胡海洋 應(yīng)婉琴 何軍 呂芷賢 謝小平 鄧仲良

（1. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫系，衡陽 421001；2. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院，衡陽 421001 3. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，衡陽 421001）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）是引起社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的重要病原體［1］，主要通過呼吸道飛沫傳播，傳染性強(qiáng)［2］。肺炎支原體肺炎一般起病緩慢，潛伏期較長(zhǎng)，約為1-3周。臨床癥狀主要有發(fā)熱、流感樣癥狀，如鼻塞、流涕、肌肉酸痛、乏力、咽痛、咳嗽和胸痛等，還可引發(fā)呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥和肺外并發(fā)癥，造成機(jī)體多系統(tǒng)損傷，如壞死性肺炎、胸腔積液、支氣管哮喘、皮膚損害、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等［3-4］。若不能早期快速診斷，延誤治療，可加重病情，嚴(yán)重患者可發(fā)生死亡，因此建立肺炎支原體早期快速診斷的方法，對(duì)于肺炎支原體的治療和控制支原體肺炎的流行具有十分重要的意義。

肺炎支原體的鑒定包括分離培養(yǎng)、抗體檢查、分子生物學(xué)等方法。分離培養(yǎng)是診斷肺炎支原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于支原體培養(yǎng)和形態(tài)觀察困難，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，檢出率較低，已不能滿足臨床快速診斷需要［5-6］?？贵w檢查方法包括ELISA、熒光抗體試驗(yàn)等，檢查簡(jiǎn)單、快速和敏感，但靈敏度較低，在健康人群中出現(xiàn)高背景的干擾性抗體，存在非特異性的交叉反應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致一定的假陽性結(jié)果［7］，不能用于支原體早期篩查，適應(yīng)用于肺炎支原體感染的回顧性調(diào)查。分子生物學(xué)是檢測(cè)肺炎支原體核酸最主要檢查方法，包括PCR、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。由于基于PCR的一系列檢測(cè)方法（常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR）檢測(cè)程序復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要熱循環(huán)儀儀器，成本較高，對(duì)試驗(yàn)技術(shù)條件要求較高，且受儀器、設(shè)備和電力以及空間等諸多因素的限制，不利于快速檢測(cè)以及在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用［8-9］。與其他的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)大大縮短了反應(yīng)時(shí)間、降低了對(duì)儀器的依賴［10］。常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［11］、重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）［12］、依賴核酸序列擴(kuò)增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）［13］、鏈替代擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）［14］、滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）［15］等。目前，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種檢測(cè)病原體的研究，如葡萄卷葉伴隨病毒3、鮑曼不動(dòng)桿菌、沙眼衣原體等［16-18］，這些快速檢測(cè)方法的建立為開發(fā)新的診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

酶促重組等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（enzymatic recombinase amplification，ERA）是一種新型等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，是RPA技術(shù)的改良版本［19］。ERA技術(shù)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，相比于普通PCR（反應(yīng)時(shí)間1.5 h）［20］，LAMP（反應(yīng)時(shí)間 1 h）［21］，ERA 技術(shù) 15-20 min 即可完成檢測(cè)。此外，該方法重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，無需專業(yè)背景的操作人員，也不需要大型精密儀器，僅需要便攜式熒光儀即可。目前，還尚未發(fā)現(xiàn)將該方法運(yùn)用到肺炎支原體檢測(cè)的研究。因此，本研究基于ERA技術(shù)建立快速檢測(cè)肺炎支原體的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法，利用ERA技術(shù)對(duì)肺炎支原體P1基因進(jìn)行擴(kuò)增，在反應(yīng)體系中引入熒光探針，用熒光儀對(duì)發(fā)出的熒光進(jìn)行分析檢測(cè)。在保證痕量高靈敏度、高特異性檢測(cè)的情況下，極大的降低對(duì)時(shí)間及環(huán)境的要求，使得利用基因分子檢測(cè)技術(shù)建立快速、低耗的社區(qū)肺炎支原體核酸檢測(cè)技術(shù)成為可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和臨床標(biāo)本 肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29342）由南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病毒所提供；34份發(fā)熱呼吸道候癥群臨床病例的咽拭子標(biāo)本由南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.1.2 儀器和試劑 ERA熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（蘇州先達(dá)基因科技有限公司）、QIAamp DNA提取試劑盒（QIAGEN GmbH）、肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒（圣湘生物科技股份有限公司）、ABI 7500熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific）

