 mg的DPI粉末溶解于317 μL的DMSO中，配置為10 mmol/L終濃度的DPI原液，屆時使用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。NRF2抑制劑ML385處理方法：取1 mg的ML385粉末溶解于100 μL的DMSO中，配置為20 mmol/L終濃度的ML385原液，屆時使用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。TMP、DPI與高糖(high glucose,HG)同時處理中性粒細胞。ML385預(yù)先處理中性粒細胞30 min后，再加入TMP與HG。

1.2.4 中性粒細胞分組 將中性粒細胞分為: Control組(1.5 g/L葡萄糖)，TMP組(40 μmol/L TMP), HG組(4.5 g/L葡萄糖)，HG+TMP組(40 μmol/L TMP+4.5 g/L葡萄糖)，HG+TMP+ML385組(4.5 g/L葡萄糖+40 μmol/L TMP+10 μmol/L ML385)，HG+ML385組(4.5 g/L葡萄糖+10 μmol/L ML385)，HG+DPI組(4.5 g/L葡萄糖+10 μmol/L DPI)。

1.2.5 Western blot檢測 中性粒細胞總蛋白使用蛋白提取液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取，離心12 000 r/min，15 min，4 ℃。吸取上清液，隨后向上清液中加入蛋白上樣緩沖液。最后將EP管放入沸水中5 min, -20 ℃保存。電泳時，每個樣品的蛋白量保持一致(30～50 μg)，使用12%、15% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。隨后將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入H3-cit (1∶1 000)、HO-1 (1∶1 000)、NRF2(1∶1 000)、β-actin (1∶1 000)、NOX2 (1∶1 000)的特異性一抗，4 ℃孵育12～16 h。然后將條帶洗滌3次，加入相應(yīng)的二抗(1∶10 000)，37 ℃孵育2 h。條帶蛋白信號使用ECL試劑盒檢測，Image J分析條帶密度。使用內(nèi)源對照β-actin將數(shù)據(jù)標準化，重復(fù)實驗3次。

1.2.6 細胞內(nèi)ROS和超氧化物陰離子檢測 將分離出來的人中性粒細胞重懸在1 mL低糖培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)基中分別加入DCFH-DA、DHE試劑1 μL，將試管放入孵箱中，孵育30 min后，使用低糖培養(yǎng)基洗去殘余的探針并計數(shù)，向96孔板中加入中性粒細胞(105/孔)。設(shè)置相應(yīng)培養(yǎng)基作為空白孔，于孵箱中培養(yǎng)4 h。DCFH-DA以488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，使用多功能酶標儀檢測熒光強度。DHE以535 nm激發(fā)波長，以610 nm發(fā)射波長，使用多功能酶標儀檢測熒光強度。

1.2.7 免疫熒光檢測H3-cit的表達 將中性粒細胞接種在多聚賴氨酸處理過的細胞爬片上，按照分組處理，并于孵箱中孵育4 h，然后取出細胞爬片，使用4%的多聚甲醛固定細胞15 min。PBS洗滌3次，使用0.1% Triton X-100作用5 min穿透細胞膜，再次洗滌3次，使用5%山羊血清封閉細胞爬片1 h，隨后加入H3-cit(1∶100) 特異性一抗混合液在4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次后，將細胞用DAPI染色15 min，并洗滌3次。使用熒光顯微鏡觀察所有熒光圖像，照相并保存。

1.2.8 Pico-Green試劑盒檢測培養(yǎng)基中的dsDNA含量 將中性粒細胞(1×106)接種在24孔板中，按照細胞分組，處理4 h后，收集24孔板中的培養(yǎng)基于EP管中，保存在-80 ℃。然后將DNA標準品加入黑色酶標板中，并設(shè)置復(fù)孔和空白孔。加入待測培養(yǎng)基50 μL于黑色酶標板中，將Pico-green探針試劑以1∶200稀釋后，50 μL加入到每孔中，室溫靜置5 min。多功能酶標儀檢測在485 nm激發(fā)波長、535 nm發(fā)射波長檢測熒光強度，并帶入標準曲線計算。

