蔣榕，趙億嘉#，袁林，曾俊普，邢虎成，2，3，4*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省種質(zhì)資源創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.湖南省草類(lèi)作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaudich)起源于中國(guó)，又稱(chēng)“中國(guó)草”[1]，主要用于生產(chǎn)纖維，其纖維可做紡織工業(yè)的原料[2]。苧麻是我國(guó)第二大纖維作物，產(chǎn)量約占全世界總產(chǎn)量的96%，僅次于棉花[3]。

近年來(lái)，我國(guó)培育出一批高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種，如“湘飼纖兼用苧1號(hào)”平均纖維產(chǎn)量可達(dá)2559.45 kg/hm2，纖維支數(shù)可達(dá)2300支/hm2[4]，纖維品質(zhì)大幅提高，這表明苧麻產(chǎn)量和品質(zhì)遺傳改良的潛力很大。目前我國(guó)苧麻育種方法和手段單一，育種周期長(zhǎng)、效率低，盲目性較大[5]，因此，改善苧麻育種方法以獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苧麻品種的任務(wù)十分迫切而艱巨。

誘變育種解決了傳統(tǒng)遺傳育種的瓶頸，增強(qiáng)了遺傳多樣性[7]。近年來(lái)，誘變育種在苧麻育種中取得較大成績(jī)，目前用于苧麻誘變育種的方法有物理誘變、化學(xué)誘變和太空誘變[8-9]。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所歷經(jīng)20年，使用秋水仙堿進(jìn)行誘變選育出的苧麻多倍體新品種Tri-1、Tri-2，于2001年通過(guò)湖南省種子管理站專(zhuān)家現(xiàn)場(chǎng)評(píng)議，2003年通過(guò)湖南省品種登記并公布[10]。潘昌立等[11]以0.10%～0.40%秋水仙素水溶液處理子葉期實(shí)生苗莖尖，平均誘導(dǎo)率達(dá)到了9.04%。但目前未見(jiàn)使用甲基磺酸乙酯(EMS)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、氨磺靈(Oryzalin)、馬來(lái)酰肼(MH)對(duì)苧麻種子進(jìn)行誘變的報(bào)道。本試驗(yàn)基于前人對(duì)化學(xué)誘變育種的研究，采用不同濃度的EMS、5-BU、Oryzalin、MH對(duì)苧麻種子進(jìn)行不定向誘導(dǎo)，研究其對(duì)種子萌發(fā)的影響，探究最佳處理時(shí)間與誘變劑量組合，旨在為后續(xù)使用化學(xué)誘變劑進(jìn)行苧麻種子誘變研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料:湘苧三號(hào)苧麻種子，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所提供。

化學(xué)誘變劑:甲基磺酸乙酯(EMS)、5-溴尿嘧啶(5-BU)、氨磺靈(Oryzalin)、馬來(lái)酰肼(MH)均購(gòu)買(mǎi)自sigma-aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)方法

選取質(zhì)量均勻一致的種子，采用蒸餾水浸種2 h后再進(jìn)行化學(xué)藥劑浸泡處理。EMS處理體積百分濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.2%，5-BU處理質(zhì)量百分濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，Oryzalin處理質(zhì)量濃度為20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L，MH處理質(zhì)量百分濃度為 0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%、0.18%，處理時(shí)間為2、24、48 h，每處理 3次重復(fù)，每重復(fù) 300粒苧麻種子。處理結(jié)束后，用蒸餾水洗滌3次，將種子平鋪于放有濾紙的培養(yǎng)皿中，放置在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，保持種子濕潤(rùn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

以胚根露出種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)(第12天)、發(fā)芽率(第20天)。

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(%)=處理的發(fā)芽勢(shì)/對(duì)照發(fā)芽勢(shì)×100%

