楊小峰 秦小偉 郭澤媛 呂麗華

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2. 忻州師范學(xué)院生物系，忻州 034000）

卵巢中的顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）是卵泡形成和發(fā)育過(guò)程中的主要功能細(xì)胞，能為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟提供必要的營(yíng)養(yǎng)和RNAs，自身也進(jìn)行著增殖和分化，因此，探究顆粒細(xì)胞增殖和分化的影響因素對(duì)雌性繁殖性能的提高有很重要的意義。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是植物中常見(jiàn)的一類多酚化合物，是公認(rèn)的天然抗氧化劑，通常以黃烷-3-醇單體為基本單位構(gòu)成聚合體［1］。自然界中原花青素來(lái)源較廣，沙棘果、藍(lán)莓、葡萄籽、火龍果、黑玉米、黑枸杞等植物中原花青素含量較為豐富［2-3］。原花青素具有很強(qiáng)的清除自由基、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)血脂等生理活性［4-5］。有研究表明，原花青素能促進(jìn)雌性生殖干細(xì)胞的增殖［6］。細(xì)胞的增殖受細(xì)胞周期相關(guān)基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。細(xì)胞周期調(diào)控分子包括細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKI）三大類。氨基末端結(jié)構(gòu)及功能高度相似的p21和p27都是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKIs）。p21蛋白可通過(guò)抑制CDK活性而阻滯細(xì)胞進(jìn)入S期，p27則是通過(guò)與CyclinD-CDK4或CyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合在靜止細(xì)胞和G1期細(xì)胞發(fā)揮作用［7］。p21、p27基因表達(dá)量上調(diào)可以引起周期阻滯在G1期［8］。半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制中居關(guān)鍵地位［9］。在Fas引發(fā)的凋亡反應(yīng)中，半胱氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)式地活化，其中caspase-8的活化是第一步反應(yīng)?；罨蟮腸aspase-8會(huì)引發(fā)下游的caspase活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。

本試驗(yàn)旨在研究原花青素對(duì)體外培養(yǎng)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響，并找出促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖的最佳時(shí)間和最適濃度，在此濃度和時(shí)間下培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞周期相關(guān)基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量，以此進(jìn)一步佐證原花青素對(duì)體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)以山西省太谷縣綿羊屠宰場(chǎng)性成熟綿羊的健康卵巢為研究對(duì)象。本試驗(yàn)使用的主要試劑 為 ：PC（Solarbio）、MTT 試 劑 盒（Solarbio）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）、TB Green?TMPremix Ex TaqTMⅡ 試 劑 盒（TaKaRa）、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMSO、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、雙抗、PBS、臺(tái)盼藍(lán)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 綿羊卵巢顆粒細(xì)胞的收集 將在屠宰場(chǎng)采集的卵巢浸泡在滅菌的杜氏磷酸緩沖鹽溶液（DPBS）中，置于冰上迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。用滅菌過(guò)的眼科剪剪離卵泡，選取大小適中的卵泡（3 mm＜直徑＜5 mm）在75%的酒精中浸洗幾秒，轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)中。剪開(kāi)卵泡，用刮刀刮卵泡內(nèi)壁，將刮取的顆粒細(xì)胞收集至培養(yǎng)基中。用細(xì)胞過(guò)濾篩過(guò)濾，去除雜質(zhì)。收集含有顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)液，在4℃，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并在37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2.1.2 活細(xì)胞密度測(cè)定 顆粒細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿約80%-90%時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞3-5 min，終止消化后離心，棄上清，再用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液用等體積0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色1 min，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞濃度。用完全培養(yǎng)液稀釋并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度約為5×104個(gè)/mL。

1.2.2 MTT試驗(yàn) 將上述細(xì)胞懸液接種至3個(gè)96孔板中，每孔200 μL，每孔大約1×104個(gè)細(xì)胞。剩余細(xì)胞冷凍保存，備用。將96孔板置于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)量大約到整個(gè)孔的50%左右時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，添加含有不同濃度（20、30、40、50、60、70和 80 μg/mL）PC的完全培養(yǎng)液并設(shè)置對(duì)照組（0 μg/mL），每個(gè)濃度的培養(yǎng)孔做3個(gè)重復(fù)，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。吸去上清液，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。再次棄去培養(yǎng)液，每孔加入110 μL Formazan溶解液，低速震蕩10-15 min，使結(jié)晶物溶解充分。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，震蕩15 s，然后在490 nm測(cè)量吸光值（OD值）［11］，OD值的高低可間接反映細(xì)胞數(shù)量多少。

1.2.3 增殖基因表達(dá)量的檢測(cè)

1.2.3.1 總RNA的提取 將1.2.2冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇后接種到6孔板中，細(xì)胞分為對(duì)照組（A組）和實(shí)驗(yàn)組（B組），每組3個(gè)重復(fù)（A1、A2、A3/B1、B2、B3），繼續(xù)在 37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng) 48 h。棄去原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組（B組）添加濃度為50 μg/mL PC的完全培養(yǎng)基（依據(jù)1.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果），同時(shí)，對(duì)照組（A組）添加不含PC的完全培養(yǎng)基。然后用 Trizol法提取總 RNA［12］。

