夏全超，張玉霞，孫明雪，張慶昕，杜曉艷，王顯國，王東儒

(1 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 028000；3 呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特010000)

隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，苜蓿(MedicagosativaL.)因具有適口性好、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為發(fā)展草牧業(yè)的首選牧草[1]。我國內(nèi)蒙古科爾沁沙地是近年來發(fā)展起來的新型現(xiàn)代化草業(yè)生產(chǎn)區(qū)，優(yōu)質(zhì)牧草種植面積已超過4.933萬hm2，但是科爾沁地區(qū)冬季寒冷少雪，且極易出現(xiàn)極端低溫和倒春寒的現(xiàn)象，因此低溫成為該地區(qū)苜蓿越冬的主要限制因素[2]。磷素在植物生長發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)積累中占有極其重要的地位[3]，其既參與肌醇六磷酸、核酸、核蛋白及磷脂的形成，又是多種酶的主要構(gòu)成成分和底物，也是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的主要成分之一[4]。由磷脂所構(gòu)成的植物細(xì)胞膜，在植物抗寒方面有極其重要的作用，磷脂親水頭部或疏水尾部能與蛋白、糖類等物質(zhì)相互作用，以抵抗低溫引起的脫水，維持生物膜的穩(wěn)定性[5]。此外土壤磷素水平還會影響植物碳代謝，而可溶性糖、淀粉及蔗糖作為含碳化合物，均對植物的生長發(fā)育有重要作用[6]。目前，我國有近70%的農(nóng)田土壤處于磷素虧缺狀態(tài)[7]，且磷肥施入土壤后，極易在轉(zhuǎn)化為磷酸鹽后迅速被土壤礦物質(zhì)吸附固定或被微生物固持，使其在當(dāng)季不能被長期利用或利用率較低，并造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。韓建國等[9]認(rèn)為，由于磷肥在土壤中移動性差，因此在磷肥的施用方式中，溝施比撒施好，可使磷的固定量降低，以供給草木樨更多的未被固定的磷。姜宗慶等[10]研究表明，適宜磷素可增加小麥不同生長時期的淀粉含量及小麥葉片的蔗糖含量；閆恒輝[11]的研究表明，施磷可提高冬小麥花后0～40 cm土層的根系活力；王天等[12]研究表明，在低溫脅迫下，增施磷肥可有效提高油橄欖的生理活性，緩解低溫對油橄欖幼苗的損傷，進(jìn)而增強(qiáng)植株的抗寒性；沈祥軍等[13]的研究也表明，施用磷肥可以增加苜蓿根頸中可溶性糖等抗寒性物質(zhì)的含量，而可溶性糖能降低細(xì)胞質(zhì)的結(jié)冰點(diǎn)，增強(qiáng)植物抗寒性[14]。由此可知，前人在磷肥對作物生理特性的影響方面已有深入研究，但對于磷肥施用深度對低溫脅迫苜蓿糖類物質(zhì)及抗寒性影響的研究尚較為少見。為此，本研究針對苜蓿栽培生產(chǎn)中磷素與苜蓿根系空間與分布匹配性差的問題，探討不同施磷深度對低溫脅迫苜蓿根頸活力和糖類物質(zhì)含量的影響，旨在為苜?？购弋a(chǎn)栽培中磷肥的高效管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古通遼市開魯縣東風(fēng)鎮(zhèn)林輝草業(yè)公司基地(43°60′N，121°31′E)，該地區(qū)屬于溫帶大陸性半干旱氣候，四季分明，夏季炎熱多雨，冬季干旱少雪，≥10 ℃年積溫為3 000～3 200 ℃，年平均氣溫5.8 ℃，無霜期140～150 d，年平均降水量約370 mm，年平均風(fēng)速3.1～4.3 m/s。土壤有機(jī)質(zhì)含量64.10 mg/kg，堿解氮含量35.88 mg/kg，全氮含量44.01 mg/kg，速效磷含量3.59 mg/kg，速效鉀含量77.89 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大田試驗(yàn)設(shè)計(jì) 供試材料為‘北極熊’紫花苜蓿品種(M.sativa‘Gibraltar’)，由北京百斯特有限公司提供。該品種的秋眠級為2.0級，幼苗強(qiáng)壯、根系發(fā)達(dá)、多葉率高，是抗寒性能非常突出的苜蓿品種。