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫檢索并下載肺炎支原體保守基因P1的基因組（＞NC_000912.1：180858-182404），ERA引物和探針設(shè)計(jì)與常規(guī)PCR不同，根據(jù)以下參數(shù)，使用在線軟件Primer BLAST設(shè)計(jì)引物和探針：引物長(zhǎng)度為30-35個(gè)核苷酸；Tm值為50-75℃；GC含量為30%-70%；探針長(zhǎng)度為46-52個(gè)核甘酸，其中至少30個(gè)位于THF位點(diǎn)的5'端，另外至少15個(gè)位于其3'端；熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)只能標(biāo)記在胸腺嘧啶（T）上，且熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)間距在2-5個(gè)堿基；THF為替換位于熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的某堿基；且探針的3'端需加上阻斷基團(tuán)。引物和探針均盡可能避免引物二聚體。使用BLAST分析引物和探針特異性，確保與其他病原體不會(huì)發(fā)生錯(cuò)配。詳情如表1和圖1所示。所有寡核苷酸引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 ERA實(shí)時(shí)熒光法引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences of ERA real-time fluorescence method

圖1 ERA實(shí)時(shí)熒光法引物和探針序列Fig. 1 Primers and probe sequences for ERA real-time fluorescence method

1.2.2 核酸提取 使用QIAamp DNA提取試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床樣本進(jìn)行核酸提取，-80℃保存。

1.2.3 ERA實(shí)時(shí)熒光法快速檢測(cè)肺炎支原體方法的建立 向內(nèi)含重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、鏈置換DNA聚合酶凍干粉的反應(yīng)管中加入50 μL的反應(yīng)體系，包括21.2 μL的水，20 μL的溶解劑，10 μmol/L的正向引物和反向引物各2.1 μL，0.6 μL的探針（10 μmol/L），2 μL 的模板和 2 μL 激活劑。其中，2 μL的激活劑加在反應(yīng)管蓋中，通過短暫離心使激活劑進(jìn)入預(yù)混合液中，再次快速離心。迅速將離心后的反應(yīng)管放入事先調(diào)好程序的qPCR儀中，在37℃孵育20 min，每分鐘監(jiān)測(cè)一次熒光，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)態(tài)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.4 ERA系統(tǒng)條件優(yōu)化 針對(duì)肺炎支原體P1基因，分別設(shè)計(jì)兩條上游引物和下游引物，分別用F1、F2、R1、R2表示，并交叉配對(duì)為4組引物對(duì)，將不同的引物對(duì)加入反應(yīng)體系，通過熒光曲線觀察優(yōu)化結(jié)果；選定最佳引物后，觀察不同的反應(yīng)溫度（25℃、30℃、35℃、40℃）對(duì)反應(yīng)體系的影響。每次反應(yīng)中肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株模板濃度為105copies/μL，以無酶水作為陰性對(duì)照。

1.2.5 敏感性檢測(cè) 確定一段包含上下游引物在內(nèi)的肺炎支原體部分序列，將其克隆至pUC57載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋至終濃度為106、105、104、103、102、101、100copies/μL， 用 建立好的ERA實(shí)時(shí)熒光法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以無酶水作為陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

1.2.6 特異性檢測(cè) 用建立好的ERA實(shí)時(shí)熒光法分別對(duì)肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，AB）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAE）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SAU）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，HIB）、鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci，Cps）和肺炎支原體（MP）進(jìn)行檢測(cè)，病原體的模板濃度均為105copies/μL，以無酶水作為陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.2.7 臨床樣本驗(yàn)證 收集肺炎支原體感染者和健康人的樣本共34例，同時(shí)用ERA熒光法和肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）檢測(cè)，同時(shí)以無酶水作為陰性對(duì)照。以熒光定量PCR法的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)基于ERA實(shí)時(shí)熒光法的診斷敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。