1.2.3.2 cDNA的合成 將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（A1、A2、A3/B1、B2、B3）按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)分兩步進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。第一步，去除基因組DNA反應(yīng)，按照以下體系配制反應(yīng)液 ：1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL RNA，RNase Free dH2O 定容到 10 μL。反應(yīng)條件為42℃，2 min，然后置于冰上。第二步，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在第一步反應(yīng)液的基礎(chǔ)上依次加入下列液體 ：1 μL PrimeScript RT Enzyme MixI，1 μL RT Prime Mix，4 μL 5×PrimeScript Buffer2，4 μL RNase Free dH2O，共計(jì)20 μL。反應(yīng)條件為37℃，15 min；85℃，5 s；然后置于冰上。反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)產(chǎn)物純度以及濃度，于-20℃冰箱備用。

1.2.3.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)NCBI上綿羊的預(yù)測(cè)序列（登錄號(hào)：XM027973596），利用Primer 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)目的基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成。以綿羊18S基因作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.3.4 RT-qPCR反應(yīng) 依據(jù)TB Green?TMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)，以cDNA為模板，構(gòu)建10 μL RT-qPCR反應(yīng)體系：PCR上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL，cDNA 模板 2 μL，RNase Free dH2O 2.2 μL。反應(yīng)條件為 95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后生成擴(kuò)增曲線、溶解曲線，利用其CT值分析結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)的方法。使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。RT-qPCR相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)數(shù)，各基因表達(dá)量均經(jīng)過(guò)內(nèi)參18S校正。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PC處理GCs不同時(shí)間后生長(zhǎng)狀況

培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組（A1）相比，添加一定濃度PC的實(shí)驗(yàn)組（B1、B2、B3）均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，濃度為50 μg/mL（B2）時(shí)細(xì)胞數(shù)量最多，增殖較為明顯。C為培養(yǎng)24 h，濃度為50 μg/mL時(shí)細(xì)胞數(shù)量圖，與對(duì)照組（A2）相比細(xì)胞數(shù)量增多，但是與培養(yǎng)48 h的B2圖相比，細(xì)胞數(shù)量較少。D為培養(yǎng)72 h，濃度為50 μg/mL時(shí)細(xì)胞數(shù)量圖，與對(duì)照組（A3）相比細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與培養(yǎng)48 h的B2圖相比，細(xì)胞數(shù)量有一定的增加（圖1）。

圖1 不同濃度PC處理體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞不同時(shí)間后的生長(zhǎng)狀況 （100×）Fig. 1 Growth status of sheep follicular granulosa cells in vitro cultured with different concentrations of PC for different time（100×）

2.2 MTT檢測(cè)不同濃度PC處理GCs不同時(shí)間后細(xì)胞數(shù)量變化

由圖2可知，體外培養(yǎng)綿羊顆粒細(xì)胞時(shí)，添加一定濃度的PC在一定時(shí)間內(nèi)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)培養(yǎng)基中PC濃度為50 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)24 h、48 h和72 h的OD值均為最大，細(xì)胞數(shù)量最多，24 h和48 h時(shí)顯著度高于其它濃度（P＜0.05）。隨著濃度的增高，對(duì)細(xì)胞促進(jìn)增殖效應(yīng)減弱。

圖2 不同濃度PC處理體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞24、48、72 h后的OD值Fig. 2 OD values of granulosa cells cultured in vitro after 24，48 and 72 h treatment with different concentration of PC

由于細(xì)胞處理48 h后的OD值較24 h高，且顯著度高于其它濃度（P＜0.05），因此后期實(shí)驗(yàn)組處理?xiàng)l件為PC濃度為50 μg/mL，處理48 h。

2.3 特定濃度PC處理GCs增殖相關(guān)基因表達(dá)差異

由圖3可知，在PC濃度為50 μg/mL時(shí)，體外培養(yǎng)綿羊顆粒細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27 mRNA的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），同時(shí)，半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族中的caspase-8 的mRNA表達(dá)量顯也顯著降低（P＜0.01）。

圖3 綿羊顆粒細(xì)胞中增殖相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Fig. 3 mRNA expression of proliferation-related genes in sheep granulosa cells