本研究采用大田試驗(yàn)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，于2020年7月1日播種，播種量為22.5 kg/hm2，行距為20 cm，小區(qū)面積為15 m2(3 m×5 m)。當(dāng)磷肥(P2O5)施用量為225 kg/hm2時，設(shè)置施于地表及距離地表7.5，15.0，22.5，30.0 cm共5個磷肥施用深度處理，分別以S0、S1、S2、S3、S4表示，以不施磷肥為對照(CK)，每個處理均施用鉀肥，鉀肥(K2O)用量為150 kg/hm2。每處理設(shè)置3次重復(fù)，共18個小區(qū)。磷肥、鉀肥分別為過磷酸鈣(P2O5含量為44%)和氯化鉀(K2O含量為60%)，均作為種肥于播種時一次性施入，施肥方式為開溝條施。試驗(yàn)田灌水使用指針式噴灌，并正常進(jìn)行田間管理。于封凍前期(11月15日)在每個小區(qū)挖取長勢一致的苜蓿越冬器官即根頸，帶回室內(nèi)進(jìn)行低溫脅迫處理。

1.2.2 低溫脅迫處理 參照朱愛民等[15]的試驗(yàn)方法，每個小區(qū)取60株長勢均勻一致的苜蓿根頸，平均分成4份，其中1份放入4 ℃冰箱中儲存(低溫冷藏)，將另外3份苜蓿用蒸餾水沖洗干凈，整齊排放在20 cm×30 cm的脫脂純棉布上，包裹好后用3 mL蒸餾水均勻噴灑，使棉布保持濕潤，最后用30 cm×30 cm的錫箔紙包裹，放入可程式恒溫恒濕試驗(yàn)箱分別進(jìn)行-10，-20和-30 ℃的低溫處理(低溫冷凍)。可程式恒溫恒濕試驗(yàn)箱設(shè)置為：以4 ℃為起點(diǎn)，先以4 ℃/h 的速率降溫，在目標(biāo)溫度下保持6 h，然后以4 ℃/h的速度升溫至4 ℃，取出后在4 ℃下放置12 h，與冷藏處理材料同時測定根頸活力和可溶性糖、果糖、蔗糖、淀粉含量。

1.3 測定指標(biāo)及方法

根頸活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[16]測定，可溶性糖和淀粉含量均采用蒽酮比色法[16]測定，蔗糖和果糖含量分別采用二硝基水楊酸法和間苯二酚法[17]測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS 2019軟件進(jìn)行整理并繪制圖表，用DPS 7.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析及相關(guān)性分析，采用Duncan’s檢驗(yàn)方法的新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷肥施用深度對苜蓿根頸活力的影響

由表1可見，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理的苜蓿根頸活力總體上均高于CK。在4和-10 ℃低溫脅迫下，S0、S1、S2和S3處理苜蓿的根頸活力均顯著高于CK和S4處理(P<0.05)；在-30 ℃低溫脅迫下，S0、S1、S2處理苜蓿的根頸活力均顯著高于CK、S3和S4處理(P<0.05)；在-20 ℃條件下，只有S2處理苜蓿的根頸活力顯著高于CK，其余處理與CK之間均無顯著差異。在4，-10，-20，-30 ℃條件下，S2處理的苜蓿根頸活力總體均高于其他處理，較CK顯著增加了83.43%，48.91%，57.78%和181.58%(P<0.05)，說明S2處理最有利于提高苜蓿的根頸活力。在同一磷肥施用深度處理下，苜蓿根頸活力隨著溫度的降低而下降，且不同低溫脅迫處理間的苜蓿根頸活力均有顯著性差異(P<0.05)，其中-30 ℃處理苜蓿的根頸活力最小，說明脅迫溫度越低，苜蓿根頸細(xì)胞受損越嚴(yán)重，苜蓿根頸活力越低。

