孫威 張艷 王聿晗 徐僡 徐小蓉 鞠志剛

（1. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

花色素苷是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，其除可以賦予植物不同的色彩外，在抵御生物和非生物脅迫、激素轉(zhuǎn)運(yùn)等方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用［1］?；ㄉ剀盏纳锖铣稍诤芏嘀参镏幸呀?jīng)研究的很透徹，并且參與其合成的多種酶的功能也成功解析。但是，關(guān)于花色素苷的修飾酶，如糖基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和酰基轉(zhuǎn)移酶等的研究卻相對(duì)較少［2］。

類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）作為花色素苷生物合成末端的關(guān)鍵修飾酶，在增加花色素苷的穩(wěn)定性與多樣性方面發(fā)揮著重要作用［3］。研究顯示，3GT基因最早是從玉米中克隆獲得的，隨后在很多植物中被成功克隆并進(jìn)行了功能解析，如金魚(yú)草、龍膽和矮牽牛等［4-5］。關(guān)于3GT酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，其在催化過(guò)程中具有底物選擇性與區(qū)域特異性。例如，擬南芥與矮牽牛的3GT可以同時(shí)以花青素和黃酮醇為底物，但只催化其形成花青素和黃酮醇3-O-糖苷［6-7］；而香雪蘭的3GT則可以催化花青素不僅形成花青素3-O-糖苷，還形成花青素4’-O-糖苷和花青素7-O-糖苷［8］。有關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的晶體結(jié)構(gòu)與突變分析證明，位于其PSPG結(jié)構(gòu)域中的最后一個(gè)氨基酸的種類可以決定糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)糖基供體的選擇性［9-10］。因此，對(duì)不同植物的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行研究將有助于這一問(wèn)題的解決。

杜鵑花是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，也是世界著名的觀賞花卉，具有較高的觀賞和園林應(yīng)用價(jià)值［11］。但有關(guān)傳統(tǒng)名花杜鵑的花色代謝研究卻在很大程度上落后于百合、菊花等觀賞植物，這極大地限制了研究者對(duì)杜鵑的花色改良及其藥用和可食用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用。

前期研究發(fā)現(xiàn)，花青素3-O-糖苷在馬纓杜鵑花朵發(fā)育過(guò)程中含量一直最高，可達(dá)93.68%-96.31%，表明3GT在馬纓杜鵑花色形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，本文利用RT-PCR 技術(shù)克隆Rd3GT1基因，并將其轉(zhuǎn)入矮牽牛中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，隨后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定、花色素苷檢測(cè)及基因表達(dá)分析，初步解析了Rd3GT1 參與花色素苷合成的功能，為后續(xù)深入探究Rd3GT1的催化機(jī)制及其在馬纓杜鵑花色形成中的功能奠定基礎(chǔ)，也為杜鵑花生物技術(shù)育種提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

馬纓杜鵑花朵取至貴州省百里杜鵑國(guó)家森林公園的實(shí)驗(yàn)樣地，矮牽牛種子購(gòu)買于內(nèi)蒙古赤峰市鑫卉園藝有限公司；真核表達(dá)載體pBI121、大腸桿菌JM109菌株、農(nóng)桿菌GV3101菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA Marker等購(gòu)買于寶生物工程（大連）有限公司；矢車菊素3-O-葡萄糖苷和槲皮素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于綠源生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 以馬纓杜鵑花朵轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，利用 Primer Premier 5.0 軟件完成Rd3GT1基因克隆引物的設(shè)計(jì)（表1）。