2 結(jié)果

2.1 ERA實(shí)時(shí)熒光法的建立和條件優(yōu)化

用本研究建立的ERA實(shí)時(shí)熒光法同時(shí)對(duì)肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株和陰性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照的熒光曲線無變化，幾乎保持水平狀態(tài)，而肺炎支原體產(chǎn)生的熒光曲線在10 min左右起峰迅速，反應(yīng)20 min時(shí)幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)，熒光值遠(yuǎn)超過陰性對(duì)照（NTC）產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，表明該方法具有可行性（圖2-A）。隨后，分別用4組引物對(duì)P1基因進(jìn)行ERA實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示由F2R1組成的引物對(duì)相較于其他引物對(duì)（F1R1、F1R2、F2R2）起峰速度快，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度高，與陰性結(jié)果之間的差異更為顯著，因此將F2R1作為后續(xù)研究的引物對(duì)用于ERA實(shí)時(shí)熒光法快速檢測(cè)肺炎支原體（圖2-B）。接下來，又分別對(duì)25℃、30℃、35℃、40℃這4個(gè)溫度進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果顯示該方法的溫度適用范圍廣，在25-40℃均可以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，完成對(duì)肺炎支原體的檢測(cè)；當(dāng)反應(yīng)溫度為25℃時(shí)，反應(yīng)速度最為緩慢，熒光曲線在15 min內(nèi)幾乎無變化，隨后熒光值才緩慢上升；其他3個(gè)溫度（30℃、35℃、40℃）幾乎同時(shí)起峰，其中30℃時(shí)的反應(yīng)速度較慢，熒光值也略低，35℃和40℃在反應(yīng)初期熒光曲線就明顯上升，40℃溫度下的曲線比35℃反應(yīng)略快些，但由于在該條件下反應(yīng)18 min后熒光值明顯下降，此時(shí)35℃下的熒光曲線仍保持穩(wěn)定狀態(tài)（圖2-C），因此選擇35℃作為ERA實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)肺炎支原體的最佳反應(yīng)溫度。

圖2 ERA實(shí)時(shí)熒光法的建立（A）和條件優(yōu)化（B-C）Fig. 2 Establishment（A）and condition optimization（B-C）of ERA real-time fluorescence method

2.2 敏感性分析

將建立好的ERA實(shí)時(shí)熒光法對(duì)10倍梯度稀釋的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，該方法對(duì)肺炎支原體質(zhì)粒的檢出限為103copies/μL（圖3）。

圖3 ERA實(shí)時(shí)熒光法敏感性分析Fig. 3 Sensitivity analysis via ERA real-time fluorescence method

2.3 特異性分析

對(duì)肺炎支原體和其他6種呼吸道病原體（KPN、AB、PAE、SAU、HIB和Cps）運(yùn)用已建立好的ERA實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行快速檢測(cè)，結(jié)果如圖4顯示，只有肺炎支原體產(chǎn)生熒光曲線，完成快速擴(kuò)增，而其他病原體均無擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，與陰性結(jié)果保持一致，表明該方法特異性好，與其他病原體無交叉反應(yīng)。

圖4 ERA實(shí)時(shí)熒光法特異性分析Fig. 4 Specificity analysis via ERA real-time fluorescence method

2.4 臨床樣本驗(yàn)證

為驗(yàn)證ERA實(shí)時(shí)熒光法與熒光定量PCR法的符合程度，同時(shí)用這兩種方法對(duì)34例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，以熒光定量PCR法的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，ERA實(shí)時(shí)熒光法的檢測(cè)結(jié)果如圖5（圖中水平虛線為檢出限閾值）所示，8例陰性樣本（-1--8）的結(jié)果均為陰性，26例陽性樣本（1-26）中得到25個(gè)陽性結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)（表2），ERA實(shí)時(shí)熒光法的診斷敏感度為96.15%（25/26）、診斷特異度為100%（8/8）、陽性預(yù)測(cè)值為100%（25/25）、陰性預(yù)測(cè)值為88.89%（8/9），說明ERA實(shí)時(shí)熒光法跟標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR方法陽性和陰性預(yù)測(cè)值有很好的一致性。

表2 ERA實(shí)時(shí)熒光法與熒光定量PCR法的比較Table 2 Comparison between ERA real-time fluorescence method and fluorescence qPCR method

圖5 ERA實(shí)時(shí)熒光法的臨床樣本驗(yàn)證Fig. 5 Clinical sample validation via ERA real-time fluorescence method