表1 磷肥施用深度對低溫脅迫處理苜蓿根頸活力的影響Table 1 Effect of phosphate fertilizer application depth on root crown vigor of alfalfa under low temperature stress

2.2 磷肥施用深度對苜蓿根頸可溶性糖含量的影響

由表2可以看出，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸的可溶性糖含量均明顯高于CK。在4和-10 ℃低溫條件下，S1、S2處理苜蓿根頸的可溶性糖含量均顯著高于CK和S4處理(P<0.05)；在-20和-30 ℃條件下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸可溶性糖含量均顯著高于CK(P<0.05)。在4，-10，-20和-30 ℃條件下，S2處理的可溶性糖含量總體較高，較CK分別顯著增加了25.81%，30.96%，39.43%和123.84%，說明S2處理對苜蓿根頸可溶性糖含量有明顯的提高效果。在同一磷肥施用深度處理下，不同低溫脅迫處理苜蓿根頸可溶性糖含量幾乎均有顯著差異(P<0.05)，其中以-20 ℃低溫條件下最大，4 ℃下最小。與4 ℃處理相比，-20 ℃條件下S0、S1、S2、S3、S4處理苜蓿的根頸可溶性糖含量分別增加了140.63%，140.32%，172.37%，178.62%和161.56%，說明適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫可以促進(jìn)苜蓿根頸可溶性糖含量的增長。

表2 磷肥施用深度對低溫脅迫處理苜蓿根頸可溶性糖含量的影響Table 2 Effect of phosphate fertilizer application depth on soluble sugar content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.3 磷肥施用深度對苜蓿根頸果糖含量的影響

由表3可知，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸的果糖含量均明顯高于CK。在4 ℃低溫條件下，S1和S2處理苜蓿根頸的果糖含量顯著高于CK、S3和S4處理(P<0.05)；在-10，-20和-30 ℃條件下，各施磷深度處理的苜蓿根頸果糖含量均顯著高于CK(P<0.05)。在4，-10，-20，-30 ℃條件下，S1和S2處理苜蓿根頸的果糖含量整體均高于其他處理，且較CK分別顯著增加43.66%，22.31%，19.96%，48.44%和36.18%，40.73%，30.53%，61.51%，說明S1和S2處理有利于提高苜蓿根頸中的果糖含量。在同一磷肥施用深度處理下，不同低溫脅迫處理間苜蓿根頸果糖含量均有顯著差異，其中苜蓿根頸果糖含量在-20 ℃下最大，4 ℃下最小。與4 ℃處理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4處理的果糖含量分別增長了233.02%，174.08%，214.61%，251.97%和241.10%，說明適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫可以增加苜蓿根頸中的果糖含量。

表3 磷肥施用深度對低溫脅迫處理苜蓿根頸果糖含量的影響Table 3 Effect of phosphate fertilizer application depth on fructose content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.4 磷肥施用深度對苜蓿根頸蔗糖含量的影響

由表4可知，在同一低溫脅迫處理下，除了S4處理，其他磷肥施用深度處理苜蓿根頸的蔗糖含量均顯著高于CK(P<0.05)。在4 ℃低溫條件下，不同磷肥施用深度處理中以S3處理苜蓿根頸的蔗糖含量最大，較CK增長了84.62%；在-10和-20 ℃下，以S2處理苜蓿根頸的蔗糖含量最大，較CK分別增長了38.55%和41.12%；在-30 ℃下，S1處理苜蓿根頸的蔗糖含量最大，較CK增長了42.49%。以上結(jié)果說明，施用適宜深度的磷肥能提高苜蓿根頸的蔗糖含量。在同一磷肥施用深度處理下，苜蓿根頸蔗糖含量均以-20 ℃下最大，4 ℃下最小，且均與其他低溫脅迫處理間存在顯著差異(P<0.05)。與4 ℃處理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4處理苜蓿根頸的蔗糖含量分別增長了322.76%，262.70%，247.91%，220.71%和252.06%，說明適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫能促使苜蓿根頸蔗糖含量的增加。