表1 本文所用引物列表Table 1 Primers used in this study

1.2.2 Rd3GT1的克隆 利用RNA提取試劑盒完成馬纓杜鵑花朵總RNA的提取，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以此作為模板，Rd3GT1-F1與Rd3GT1-R1為引物進(jìn)行基因擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94℃8 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，膠回收，隨后與克隆載體pMD18-T 連接，轉(zhuǎn)化。挑取克隆進(jìn)行菌液PCR與酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證為陽(yáng)性的質(zhì)粒送生工生物工程股份有限公司測(cè)序確認(rèn)Rd3GT1的核苷酸序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用ProtParam軟件對(duì)Rd3GT1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，利用DNAMAN完成多序列比對(duì)分析，利用MEGA 7.0完成系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.4 Rd3GT1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 以測(cè)序正確的稀釋后的重組克隆載體pMD18-T-Rd3GT1質(zhì)粒為模板，Rd3GT-121F與Rd3GT-121R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，隨后利用Xba I與BamH I分別對(duì)目的基因與pBI121進(jìn)行酶切、膠回收、連接和轉(zhuǎn)化。經(jīng)菌液PCR與酶切驗(yàn)證后，送公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化 利用凍融法，將測(cè)序正確的真核表達(dá)載體pBI121-Rd3GT1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR與酶切驗(yàn)證正確后用于矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化。取正常生長(zhǎng)的矮牽牛葉片放入錐形瓶中，自來(lái)水沖洗半小時(shí)后，于無(wú)菌超凈臺(tái)中完成脫毒，隨后切成5 mm×5 mm大小，于pBI121-Rd3GT1（GV3101）菌液中浸泡10 min，取出葉片于濾紙上吸去多余的菌液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中分別進(jìn)行共培養(yǎng)、脫菌培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，待根長(zhǎng)大后轉(zhuǎn)移至土壤中繼續(xù)培養(yǎng)，直至植株開(kāi)花（表 2）。

表2 矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分Table 2 A variety of culture medium in the genetic transformation experiment of P. hybrida

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè) 取移栽至土壤中的矮牽牛的成熟葉片組織提取基因組，以Rd3GT1-F1與Rd3GT1-R1為引物，PCR驗(yàn)證Rd3GT1是否成功轉(zhuǎn)入矮牽牛中。待矮牽牛開(kāi)花后，取顏色表型具有明顯變化的花朵，提取RNA，通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證Rd3GT1是否在矮牽牛中成功表達(dá)。將擴(kuò)增出目的基因的植物標(biāo)記為轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因花朵中花色素苷與黃酮醇的檢測(cè) 取顏色表型明顯變化的轉(zhuǎn)基因植株花朵，于研缽中液氮條件下研磨，將0.1 g研磨充分的粉末轉(zhuǎn)至含有1 mL類黃酮提取液（H2O∶MeOH∶HCl= 75∶24∶1，V/V/V）的棕色瓶中，4℃黑暗條件下浸提12-14 h。次日4℃條件下12 000 r/min 離心5 min，取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后用于高效液相（HPLC）分析。HPLC的分析條件如下：流動(dòng)相A為5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，分析時(shí)間為60 min；具體洗脫條件 為 ：0-10 min，14%-17% B；10-35 min，17%-23% B；35-60 min，23%-47% B；60-67 min，47%-14% B；67-70 min，14% B。定量分析時(shí)，首先將矢車菊素3-O-葡萄糖和槲皮素3-O-葡萄糖苷配置成不同濃度梯度的溶液，利用HPLC繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)檢測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出樣品中花色素苷與黃酮醇的含量。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)分析 分別提取野生型與顏色表型明顯變化的轉(zhuǎn)基因花朵，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為基因表達(dá)分析的模板，以PhActin2為內(nèi)參基因，進(jìn)行Realtime PCR分析（引物序列見(jiàn)表1）。PCR程序如下：95℃ 60 s，95℃ 5 s，60℃ 60 s，40 個(gè)循環(huán)。程序結(jié)束后，分別通過(guò)溶解曲線與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因擴(kuò)增的特異性。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的分析。

2 結(jié)果

2.1 Rd3GT1的克隆

以馬纓杜鵑花朵cDNA為模板，Rd3GT1-F1與Rd3GT1-R1為引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，克隆獲得基因片段大小與目的基因大小一致為1 395 bp。隨后，經(jīng)測(cè)序證明，Rd3GT1克隆成功。

圖1 Rd3GT1 CDS的克隆Fig. 1 Cloning of Rd3GT1 CDS

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用ProtParam軟件對(duì)Rd3GT1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，Rd3GT1的總原子數(shù)為7 127 個(gè)，蛋白分子式為C2298H3565N603O647S14，蛋白分子質(zhì)量為50.44 kD，理論等電點(diǎn)為6.09，不穩(wěn)定系數(shù)為43.21，是一種不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 多序列比對(duì)分析 將Rd3GT1的氨基酸序列分別與擬南芥和矮牽牛的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，Rd3GT1具有糖基轉(zhuǎn)移酶所具有的典型結(jié)構(gòu)PSPG box，表明Rd3GT1是糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一。

