孫瑤 李彥 凌愷 鄭丹丹 司馬國旗

聲帶白斑表現(xiàn)為聲帶黏膜白色斑或斑片狀改變，可有增生、化生和不典型增生等上皮樣改變，約6%～22%的患者可能發(fā)展為喉癌，被認(rèn)為是喉癌的癌前病變之一[1-2]。因此，臨床上早期診斷聲帶白斑意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅母親DPP同源物4（drosophila mothers against decapentaplegic protein 4,SMAD4）、IL-35作為轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor β,TGF-β）信號的中樞介質(zhì)及免疫調(diào)節(jié)因子，是頭頸部鱗狀細(xì)胞上皮腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要預(yù)測指標(biāo)[3]?；诖?，本研究對比分析 SMAD4、IL-35[包括2個(gè)亞型：IL-12p35、EB病毒誘導(dǎo)蛋白 3（Epstein-Barr virus induced 3,Ebi3）]在聲帶息肉、白斑及喉癌組織中的表達(dá)情況，并探討其與喉癌的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年1月至2021年1月嘉興市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科收治的行手術(shù)治療的聲帶白斑患者30例為聲帶白斑組，聲帶息肉患者30例為聲帶息肉組，喉癌患者30例為喉癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)檢查確診為聲帶息肉、聲帶白斑或喉癌；（2）病變均為單側(cè)聲帶，病歷資料完整；（3）無其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史；（4）無頭頸部放療史；（5）無咽部手術(shù)治療史。聲帶白斑組男27例，女3例，年齡（45.37±8.43）歲；Ⅰ型（光滑平坦型）占63.3%（19/30），Ⅱ型（光滑肥厚型）占16.7%（5/30），Ⅲ型（粗糙型）占20.0%（6/30）。聲帶息肉組男14例，女16例；年齡（40.78±9.31）歲。喉癌組男29例，女1例，年齡（59.33±7.63）歲。3組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。3組患者均由同一團(tuán)隊(duì)醫(yī)師完成手術(shù)及后續(xù)的治療隨訪。聲帶息肉組患者手術(shù)方式均為支撐喉鏡下聲帶息肉切除術(shù)，聲帶白斑組患者手術(shù)方式均為支撐喉鏡下CO2激光聲帶白斑切除術(shù)，喉癌組患者手術(shù)方式均為喉部分切除+功能性頸淋巴結(jié)清掃術(shù)。聲帶白斑組患者術(shù)后隨訪12～35（35.6±5.9）個(gè)月，術(shù)后復(fù)發(fā)7例，其中進(jìn)展為喉癌2例，其余患者無殊。喉癌組患者術(shù)后隨訪16～38（29.7±8.3）個(gè)月，喉癌局部復(fù)發(fā)2例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本取材與RT-PCR檢測樣本制備 聲帶息肉、白斑、喉癌組織取材均與病理科取材同步進(jìn)行，保存于-80℃深低溫冰箱中。RT-PCR檢測時(shí)取適量組織置入研磨器中，加入1 ml Trizol裂解液（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）后置于冰上充分研磨后轉(zhuǎn)至潔凈的1.5 ml EP管中，室溫靜置5 min后在4℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清液置于潔凈的EP管內(nèi)備用。

1.2.2 聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-35 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法。提取組織總RNA，取2 μl RNA溶液在核酸測定儀（山東高芯生物傳感器研究院有限公司）中檢測OD260/280值，測定RNA濃度，于-80℃保存。將1 μl RNA溶液及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒置入冰上融化，70℃水浴中孵育5 min，低速離心后42℃60 min，70℃10 min上機(jī)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)產(chǎn)物置于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。SYBR?Green Realtime PCR Master Mix反應(yīng)體系，95℃變性60 s，95℃退火15 s，60℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)后繪制熔解曲線，運(yùn)用MJ Opticon Monitor 3.0分析軟件計(jì)算得Ct值，然后以GAPDH mRNA作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后計(jì)算各組織RNA相對表達(dá)水平。

1.2.3 聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白表達(dá)定性檢測 采用免疫熒光染色法，經(jīng)烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、一抗結(jié)合、滴加二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、乙醇溶液脫水干燥等步驟，以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)明確的黃色或黃褐色顆粒為陽性細(xì)胞。細(xì)胞陽性率評分：陽性細(xì)胞＜5%計(jì)0分；5%～＜25%計(jì)1分；25%～＜50%計(jì)2分；50%～＜75%計(jì)3分；≥75%計(jì)4分；細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：不染色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。兩項(xiàng)評分的乘積作為各蛋白表達(dá)的定性結(jié)果：0～2分為陰性（-），3～5分為弱陽性（+），6～8分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。+～+++都?xì)w為陽性表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表達(dá)水平；（2）比較聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白表達(dá)情況；（3）分析聲帶組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表達(dá)水平、蛋白陽性表達(dá)率與上皮異常增生程度（包括聲帶息肉、聲帶白斑、喉癌）的相關(guān)性；（4）分析聲帶白斑術(shù)后發(fā)展為喉癌的危險(xiǎn)因素；（5）分析影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用χ2分割法。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。危險(xiǎn)因素分析采用Cox多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表達(dá)水平比較 聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。組間兩兩比較，聲帶息肉組織SMAD4 mRNA表達(dá)水平＞聲帶白斑組織＞喉癌組織（均P＜0.05）；聲帶息肉組織IL-12p35 mRNA表達(dá)水平＜聲帶白斑組織＜喉癌組織（均P＜0.05）；聲帶息肉組織Ebi3 mRNA表達(dá)水平＜聲帶白斑組織＜喉癌組織（均P＜0.05）。見表1。