相對(duì)發(fā)芽率(%)=處理的發(fā)芽率/對(duì)照的發(fā)芽率×100%

相對(duì)致死率(%)=(1-處理的發(fā)芽率/對(duì)照的發(fā)芽率)×100%

誘變劑的半致死濃度(LCt50)是指在一定時(shí)間內(nèi)引起50%植株死亡的藥物濃度，本試驗(yàn)以苧麻種子相對(duì)發(fā)芽率為指標(biāo)計(jì)算相對(duì)致死率，以此作為誘變劑的半致死濃度和處理時(shí)間，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

從表1可看出，EMS處理后的苧麻種子萌發(fā)情況依處理時(shí)間與處理濃度的變化而變化。在相同處理時(shí)間內(nèi)，隨著處理濃度的增加相對(duì)發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)；在濃度為0.8%與1.0%時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，相對(duì)發(fā)芽率整體呈下降趨勢(shì)。在處理時(shí)間為2 h與48 h時(shí)，各濃度EMS處理苧麻種子的萌發(fā)均受到抑制；而在24 h處理后，濃度為0.1%、0.2%和0.4%的EMS處理組的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率均有提高，說(shuō)明在24 h處理下，較低濃度的EMS處理可提高苧麻種子發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率。處理48 h后，0.8%和1.0%處理濃度對(duì)苧麻種子萌發(fā)完全抑制，說(shuō)明在較高濃度EMS較長(zhǎng)時(shí)間處理后，苧麻種子的萌發(fā)受到嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致種子死亡。1.0%EMS處理苧麻種子2 h，相對(duì)致死率為51.60%；0.8%EMS處理苧麻種子24 h，相對(duì)致死率為57.89%；0.4%EMS處理苧麻種子48 h，相對(duì)致死率為40.98%。這3個(gè)處理的半致死劑量都接近50%，試驗(yàn)中可根據(jù)要求進(jìn)行自由選擇，本試驗(yàn)結(jié)果推薦采用1.0%EMS處理苧麻種子2 h為最佳處理組合。

表1 EMS處理對(duì)苧麻種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of EMS on seed germination of ramie

2.2 5-BU不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

從表2可看出，5-BU處理對(duì)苧麻種子的萌發(fā)起到抑制作用。在相同處理時(shí)間內(nèi)，隨著處理濃度的增加相對(duì)發(fā)芽率下降；在處理濃度為1.5%和2.0%時(shí)，相對(duì)發(fā)芽勢(shì)隨處理時(shí)間的增加先增加后減少。5-BU處理濃度為1.5%和2.0%時(shí)，48 h處理組相對(duì)發(fā)芽率較24 h處理組低，但高于2 h處理組。48 h與2.5%濃度處理組中種子的萌發(fā)完全受到抑制。說(shuō)明在較低濃度(1.0%)或較短處理時(shí)間(24 h)內(nèi)，5-BU對(duì)苧麻種子萌發(fā)的抑制作用隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小，而較高濃度或較長(zhǎng)時(shí)間處理后，該現(xiàn)象逐漸消失。2.5%5-BU處理2 h的相對(duì)致死率為44.55%，可推薦為最佳處理組合。

表2 5-BU處理對(duì)苧麻種子發(fā)芽的影響Table 2 Effects of 5-BU on seed germination of ramie

2.3 Oryzalin不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

由表3可看出，Oryzalin處理可以抑制苧麻種子萌發(fā)。相同處理時(shí)間內(nèi)，種子相對(duì)發(fā)芽率隨著處理濃度增加而下降；相同處理濃度下，種子相對(duì)發(fā)芽率同樣隨著處理時(shí)間增加而下降。說(shuō)明Oryzalin對(duì)苧麻種子萌發(fā)的抑制作用隨著處理濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，并在處理時(shí)間為48 h、處理濃度為25 mg/L和30 mg/L時(shí)完全抑制種子萌發(fā)。25 mg/L的Oryzalin與24 h處理組合相對(duì)致死率為52.05%，可推薦為最佳處理組合。

