練維生 姚征 曹非 鄭屹峰

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）具有高復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移的特性[1]。盡管HCC的診斷與治療取得了重大進(jìn)展，但癌細(xì)胞在抗癌藥物治療后敏感性和反應(yīng)各不相同，多種抗癌藥物對(duì)耐藥細(xì)胞（如耐阿霉素的人HCC細(xì)胞HepG2/ADM）均表現(xiàn)出較差的抗腫瘤活性[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變的重要過程，與癌癥的轉(zhuǎn)移過程、耐藥性有密切關(guān)系[3]。姜黃素是一種多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生存等作用[4]。已有研究證明，姜黃素可以通過NF-κB通路抑制癌細(xì)胞的侵襲[5]，還具有抑制HCC發(fā)展和改善耐藥性的作用[6-7]。然而，目前關(guān)于姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞作用的相關(guān)分子機(jī)制研究尚不多見。因此，本研究就姜黃素對(duì)HCC耐藥細(xì)胞EMT的影響及分子機(jī)制作一探討，以期為改善HCC治療方式及耐藥現(xiàn)狀提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 人HCC耐藥細(xì)胞HepG2/ADM購(gòu)自廣州吉妮歐生物有限公司。

1.2 主要試劑 鋅指蛋白（Snail）過表達(dá)載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司；Lipofectamine 3000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基及FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；姜黃素、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；阿霉素購(gòu)自深圳萬樂藥業(yè)有限公司；噻唑藍(lán)溴化四唑（MTT）、胰蛋白酶、多聚甲醛、PBS、Triton X-100、Hoechst 33342染色液均購(gòu)自北京索萊寶公司；兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、NF-κB p65、Snail、活化因子蛋白-1（AP-1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT-3）、cMyc、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）等一抗以及異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自上海碧云天公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HepG2/ADM細(xì)胞培養(yǎng)置于含0.5 nmol/ml阿霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。按1.5×106個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于6孔板，取1.5 ml EP管依次加入250 μl Opti-MEM I、4 μg Snail過表達(dá)載體或空載；再取 1.5 ml EP 管，加入 250 μl Opti-MEM I、8 μl lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染劑混勻，根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至96孔板（5×103個(gè)細(xì)胞/孔）培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度（10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L）姜黃素孵育48 h。在黑暗環(huán)境下，加入20 μl/孔MTT（5 mg/ml）處理4 h，加入150 μl DMSO處理10 min，記錄各孔細(xì)胞在490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。此步驟為預(yù)實(shí)驗(yàn)，為了避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成較大影響，本研究選擇姜黃素濃度20 μmol/L進(jìn)行以下細(xì)胞功能學(xué)檢測(cè)。

1.3.3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞用胰蛋白酶處理后接種至6孔板中（5×105個(gè)細(xì)胞/孔）進(jìn)行培養(yǎng)，并通過20 μl無菌槍頭劃痕。洗去漂浮細(xì)胞后，加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察、拍照，記錄24 h前后的劃痕距離。

1.3.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種至包被有基質(zhì)膠的8 μm Transwell上室，下室添加含姜黃素的15%FBS培養(yǎng)基。48 h后，通過棉簽刮擦上室殘留的細(xì)胞，下室內(nèi)細(xì)胞通過4%多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色，在光鏡下觀察并記錄細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)。

1.3.5 EMT標(biāo)志物及NF-κB/Snail通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜封閉2 h；4℃過夜孵育一抗，二抗孵育90 min。通過化學(xué)發(fā)光顯影，利用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析光密度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail通路相關(guān)蛋白Snail、NF-κB p65、AP-1、STAT-3、cMyc等蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖的影響 隨著姜黃素濃度的升高，HepG2/ADM細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05）；20 μmol/L為姜黃素處理的合適濃度，見圖1。

圖1 不同濃度姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖的影響

2.2 姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 與HepG2/ADM組比較，HepG2/ADM+姜黃素組細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

2.3 姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響 與HepG2/ADM組比較，HepG2/ADM+姜黃素組E-cadherin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