3 討論

原花青素是一種良好的抗氧化劑，其抗氧化能力比常見(jiàn)的抗氧化劑如VC、VE等還強(qiáng)［13］。原花青素具有抗腫瘤［14］、降血壓［15］、防治老年性疾病［16］、增強(qiáng)免疫功能［17］、抗輻射［18］等功效，還可以緩解女性更年期癥狀［19］。其在防止卵巢衰老中具有重要的作用，研究表明原花青素對(duì)生殖干細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，與長(zhǎng)壽基因SIRT1有關(guān)［6］。沉默信息調(diào)節(jié)因子相關(guān)酶類（sir2基因家族）是一類依賴于NAD+的高度保守去乙酰化酶，其同源性最高的同系物SIRT1參與調(diào)控哺乳動(dòng)物的生殖功能［20］。SIRT1可以依賴NAD+在C-末端賴氨酸-382殘基處的p53脫乙?；?，降低p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低下游蛋白質(zhì)的表達(dá)，如p21、p27等。通過(guò)去乙?；饔?，SIRT1可以抑制p53調(diào)控的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)DNA修復(fù)機(jī)制，促進(jìn)基因組完整性的維持，促進(jìn)細(xì)胞存活及增殖［6，21］。

caspase-8以酶原形式（procaspase-8）形式存在于許多組織中。procaspase-8由479個(gè)氨基酸構(gòu)成，8種同分異構(gòu)體中有2種有酶活性，能啟動(dòng)受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這2種酶原的N-端的兩個(gè)串聯(lián)的70個(gè)氨基酸左右死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與適配蛋白N-端的DED同源，所以procaspase-8可與FADD結(jié)合。在哺乳動(dòng)物中，caspase的活化途徑主要有細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)途徑［10］。在凋亡的細(xì)胞內(nèi)途徑中，效應(yīng)蛋白在線粒體外膜透性的信號(hào)級(jí)聯(lián)后被激活，導(dǎo)致膜間蛋白的釋放，促進(jìn)“凋亡小體”的形成，以及介導(dǎo)細(xì)胞死亡的caspases的激活；外部細(xì)胞凋亡依賴于死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）的形成，DISC通常包括FADD和caspase-8。在這兩種凋亡形式中，細(xì)胞的死亡都是通過(guò)效應(yīng)物caspase誘導(dǎo)的細(xì)胞水泡、DNA碎片化、磷脂酰絲氨酸外化和“凋亡小體”的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)的［22］。本研究表明，添加原花青素的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)顆粒細(xì)胞可以使得caspase-8表達(dá)量下調(diào)。

體內(nèi)研究表明，原花青素毒性較小，安全性較高。陳會(huì)從等［23］用原花青素對(duì)大鼠灌胃26周，劑量為 42、214、428 mg/（kg·d），大約相當(dāng)于人日用量的10、50、100倍，過(guò)程中試驗(yàn)動(dòng)物沒(méi)有不良反應(yīng)。停藥觀察幾周，未發(fā)現(xiàn)蓄積毒性反應(yīng)。Huang等［24］在研究葡萄籽原花青素對(duì)大鼠血壓的影響時(shí)，未報(bào)到有不良反應(yīng)。Rodriguez等［25］綜述了原花青素在動(dòng)物體內(nèi)毒性較小。本試驗(yàn)對(duì)體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)原花青素可以促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖，一定程度上填補(bǔ)了原花青素對(duì)離體細(xì)胞生理機(jī)能影響的研究空白。

研究表明，通過(guò)抑制SIRT1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞凋亡率和卵泡閉鎖數(shù)增多，造成卵巢功能下降［26］。在小鼠實(shí)驗(yàn)上發(fā)現(xiàn)可通過(guò)提高SIRT1的表達(dá)來(lái)提升卵泡的質(zhì)量與數(shù)量，達(dá)到延緩卵巢衰老的作用［27］。原花青素促進(jìn)雌性生殖干細(xì)胞增殖與其調(diào)控SIRT1對(duì)下游底物p53去乙酰化使之轉(zhuǎn)錄活性失活，進(jìn)而無(wú)法激活下游基因p21，其機(jī)制與SIRT1-p53-p21信號(hào)通路有關(guān)［6］。本研究從基因mRNA表達(dá)量水平做了分析，可以進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平作分析研究；此外，原花青素促進(jìn)GCs增殖的機(jī)理有待進(jìn)一步證實(shí)。

卵巢衰老表現(xiàn)為卵泡的不斷喪失和卵泡質(zhì)量持續(xù)下降，導(dǎo)致雌性動(dòng)物失去生育機(jī)能［28］。卵巢衰老及病變嚴(yán)重影響雌性動(dòng)物的生殖機(jī)能，而卵巢衰老與GCs的衰老和凋亡有密切的聯(lián)系。研究表明原花青素可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的卵泡顆粒細(xì)胞增殖，為抗卵巢衰老機(jī)能乃至促進(jìn)動(dòng)物繁殖提供一定的理論研究支持。

4 結(jié)論

添加一定濃度的原花青素可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖，培養(yǎng)48 h，在原花青素濃度為50 μg/mL時(shí)，促進(jìn)效果最明顯，顆粒細(xì)胞的增殖可能與周期相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的變化有關(guān)，其機(jī)制可能與SIRT1-p53-p21信號(hào)通路有關(guān)。雌性動(dòng)物的顆粒細(xì)胞在卵巢形成和發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，原花青素可能對(duì)雌性綿羊的生殖起到積極的作用。