表3 Oryzalin處理對(duì)苧麻種子發(fā)芽的影響Table 3 Effects of Oryzalin on seed germination of ramie

2.4 MH不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

由表4可知，MH可以影響苧麻種子的發(fā)芽率。在處理濃度為24 h與48 h時(shí)，相同處理時(shí)間內(nèi)，隨著處理濃度的增加相對(duì)發(fā)芽率下降；在相同濃度處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)芽率下降。MH濃度在0.03%～0.06%時(shí)，2 h和48 h處理的苧麻種子相對(duì)發(fā)芽率隨濃度的增加而增加；當(dāng)MH濃度在0.12%～0.18%時(shí)，24 h和48 h處理的苧麻種子相對(duì)發(fā)芽率隨濃度的增加而減少。而MH 24 h處理中，苧麻種子相對(duì)發(fā)芽率會(huì)隨MH濃度的增加而減少。綜合考慮，采用MH進(jìn)行苧麻種子誘變，需要采用較高藥劑濃度和較長(zhǎng)處理時(shí)間才能達(dá)到半致死劑量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.12%MH處理48 h的相對(duì)致死率為50.82%，可推薦為最佳處理組合。

表4 MH處理對(duì)苧麻種子發(fā)芽的影響Table 4 Effects of maleic hydrazide on seed germination of ramie

3 討論

化學(xué)藥劑誘導(dǎo)植物基因突變是開(kāi)發(fā)新種質(zhì)的有效途徑之一，為獲得理想誘變結(jié)果，確定適宜的誘變劑量十分必要。本試驗(yàn)探究4種化學(xué)誘變劑對(duì)苧麻種子萌發(fā)的影響，以尋找這4種誘變劑最佳處理時(shí)間與處理濃度組合。由于苧麻種子本身發(fā)芽率并不高，為使數(shù)據(jù)更直觀明了，本試驗(yàn)采用分析其相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率以及相對(duì)致死率的方法。

EMS是一種常用的烷化劑，在作物誘變育種中有著積極作用[12]，可通過(guò)烷化鳥(niǎo)嘌呤而改變DNA結(jié)構(gòu)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，EMS處理2 h和48 h后的苧麻種子發(fā)芽率均低于對(duì)照組，且發(fā)芽率隨著處理濃度的增加而下降，苧麻種子萌發(fā)受到了顯著的抑制作用。吳思遠(yuǎn)等[14]的研究同樣表明，EMS對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用隨著濃度的增加而增大，但在處理時(shí)間為24 h的處理中，處理體積百分濃度為0.10%～0.40%時(shí)，對(duì)種子的萌發(fā)有著不同程度的促進(jìn)作用。秦思思等[15]的研究表明，體積百分濃度為0.4%的EMS浸種16 h和24 h對(duì)醉魚(yú)草種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用。相關(guān)研究[16]表明，很多基因都參與植物種子萌發(fā)的調(diào)控，EMS誘變可能會(huì)對(duì)這些基因產(chǎn)生影響，從而激發(fā)抑制種子萌發(fā)的基因或改變種子萌發(fā)基因的表達(dá)。1.0%體積百分濃度的EMS處理2 h的相對(duì)致死率為51.60%，最接近半致死，推薦1.0%EMS處理2 h為最優(yōu)半致死劑量和處理時(shí)間。