圖2 多序列比對(duì)分析Fig. 2 Multiple sequence alignment analysis

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用MEGA 7.0采用鄰接法對(duì)來(lái)自不同植物的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖3所示，所有糖基轉(zhuǎn)移酶被分為三類，分別是類黃酮3-O糖基轉(zhuǎn)移酶、類黃酮5-O糖基轉(zhuǎn)移酶和類黃酮7-O糖基轉(zhuǎn)移酶，而Rd3GT1與類黃酮3-O糖基轉(zhuǎn)移酶聚為一類，表明其可以催化類黃酮的C-3位置發(fā)生糖基化反應(yīng)。

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis

2.3 Rd3GT1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

對(duì)初步構(gòu)建完成的載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，條帶大小與預(yù)期大小相符。隨后經(jīng)測(cè)序證明，真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其命名為pBI121-Rd3GT1。

圖4 酶切驗(yàn)證Fig. 4 Enzyme digestion verification

利用凍融法將pBI121-Rd3GT1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗性篩選后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，結(jié)果如果圖5所示，條帶清晰，大小符合要求，表明pBI121-Rd3GT1已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

圖5 PCR驗(yàn)證Fig. 5 PCR verification

2.4 矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化

將經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染的矮牽牛葉片置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，然后將葉片轉(zhuǎn)移至脫菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10 d，隨后再將葉片轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3周，而后將葉片轉(zhuǎn)至新的篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行芽的誘導(dǎo)分化，待不定芽長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)，切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，直至植株可以移栽（圖6）。

圖6 矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程Fig. 6 Genetic transformation process of P. hybrid

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后共獲得6株轉(zhuǎn)基因植株，其花朵顏色均由白色變?yōu)榉凵?。隨后，選擇其中2株花朵顏色變化明顯的進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果如圖7所示，與野生型相比，在轉(zhuǎn)基因植株的花朵中可以成功檢測(cè)到Rd3GT1的表達(dá)。

圖7 轉(zhuǎn)基因植株的表型改變與RT-PCR分析Fig. 7 Phenotypic changes and RT-PCR analysis of transgenic plants

2.6 轉(zhuǎn)基因花朵中花色素苷與黃酮醇的檢測(cè)分析

取野生型與上述兩株轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǘ洌崛∑浠ㄉ剀张c黃酮醇，利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示，與野生型相比，花色素苷的種類由0種增加至3種（A1沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的苷元分子），黃酮醇的種類由4種增加至6種。經(jīng)文獻(xiàn)查閱比對(duì)后，可以確認(rèn)所增加的花色素苷與黃酮醇分別為矢車菊素與芍藥素衍生物和槲皮素與山奈酚衍生物［12-15］。定量分析顯示，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǘ渲谢ㄉ剀张c黃酮醇含量均顯著增加（圖9）。

圖8 轉(zhuǎn)基因花朵中花色素苷與黃酮醇成分分析Fig. 8 Analysis of anthocyanin and flavonol components in transgenic flowers

圖9 轉(zhuǎn)基因花朵中花色素苷與黃酮醇的定量分析Fig. 9 Quantitative analysis of anthocyanin and flavonol in transgenic flowers

2.7 轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

提取野生型與上述兩株轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǘ涞腞NA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因花朵中類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果如圖10所示，在結(jié)構(gòu)基因中查爾酮合酶基因（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）、類黃酮3-羥化酶基因（F3H）和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（3GT）的表達(dá)顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子中AN1與MYBx的表達(dá)顯著上調(diào)。

圖10 轉(zhuǎn)基因矮牽牛中類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 10 Expression profiles of flavonoid-related biosynthetic genes in flowers of transgenic petunia