3 討論

肺炎支原體是是兒童社區(qū)獲得性呼吸道感染、尤其是非典型肺炎的重要病原體，臨床癥狀以咳嗽、發(fā)熱、咽喉痛和肌肉疼為主［22］，與腺病毒、流感病毒、SRAS等其他呼吸道病毒相似，易漏診和誤診。分離培養(yǎng)是診斷肺炎支原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但肺炎支原體屬于苛養(yǎng)菌，生長(zhǎng)條件要求高，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，已不能滿足臨床快速診斷需要［23］?？贵w的產(chǎn)生需要窗口期，因此抗原抗體反應(yīng)不能用于支原體早期篩查［24］。PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，但對(duì)儀器、環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員要求較高，操作復(fù)雜［25］。因此，建立一種肺炎支原體早期快速簡(jiǎn)單的新診斷方法尤為重要。

肺炎支原體基因組有4組重復(fù)序列，其中，肺炎支原體的黏附相關(guān)蛋白P1包含了3組，分別是RepMP2/3，RepMP4 和 RepMP5［26］，其高度保守性適用于肺炎支原體的核酸診斷。因此，本研究選擇肺炎支原體P1基因RepMP4區(qū)的部分片段作為靶基因來建立ERA實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行快速核酸檢測(cè)，通過熒光觀察來優(yōu)化反應(yīng)條件，評(píng)價(jià)其敏感性和特異性，并對(duì)臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果表明本研究建立的ERA實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)肺炎支原體可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，起峰時(shí)間在10 min左右，20 min后反應(yīng)幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)，相較于RPA、LAMP、SEA的起峰時(shí)間分別是14 min、70 min和22 min［27-29］，該方法進(jìn)一步提高了反應(yīng)速度，減少了檢測(cè)時(shí)間，可滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求；敏感性分析利用肺炎支原體構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行確定，通過ERA實(shí)時(shí)熒光法對(duì)梯度稀釋的質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，該方法對(duì)肺炎支原體的檢出限為103copies/μL，與LAMP檢測(cè)肺炎支原體的結(jié)果一致［30］，遠(yuǎn)高于SEA技術(shù)的敏感性［29］。雖然ERA實(shí)時(shí)熒光法的檢出限低于實(shí)時(shí)熒光PCR法，但較高的閾值可防止由于檢測(cè)方法過于敏感而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；對(duì)肺炎支原體和其他6種呼吸道病原體進(jìn)行ERA實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)，除肺炎支原體外，其他病原體均為陰性結(jié)果，未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，顯示了該方法對(duì)肺炎支原體的特異性；以熒光定量PCR結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)34分臨床樣本進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，檢測(cè)出25份陽性結(jié)果，9份陰性結(jié)果，該方法的診斷敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為96.15%、100%、100%、88.89%，與RTFQ-PCR的檢測(cè)效能相當(dāng)［31］。

盡管ERA實(shí)時(shí)熒光法可以快速、敏感、特異地檢測(cè)出肺炎支原體，但該方法的探針設(shè)計(jì)復(fù)雜，價(jià)格較貴，且在高溫條件下的結(jié)果不太穩(wěn)定，產(chǎn)生“跳躍”現(xiàn)象，有待進(jìn)一步探究與完善。綜上，本研究建立的ERA實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)肺炎支原體具有檢測(cè)周期短、敏感性好、特異性高的特點(diǎn)，還可以在常溫下進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，僅需一臺(tái)熒光儀即可。此外，該方法操作簡(jiǎn)單，非專業(yè)人員也可以完成檢測(cè)，滿足現(xiàn)場(chǎng)檢查的需求，使得利用基因分子檢測(cè)技術(shù)建立快速低耗的社區(qū)肺炎支原體核酸檢測(cè)技術(shù)成為可能。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)肺炎支原體P1基因設(shè)計(jì)并建立了ERA實(shí)時(shí)熒光法，并應(yīng)用于肺炎支原體的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2R1引物對(duì)的擴(kuò)增效果最佳，在35℃條件下反應(yīng)20 min即可達(dá)到平臺(tái)期，反應(yīng)敏感性為103copies/μL，與其他病原體無交叉反應(yīng)，臨床診斷敏感度、診斷特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為96.15%、100%、100%、88.89%，表明該方法具有快速簡(jiǎn)單，敏感性好，特異性高等特點(diǎn)。