表1 聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 聲帶息肉、白斑、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白表達(dá)情況比較 在聲帶息肉組織中有大量SMAD4陽性表達(dá)細(xì)胞，隨著上皮異常增生程度的加重，聲帶白斑組織及喉癌組織中SMAD4陽性表達(dá)細(xì)胞顯著減少；在聲帶息肉組織中有少許IL-12p35及Ebi3陽性表達(dá)細(xì)胞，主要集中在基底膜，隨著上皮異常增生程度的加重，聲帶白斑及喉癌組織中IL-12p35、Ebi3陽性表達(dá)細(xì)胞顯著增加，見圖1-3（插頁）。聲帶息肉、聲帶白斑、喉癌組織SMAD4陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聲帶息肉組織＞聲帶白斑組織＞喉癌組織（均P＜0.05）；聲帶息肉組織、聲帶白斑組織、喉癌組織IL-12p35陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聲帶息肉組織＜聲帶白斑組織＜喉癌組織（均P＜0.05）；聲帶息肉組織、聲帶白斑組織、喉癌組織Ebi3陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聲帶息肉組織＜聲帶白斑組織＜喉癌組織（均P＜0.05）。見表2。

圖1 聲帶息肉、白斑、喉癌組織中果蠅母親DPP同源物4（SMAD4）的表達(dá)（a：聲帶息肉組織；b：聲帶白斑組織；c：喉癌組織；免疫熒光染色，×400）

圖2 聲帶息肉、白斑、喉癌組織中IL-12p35的表達(dá)（a：聲帶息肉組織；b：聲帶白斑組織；c：喉癌組織；免疫熒光染色，×400）

圖3 聲帶息肉、白斑、喉癌組織中EB病毒誘導(dǎo)蛋白3（Ebi3）的表達(dá)（a：聲帶息肉組織；b：聲帶白斑組織；c：喉癌組織；免疫熒光染色，×400）

表2 聲帶息肉組織、聲帶白斑組織、喉癌組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3蛋白陽性表達(dá)率比較[例（%）]

2.3 聲帶組織SMAD4、IL-12p35、Ebi3 mRNA表達(dá)水平、蛋白陽性表達(dá)率與上皮異常增生程度的相關(guān)性分析 聲帶組織SMAD4 mRNA表達(dá)水平、蛋白陽性表達(dá)率與聲帶組織上皮異常增生程度均呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.637、-0.817，均P＜0.05）；IL-12p35 mRNA表達(dá)水平、蛋白陽性表達(dá)率與聲帶組織上皮異常增生程度均呈正相關(guān)（rs=0.712、0.673，均P＜0.05）；Ebi3 mRNA表達(dá)水平、蛋白陽性表達(dá)率與聲帶組織上皮異常增生程度均呈正相關(guān)（rs=0.681、0.776，均P＜0.05）。

2.4 聲帶白斑術(shù)后發(fā)展為喉癌的危險(xiǎn)因素分析 Cox多因素分析顯示，聲帶白斑形態(tài)分型差、上皮異常增生程度高、SMAD4低表達(dá)及Ebi3高表達(dá)是聲帶白斑術(shù)后發(fā)展為喉癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見表3。

表3 聲帶白斑術(shù)后發(fā)展為喉癌的危險(xiǎn)因素分析

2.5 影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 Cox單因素分析顯示，腫瘤T分期、腫瘤組織分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管轉(zhuǎn)移、SMAD4低表達(dá)及IL-35高表達(dá)是影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）；多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及IL-35高表達(dá)是影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見表4。