3 討論

在花色素苷的生物合成過(guò)程中，3GT不僅僅是一個(gè)修飾酶，它在決定花色素苷的水溶性與穩(wěn)定性方面也發(fā)揮著不可或缺的作用［3］。研究顯示，參與花色素苷合成的糖基轉(zhuǎn)移酶具有廣泛的底物選擇性，它們可以同時(shí)糖基化花青素與黃酮醇［16］。例如，龍膽、葡萄和苜蓿的3GT它們可以同時(shí)將糖基供體轉(zhuǎn)移至矢車菊素、天竺葵素和黃酮醇的3-OH位置，完成糖基化反應(yīng)［17-19］。同樣，過(guò)表達(dá)Rd3GT1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǘ渲谢ㄉ剀张c黃酮醇的積累均顯著增加，所以推斷Rd3GT1在矮牽牛體內(nèi)既可以糖基化花青素也可以糖基化黃酮醇。

雖然轉(zhuǎn)基因花朵中花色素苷的積累量顯著增加，但是卻只檢測(cè)到了矢車菊素類的花色素苷。研究表明，二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）作為類黃酮生物合成過(guò)程中的調(diào)控酶，其對(duì)底物的選擇性決定了花色素苷的種類［20］。例如，矮牽牛的DFR因其不能以二氫山奈酚為底物，從而導(dǎo)致矮牽牛中不積累天竺葵素類花色素苷。另一方面，黃酮醇合酶（FLS）與DFR均可以二氫黃酮醇為底物，所以當(dāng)DFR不能催化二氫山奈酚時(shí)，二氫山奈酚將在FLS的作用下反應(yīng)生成更多的山奈酚類黃酮醇［21］。如圖8-D-F的結(jié)果所示，與對(duì)照相比，山奈酚類黃酮醇（F3,F4, F5, F6）的含量確實(shí)顯著增加，這很可能是因?yàn)榘珷颗５腄FR不能以二氫山奈酚為底物導(dǎo)致的。同樣對(duì)擬南芥的研究也獲得了相似的結(jié)果，即當(dāng)其FLS發(fā)生突變時(shí)，擬南芥幼苗中花色素苷的積累顯著增加，反之當(dāng)DFR的功能被抑制后，槲皮素的含量則顯著增加［22-23］。所以，上述這些結(jié)果表明，DFR與FLS對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)力直接控制著類黃酮合成過(guò)程中的代謝流向。

轉(zhuǎn)基因矮牽牛中類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)分析 顯 示，CHS、CHI、F3H、3GT、AN1與 MYBx的表達(dá)量均顯著增加。CHS與CHI是類黃酮合成途徑上游最關(guān)鍵的兩個(gè)酶，它們功能的缺失將直接導(dǎo)致植物合成類黃酮能力的喪失或減弱。例如，在煙草中沉默CHS時(shí)，煙草花朵顏色缺失，沉默CHI時(shí)煙草花朵顏色變淺［24-25］。所以在Rd3GT1轉(zhuǎn)基因矮牽牛花朵中這兩個(gè)基因表達(dá)量的升高是導(dǎo)致花朵顏色加深的原因之一。F3H與3GT在類黃酮合成過(guò)程中同樣在決定類黃酮化合物的種類與含量上發(fā)揮重要作用。例如，大麗花與馬鞭草的F3H突變體花朵因不能積累花色素苷而呈現(xiàn)白色；而在很多植物中花色素苷的積累則與3GT的表達(dá)呈正相關(guān)［26-28］。所以F3H與3GT的高表達(dá)是轉(zhuǎn)基因花朵中黃酮醇與花色素苷高積累的直接原因。但是，作為矮牽牛花色素苷合成的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MYBx，其表達(dá)量也升高了。這一結(jié)果與草莓和龍膽中轉(zhuǎn)錄抑制子的研究相一致，其原因很可能是轉(zhuǎn)錄抑制子的高表達(dá)要作為制動(dòng)器來(lái)平衡花色苷素苷的積累水平［29-30］。

4 結(jié)論

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株花朵顏色由白色變?yōu)榉凵?，同時(shí)花色素苷與黃酮醇的積累顯著增加，并且轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源類黃酮合成多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)顯著升高，表明Rd3GT1通過(guò)影響這些基因的表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)基因矮牽牛的類黃酮合成（圖 11）。

圖11 Rd3GT1調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因矮牽?；ㄉ慕ㄗh模式圖Fig. 11 Proposed model for regulation of transgenic petunia flower color by Rd3GT1