表4 磷肥施用深度對低溫脅迫處理苜蓿根頸蔗糖含量的影響Table 4 Effect of phosphate fertilizer application depth on sucrose content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.5 磷肥施用深度對苜蓿根頸淀粉含量的影響

由表5可見，在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理的苜蓿根頸淀粉含量均高于CK。在4 ℃下，不同磷肥施用深度處理中，S1處理苜蓿根頸淀粉含量最大，較CK增長了56.48%；在-10和-30 ℃下，S2處理苜蓿根頸淀粉含量均最大，較CK分別增長了67.23%和66.13%；在-20 ℃下，S3處理苜蓿根頸淀粉含量最大，較CK增長了147.17%，說明在不同低溫條件下，適宜深度施用磷肥均能有效提高苜蓿根頸的淀粉含量。在同一磷肥施用深度處理下，不同低溫脅迫處理之間苜蓿根頸淀粉含量總體均存在顯著性差異(P<0.05)，其中以-20 ℃處理苜蓿根頸的淀粉含量最小，4 ℃處理的淀粉含量最大。與4 ℃處理相比，-20 ℃下S0、S1、S2、S3、S4處理苜蓿根頸的淀粉含量分別降低了75.74%，74.78%，65.18%，52.08%和74.38%。

表5 磷肥施用深度對低溫脅迫處理苜蓿根頸淀粉含量的影響Table 5 Effect of phosphate fertilizer application depth on starch content of alfalfa root crown under low temperature stress

2.6 苜蓿根頸活力與糖類物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

表6顯示，在4 ℃下，苜蓿根頸活力與可溶性糖、蔗糖、淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-10 ℃下，苜蓿根頸活力與可溶性糖、蔗糖、果糖、淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-20 ℃下，苜蓿根頸活力與可溶性糖和蔗糖含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-30 ℃下，苜蓿根頸活力與蔗糖、果糖含量呈顯著正相關(guān)。在4 ℃下，苜蓿根頸可溶性糖含量與蔗糖、淀粉含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；在-10，-20 ℃下，苜蓿根頸可溶性糖含量與蔗糖、果糖、淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-30 ℃下，苜蓿根頸可溶性糖含量與蔗糖、果糖含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。在4，-10 ℃下，苜蓿根頸蔗糖含量與淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)；在-20和-30 ℃下，苜蓿根頸蔗糖含量與果糖和淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。在-20，-30 ℃下，苜蓿根頸果糖含量與淀粉含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果說明，苜蓿根頸中的可溶性糖、蔗糖、果糖和淀粉含量越高，苜蓿滲透調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)，生物膜結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，根頸活力越高，苜?？购芰υ綇?qiáng)。

表6 苜蓿根頸活力與其糖類物質(zhì)含量的相關(guān)性 Table 6 Correlations between alfalfa root crown vitality and carbohydrate contents

表6(續(xù)) Continued table 6

3 討 論

有研究表明，植物根系是最先感受逆境的植物器官，根頸活力常被用以衡量作物生理活性的強(qiáng)弱[18]。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸活力均持續(xù)降低，這是由于隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸細(xì)胞膜受損程度逐漸加重，細(xì)胞液外滲更多，正常的生命活動遭到破壞，導(dǎo)致根頸活力降低。吳立群等[19]的研究表明，與對照相比，低溫處理水稻幼苗的根系活力均有所下降，與本研究結(jié)果一致。溫斐斐[20]的研究表明，深施磷肥可提高旱地小麥各生育期的根系活力；楊春收[21]的研究也表明，磷肥施于距離地表15 cm處時能顯著增加玉米的根系活力。而本研究結(jié)果表明，同一低溫脅迫處理下隨著磷肥施用深度的增加，苜蓿根頸活力均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢，其中S2處理，即磷肥施用深度為15.0 cm時的根頸活力總體高于其他處理，說明在距離地表15.0 cm處施用磷肥，最有利于苜蓿根頸活力的提高。