1.2.9 MPO-DNA復(fù)合物酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒 將中性粒細胞(1×106)接種在24孔板中，按照細胞分組，處理4 h后，收集24孔板中的培養(yǎng)基于EP管中，保存在-80 ℃。然后使用雙蒸水配置洗滌液(1∶20)，配置MPO-DNA標準品，濃度分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL，每個濃度設(shè)置1個復(fù)孔，并設(shè)置空白孔。加入標準品和待測樣本，100 μL/孔。室溫孵育2 h。棄去孔中液體，洗滌液洗板3次，拍干酶標板。加入預(yù)先配置好的工作液，室溫孵育1 h，洗滌液洗板3次，拍干酶標板。加入預(yù)先配置的顯色劑100 μL/孔，避光室溫孵育30 min，加入終止液100 μL/孔，混勻后，測量D(450)值，帶入標準曲線計算濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 5.0分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，單組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗分析。檢驗水準: α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TMP誘導(dǎo)中性粒細胞NRF2/HO-1通路激活

CCK-8檢測結(jié)果顯示，中性粒細胞在不同濃度TMP處理后，40 μmol/L TMP處理后的中性粒細胞活性與Control組無明顯差異; 80 μmol/L TMP處理后，中性粒細胞活性下降(P<0.01，圖1A)。Western blot檢測結(jié)果顯示，TMP(40 μmol/L)組細胞內(nèi)NRF2、HO-1蛋白表達量顯著升高(P<0.01，圖1B)。以上結(jié)果說明TMP可以誘導(dǎo)中性粒細胞內(nèi)NRF2和HO-1升高。

a:P<0.01，與Control組比較

2.2 TMP抑制高糖誘導(dǎo)的NETs形成

Pico-Green檢測結(jié)果顯示，HG組中性粒細胞培養(yǎng)基中dsDNA的表達升高，5、10 μmol/L TMP無法逆轉(zhuǎn)其升高；而20 μmol/L可逆轉(zhuǎn)其升高(P<0.05)，40 μmol/L TMP可顯著逆轉(zhuǎn)其升高(P<0.01，圖2A)。免疫熒光結(jié)果顯示，HG組可以觀察到DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及其上附著的H3-cit, 而TMP(40 μmol/L)組和HG+TMP組均未觀察到NETs的形成(圖2B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，HG組中性粒細胞 H3-cit表達顯著升高，TMP組差異無統(tǒng)計學意義；與HG組相比，HG+TMP組H3-cit表達下降(P<0.05，圖2C)。ELISA和Pico-Green檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，HG組MPO-DNA和dsDNA含量顯著升高(P<0.01)，TMP組無顯著差異；與HG組相比，HG+TMP組MPO-DNA和dsDNA含量顯著下降 (P<0.01，圖2D、E)。結(jié)果表明TMP可以抑制高糖誘導(dǎo)中性粒細胞形成NETs。

a: P<0.05, b: P<0.01，與HG組比較

2.3 TMP對中性粒細胞內(nèi)活性氧和超氧化物陰離子的影響

Western blot結(jié)果顯示，與HG組相比，HG+TMP組、HG+DPI組NOX2蛋白表達明顯下降(P<0.05，圖3A)。免疫熒光顯示，HG組可觀察到DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及其上附著的H3-cit，HG+TMP組和HG+DPI組未觀察到DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3B)。DHE和DCFH-DA結(jié)果顯示，與Control組相比，HG組細胞內(nèi)超氧化物陰離子和ROS顯著升高(P<0.01)；與HG組相比，HG+TMP組、HG+DPI組超氧化物陰離子和ROS顯著下降(P<0.01，圖3C、D)。上述結(jié)果表明，TMP可通過抑制NADPH氧化酶從而抑制NETs的形成。

a: P<0.05，b: P<0.01，與HG組比較

2.4 TMP通過升高NRF2和HO-1抑制NETs生成

Western blot結(jié)果顯示，與HG+TMP組相比，HG組、HG+TMP+ML385組、HG+ML385組中性粒細胞H3-cit表達顯著升高(P<0.01)，NRF2、HO-1表達量顯著降低(P<0.01，圖4A)。免疫熒光觀察顯示，HG組、HG+TMP+ML385組、HG+ML385組可觀察到DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及其上附著的H3-cit，HG+TMP組未觀察到DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖4B)。ELISA和Pico-Green結(jié)果顯示: 與HG+TMP組相比，HG組、HG+TMP+ML385組、HG+ML385組MPO-DNA和dsDNA含量升高(P<0.01，圖4C、D)。DHE和DCFH-DA檢測顯示：與HG+TMP組相比，HG組、HG+TMP+ML385組、HG+ML385組中性粒細胞內(nèi)超氧化物陰離子和ROS的表達顯著升高(P<0.01，圖4E、F)。以上結(jié)果表明TMP可能通過升高NRF2和HO-1的表達來抑制高糖誘導(dǎo)的中性粒細胞產(chǎn)生NETs。