5-BU是堿基類(lèi)似物類(lèi)型的化學(xué)誘變劑。Kiichi等[17]用BU在25°C時(shí)的飽和溶液和半飽和溶液處理水稻品種“Ginbozu”的風(fēng)干種子，所有處理的平均種子育性都低于對(duì)照，BU處理的平均育性最低為75.6%，比對(duì)照低8.2%，M2植株抽穗期的誘變頻率為0.67%～4.87%，說(shuō)明BU處理后誘發(fā)水稻農(nóng)藝性狀變異的頻率相當(dāng)高。本研究中5-BU各處理時(shí)間與濃度處理組的苧麻種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均有下降，苧麻種子的萌發(fā)受到明顯抑制。在2.5%質(zhì)量百分濃度處理48 h后苧麻種子完全喪失發(fā)芽能力。鄭改笑等[18]的研究表明，5-BU誘變使寒蘭再生株的部分基因組擴(kuò)增條帶缺失，堿基類(lèi)似物5-BU可能導(dǎo)致苧麻種子的部分基因片段被改變，從而對(duì)種子萌發(fā)造成不利影響，2.5%質(zhì)量百分濃度5-BU處理2 h的組合相對(duì)致死率為44.55%，是最接近半致死的處理組合，雖然在48 h處理下，2.0%～2.5%質(zhì)量百分濃度的5-BU也可找到半致死劑量，但在濃度相差不大的情況下，2 h處理時(shí)間較短，所以推薦2.5%5-BU處理2 h為最優(yōu)半致死劑量和處理時(shí)間。

Oryzalin可使植物染色體加倍[19]，低毒且具有良好的多倍體誘變效果[20]。陳娟娟[21]用0.05 g/L Oryzalin處理郁金香種子10 d，相對(duì)萌發(fā)率為40%，在相同濃度下，隨著處理時(shí)間增加，萌發(fā)率下降，在相同處理時(shí)間，藥劑濃度增加萌發(fā)率下降。這與本研究結(jié)果相近。本研究中Oryzalin處理苧麻種子可以顯著抑制其萌發(fā)。Oryzalin處理濃度一定時(shí)，處理時(shí)間延長(zhǎng)則抑制作用增強(qiáng)；處理時(shí)間一定時(shí)，藥劑處理濃度增大則抑制作用增強(qiáng)。張競(jìng)秋等[21]用Oryzalin處理小麥種子，觀察到小麥根尖細(xì)胞出現(xiàn)染色體加倍和不均等分裂、橋等染色體畸變現(xiàn)象，推測(cè)Oryzalin導(dǎo)致的染色體變異可加速細(xì)胞凋亡，25 mg/L的Oryzalin處理24 h組合的相對(duì)致死率為52.05%，最接近半致死，推薦其為最優(yōu)半致死劑量和處理時(shí)間。

MH是一種抗生長(zhǎng)素類(lèi)的生物調(diào)節(jié)劑[23]，可延長(zhǎng)種子休眠期、抑制發(fā)芽等[23]。劉海英等[26]的研究表明，MH提高了小麥相對(duì)雄性不育率，且隨處理濃度升高效應(yīng)增強(qiáng)。本研究中，0.06%～0.18%質(zhì)量百分濃度MH處理苧麻種子24 h和48 h后，種子萌發(fā)均受到抑制，隨著處理濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。MH對(duì)植物的核酸和蛋白質(zhì)的代謝過(guò)程可造成干擾[23]，在本研究中MH可能對(duì)苧麻種子萌發(fā)過(guò)程中所需要的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生抑制作用，從而影響種子的萌發(fā)。0.12%質(zhì)量百分濃度MH處理48 h后相對(duì)致死率為50.28%，最接近半致死，推薦其為最優(yōu)半致死劑量和處理時(shí)間。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了EMS、5-BU、Oryzalin和MH對(duì)種子萌發(fā)影響的規(guī)律，初步篩選出較合適的半致死濃度和處理時(shí)間，1.0%EMS處理苧麻種子2 h，2.5%5-BU處理2 h，25 mg/L Oryzalin處理24 h，0.12%MH處理48 h，是4種藥劑的最佳處理組合。本研究為苧麻化學(xué)誘變育種提供了最佳的誘變條件，即半致死濃度和處理時(shí)間，這為進(jìn)一步采用化學(xué)誘變育種提供了基礎(chǔ)，為種質(zhì)資源創(chuàng)新、創(chuàng)建新性狀和新基因提供了條件，也為飽和基因庫(kù)構(gòu)建、基因功能分析、基因定位等提供了條件。