可溶性糖是植物體內(nèi)碳素營養(yǎng)的主要部分，不僅是細(xì)胞壁、纖維素、核酸等物質(zhì)的組成成分，還能為植物體內(nèi)各種生命活動提供能量，此外還直接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，其含量的多少還對淀粉的積累有重要意義[22]。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸可溶性糖含量均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢，且在-20 ℃下達(dá)到最大值；在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿根頸可溶性糖含量均明顯高于CK，這與杜旭等[23]的研究結(jié)果一致。本研究中，在同一低溫脅迫處理下，S2處理苜蓿根頸的可溶性糖含量總體較高，說明在距離地表15.0 cm處施用磷肥時，可溶性糖含量的積累效果最明顯。

蔗糖和果糖是植物體內(nèi)能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢、降低細(xì)胞冰點(diǎn)、穩(wěn)定酶和蛋白構(gòu)象的含碳化合物。有研究表明，蔗糖與果糖是提高苜蓿越冬的抗寒性保護(hù)物質(zhì)[24]。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸果糖、蔗糖含量均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢，且-10，-20和-30 ℃處理苜蓿根頸的果糖、蔗糖含量均顯著高于4 ℃處理。董文科等[25]的研究結(jié)果表明，低溫脅迫可導(dǎo)致青海扁莖早熟禾果糖、蔗糖含量上升，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還表明，在同一低溫脅迫處理下，隨著磷肥施用深度的增加，苜蓿根頸蔗糖和果糖含量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，且總體上均高于CK，這可能是因?yàn)榱姿厥禽o酶Ⅰ(NAD)、輔酶Ⅱ(NADP)等多種化合物的組成成分，這些化合物在碳水化合物的合成等生理過程中有重要作用，果糖和蔗糖作為植物體內(nèi)重要的含碳化合物，受到了磷素的顯著影響[26]。

植物受到低溫脅迫后，水解酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致淀粉水解為蔗糖、可溶性糖等具有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢、降低結(jié)冰點(diǎn)能力的物質(zhì)[27]。孫明雪等[28]的研究表明，隨著脅迫溫度的降低，黃花苜蓿和4個紫花苜蓿品種根頸中的淀粉含量呈降低趨勢。本研究結(jié)果表明，在同一磷肥施用深度處理下，苜蓿根頸淀粉含量隨著脅迫溫度的降低呈先降低后升高的趨勢，-30 ℃下苜蓿根頸淀粉含量較-20 ℃提高的原因，可能是由于-30 ℃時淀粉水解酶活性減弱，淀粉水解過程受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致淀粉含量提高。本研究結(jié)果還表明，在同一低溫脅迫處理下，隨著磷肥施用深度的增加，苜蓿根頸淀粉含量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，其中S2處理的淀粉含量總體較高，說明距離地表15.0 cm處施用磷肥，最有利于苜蓿根頸中淀粉的積累。

4 結(jié) 論

在同一磷肥施用深度處理下，隨著脅迫溫度的降低，苜蓿根頸活力持續(xù)減弱；苜蓿根頸可溶性糖、果糖、蔗糖含量均呈先升高后降低的變化趨勢，且均以-20 ℃下最大；淀粉含量呈先降低后升高的趨勢，在-20 ℃下最小。在同一低溫脅迫處理下，不同磷肥施用深度處理苜蓿的根頸活力及根頸可溶性糖、果糖、蔗糖、淀粉含量均高于CK，其中以磷肥施用深度為15.0 cm時總體較高。因此建議在科爾沁沙地建植苜蓿時，磷肥施用在距離土壤表面15.0 cm處，這有利于促進(jìn)苜蓿糖類物質(zhì)含量的增長及根系活力的增強(qiáng)，進(jìn)而提高苜蓿的抗寒性。