1：Control組；2：HG組；3：HG+TMP組；4：HG+TMP+ML385組；5：HG+ML385組；a: P<0.01，與HG+TMP組比較

3 討論

糖尿病患病率在我國逐年升高，糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)高糖是誘導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要原因之一，而氧化應(yīng)激、細胞凋亡等因素可以促進糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生、發(fā)展[17]。目前的治療方案是以激光光凝和玻璃體腔注射抗VEGF藥物為主，但取得的治療效果欠佳，所以亟需一種新的治療方法和靶點。

NETs的形成是中性粒細胞應(yīng)對病原體入侵的手段之一[18]。NETs的形成主要依賴于Raf/Merk/ERK信號通路和NOX依賴途徑[19]。以往的研究報道發(fā)現(xiàn)NETs結(jié)構(gòu)上所附著的抗菌組蛋白、MPO、蛋白酶可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，從而誘發(fā)一系列的自身免疫和血管炎癥并伴隨中性粒細胞胞漿抗體產(chǎn)生(ANCAs)[20]。因此，合理應(yīng)對NETs的形成可能成為慢性炎癥潛在的治療靶點。以往研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病視網(wǎng)膜病患者血清及糖尿病視網(wǎng)膜病大鼠模型血清中發(fā)現(xiàn)NETs的表達升高，并且通過玻璃體腔抗VEGF處理后，發(fā)現(xiàn)大鼠模型玻璃體中NETs的含量下降。這些結(jié)果說明NETs參與了糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生、發(fā)展[13]。

TMP是川芎的有效成分，其具有廣泛的藥理學活性，在臨床上應(yīng)用廣泛。以往的研究表明TMP對IL-1β誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷具有保護作用[21]。并且有研究發(fā)現(xiàn)，TMP可以抑制肝移植大鼠血清中NETs的形成從而減輕肝移植后的氧化應(yīng)激損傷[22]。因此探討TMP對高糖誘導(dǎo)的NETs的影響，來探究TMP是否有潛力作為糖尿病視網(wǎng)膜病輔助治療的藥物。

研究報道，HO-1參與iNOS和NO的調(diào)控，正常生理條件下，HO-1表達相對較低，而在受到外來刺激時表達量升高[14]。HO-1可以保護細胞免受ROS的影響。而HO-1主要受到E2相關(guān)因子2 (NRF2)的調(diào)控，所以NRF2/HO-1可以抑制炎癥和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)適宜濃度的TMP處理可以上調(diào)中性粒細胞內(nèi)NRF2/HO-1的表達，并且使用TMP處理的中性粒細胞在受到高糖刺激下無法形成NETs。同時發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)下，中性粒細胞內(nèi)ROS升高，而使用TMP處理后中性粒細胞內(nèi)ROS下降。

超過細胞調(diào)節(jié)能力的ROS升高和調(diào)節(jié)細胞ROS水平的酶活性會導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激。過量的ROS誘導(dǎo)中性粒細胞內(nèi)線粒體膜電位的變化從而誘導(dǎo)中性粒細胞釋放NETs。當ROS超載時，NRF2作為主要的抗氧化控制器，可以通過調(diào)節(jié)多種抗氧化酶的表達從而發(fā)揮抗氧化保護作用[24]。本研究表明在高糖刺激下，中性粒細胞內(nèi)NRF2和HO-1表達升高，但高糖刺激下的ROS產(chǎn)生超過細胞自我調(diào)節(jié)能力，無法抑制NETs產(chǎn)生。使用TMP處理后，中性粒細胞內(nèi)NRF2和HO-1表達升高，并且能夠有效抑制NETs的形成。使用NRF2抑制劑可以有效抑制TMP對中性粒細胞的保護作用。由此我們推斷TMP可能通過NRF2/HO-1途徑產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，高糖可誘發(fā)中性粒細胞氧化應(yīng)激，并誘導(dǎo)NETs的形成，適宜濃度的TMP處理可以通過上調(diào)NRF2/HO-1通路抑制中性粒細胞形成NETs。推測TMP可能激活NRF2/HO-1途徑參與到高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生、發(fā)展提供保護作用。然而，以上結(jié)果仍需要體內(nèi)實驗進一步論證。本研究有助于了解TMP在中性粒細胞氧化應(yīng)激損傷中的保護作用，為糖尿病性視網(wǎng)膜病的治療提供潛在靶點。