表4 影響喉癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

聲帶白斑是指發(fā)生于聲帶黏膜，表現(xiàn)為白色斑塊狀或者隆起的病變，但該術(shù)語僅為臨床上的一種形態(tài)學(xué)描述性診斷。以往在臨床上把聲帶白斑等同于癌前病變，但這一觀點(diǎn)尚有爭議，不少學(xué)者認(rèn)為聲帶白斑僅是臨床描述性名詞，本身并不提示某種組織病理學(xué)變化，更并非癌或者惡性病變的代名[4-5]。由于聲帶白斑的病因復(fù)雜，病理分類、治療與隨訪策略尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但因其具有一定的惡變潛能，故臨床上備受關(guān)注。Mehanna等[6]研究表明聲帶白斑中病理學(xué)、基因分析、生物標(biāo)志物預(yù)測等是未來研究方向，但有關(guān)聲帶白斑基因、分子生物學(xué)等方面研究卻鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

正常聲帶黏膜組織轉(zhuǎn)變?yōu)槁晭О装呱踔吝M(jìn)一步癌變?yōu)楹戆┑倪^程也是多因素造成的，包含細(xì)胞凋亡調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移黏附、癌基因與抑癌基因、DNA損傷修復(fù)等多個(gè)生物過程。SMAD4作為一種抑瘤基因，是轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β信號的重要胞質(zhì)內(nèi)信號級聯(lián)分子，并負(fù)責(zé)將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，當(dāng)SMAD4表達(dá)障礙時(shí)，可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展[7]。本研究結(jié)果顯示，SMAD4在聲帶息肉組織、聲帶白斑組織、喉癌組織中表達(dá)依次下調(diào)且其表達(dá)強(qiáng)度與上皮異常增生程度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)多因素分析也表明SMAD4低表達(dá)是聲帶白斑術(shù)后發(fā)展為喉癌的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。Junki等[8]研究也發(fā)現(xiàn)SMAD4在口腔白斑惡變存在預(yù)測價(jià)值，其可能的機(jī)制是SMAD4通過基因突變、缺失或表達(dá)靜止導(dǎo)致功能失活，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。由此說明，SMAD4的低表達(dá)可能通過阻斷TGF-β等信號通路，減少相關(guān)抑癌基因表達(dá)而導(dǎo)致聲帶白斑的惡變，并可能預(yù)測聲帶白斑的術(shù)后轉(zhuǎn)歸。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下或免疫功能受到抑制時(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞通過免疫逃逸機(jī)制逃避效應(yīng)細(xì)胞的識別和殺傷，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。IL-35是新發(fā)現(xiàn)的、具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子，主要由Treg產(chǎn)生，可顯著抑制效應(yīng)T細(xì)胞（Teffs）增殖并促進(jìn)Treg增殖參與腫瘤微環(huán)境而發(fā)揮免疫抑制作用，與腫瘤進(jìn)展及腫瘤預(yù)后不良有關(guān)，主要有2個(gè)亞基：Ebi3、IL-12p35。Collison等[10]研究顯示，鼻咽癌腫瘤組織中Ebi3、IL-12p35的表達(dá)明顯高于癌旁組織及鼻咽部慢性炎癥組織，且其表達(dá)程度與腫瘤臨床分期、組織學(xué)分型和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究中，Ebi3、IL-12p35在聲帶息肉組織、聲帶白斑組織及喉癌組織中表達(dá)依次上調(diào)且其表達(dá)強(qiáng)度與上皮異常增生程度呈正相關(guān)，這說明IL-35與喉癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程呈正相關(guān)，其免疫抑制作用出現(xiàn)在喉癌發(fā)生的早期階段，隨著喉癌進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步失去正常機(jī)體免疫識別調(diào)控及清除，IL-35的高表達(dá)加速細(xì)胞無限增殖，影響喉癌患者預(yù)后。

Young等[11]研究表明喉鏡下檢查觀察到的白斑病損的顏色、充血（合并紅斑）、大小、質(zhì)地與白斑組織病理類型存在一定的相關(guān)性，可作為制定治療方案或手術(shù)方式前的評估項(xiàng)目。本研究表明，聲帶白斑形態(tài)分型是聲帶白斑術(shù)后發(fā)展為喉癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Ⅲ型患者更易發(fā)展為喉癌。Fang等[12]研究也表明，喉鏡下聲帶白斑不同分型的病理類型是存在差異的，白斑的形態(tài)分型等級越高，其病理異型增生程度越高。但目前國內(nèi)外均沒有成體系的聲帶白斑的分類、分級或分期的研究報(bào)道。故筆者認(rèn)為，聲帶白斑形態(tài)分型是影響預(yù)后的客觀指標(biāo)，但需結(jié)合聲帶上皮異型增生程度的病理類型來評估患者預(yù)后。

綜上所述，SMAD4的低表達(dá)及IL-35的高表達(dá)可能通過阻礙細(xì)胞信號通路或調(diào)節(jié)免疫抑制影響聲帶白斑的轉(zhuǎn)歸，并可能成為喉癌的發(fā)生、發(fā)展的早期事件。SMAD4、IL-35有望成為預(yù)測聲帶白斑轉(zhuǎn)歸乃至喉癌預(yù)后的重要靶點(diǎn)或標(biāo)志物，但具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。