2.4 姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞NF-κB/Snail通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與HepG2/ADM組比較，HepG2/ADM+姜黃素組NF-κB p65、Snail蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（均P＜0.05），AP-1、STAT-3、cMyc蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 姜黃素對(duì)NF-κB/Snail通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 姜黃素通過NF-κB/Snail通路抑制HepG2/ADM細(xì)胞EMT的驗(yàn)證結(jié)果 在20 μmol/L姜黃素處理HepG2/ADM細(xì)胞的基礎(chǔ)上過表達(dá)Snail后，由姜黃素誘導(dǎo)的E-cadherin表達(dá)上調(diào)、N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)均被逆轉(zhuǎn)（均P＜0.05），見圖5a；HepG2/ADM細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均明顯增強(qiáng)（均P＜0.05），見圖5b-d。

圖5 姜黃素通過NF-κB/Snail通路抑制HepG2/ADM細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的驗(yàn)證結(jié)果（a：Western blot結(jié)果；b：噻唑藍(lán)溴化四唑法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；c：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，×40；d：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，×200）

3 討論

HCC已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。目前HCC的治療策略仍以手術(shù)、放療和化療為主，但患者的預(yù)后較差，尤其是對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性的患者[8]。阿霉素是HCC的常規(guī)化療藥物，但腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性嚴(yán)重影響了化療的效果[9]。因此，需要更深入研究HCC耐藥細(xì)胞的潛在分子機(jī)制。

EMT是一種可逆的細(xì)胞過程，通常伴隨細(xì)胞黏附破壞、遷移侵襲和轉(zhuǎn)移增加以及化療耐藥等現(xiàn)象出現(xiàn)[10]。經(jīng)歷EMT的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出上皮基因如E-cadherin、緊密連接蛋白1和閉合蛋白表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)基因如N-cadherin、Vimentin和纖維粘連蛋白表達(dá)上調(diào)。在大多數(shù)情況下，E-cadherin的丟失是EMT的標(biāo)志[11]。EMT已被確定在包括HCC在內(nèi)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用[12]。姜黃素是一種由姜黃根莖產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，多項(xiàng)研究表明，姜黃素對(duì)肝、肺和腎纖維化等多種病理狀態(tài)具有潛在治療作用[13]。并有證據(jù)表明姜黃素對(duì)EMT有著潛在的調(diào)控作用，例如姜黃素可以通過上調(diào)miR-200c表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5來抑制結(jié)直腸癌的EMT過程[14]；通過ERK5/AP-1通路負(fù)調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的腎細(xì)胞癌EMT過程[15]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可以抑制HepG2/ADM細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，姜黃素

還能抑制N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)，對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞的EMT具有顯著抑制作用。

研究表明，在參與EMT進(jìn)展的幾個(gè)關(guān)鍵因素中，NF-κB至關(guān)重要。在此過程中，NF-κB可以誘導(dǎo)多種促進(jìn)腫瘤EMT和轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄因子，包括Snail、Twist和ZEB2[16]。其中，第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子是Snail[17]。由NF-κB介導(dǎo)的Snail轉(zhuǎn)錄激活在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中的EMT過程起重要作用，例如NF-κB/Snail信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)在芹菜素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT抑制過程中發(fā)揮作用[18]。腸內(nèi)酯調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌細(xì)胞中NF-κB/Snail信號(hào)通路以恢復(fù)TGF-β誘導(dǎo)的EMT[19]。本研究也證實(shí)姜黃素作用于HepG2/ADM細(xì)胞后會(huì)引起NF-κB/Snail信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)。此外，在HepG2/ADM細(xì)胞中過表達(dá)Snail后，可部分逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)EMT的抑制作用，促進(jìn)HepG2/ADM細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示姜黃素可能通過影響NF-κB/Snail通路來抑制HepG2/ADM細(xì)胞的EMT過程。

綜上所述，本研究證實(shí)了姜黃素對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，同時(shí)細(xì)胞EMT過程在一定程度上也被抑制，可能與姜黃素對(duì)NF-κB/Snail通路的抑制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)僅為細(xì)胞層面的驗(yàn)證，具有一定的局限性，后續(xù)擬從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)該分子機(jī)制進(jìn)行更深一步的驗(yàn)證。