陳梅林 蘇貞紹 韋霞琳 梁 丹 林栓全

(欽州市第一人民醫(yī)院1 腫瘤內(nèi)科，2 呼吸內(nèi)科，廣西欽州市 535000)

鼻咽癌是鼻咽部常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率較高，常見(jiàn)癥狀有鼻涕帶血、通氣不暢等[1-3]。鼻咽癌的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、飲食等多種因素有關(guān)，其早期臨床癥狀隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)病情已發(fā)展至中晚期[4-5]。放療是目前鼻咽癌的首選治療手段，隨著放療技術(shù)的不斷進(jìn)步，鼻咽癌患者的局部控制率得到不斷提高，其預(yù)后也在一定程度上得到改善，但患者體質(zhì)各異，對(duì)放療的敏感性參差不齊，因此療效和預(yù)后也不盡相同[6-8]。因此，尋找評(píng)估鼻咽癌放療效果的新型標(biāo)志物成為研究的熱點(diǎn)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4,NOX4)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成員之一，在多種腫瘤中均有表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9]。miR-421是具有促癌效應(yīng)的miRNA，在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)水平，能夠抑制癌細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[10]。本研究探討鼻咽癌組織中NOX4表達(dá)情況、miR-421的表達(dá)水平及其與患者臨床病理特征和放療敏感性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2021年1月在我院就診的50例鼻咽癌患者作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理活檢確診為低分化鱗狀細(xì)胞癌；(2)均為初發(fā)鼻咽癌；(3)既往未接受過(guò)放化療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料不齊全者；(2)精神異?；蛘J(rèn)知功能障礙者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)合并嚴(yán)重感染性及心、肝、腎等臟器疾病者。另選取同期在我院治療的30例慢性鼻咽炎患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者鼻腔黏膜充血、肥厚，伴有腫物或糜爛，鼻腔內(nèi)有膿痂充塞，經(jīng)鼻內(nèi)鏡檢查確診為慢性鼻咽炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)地塞米松等藥物治療的患者；(2)對(duì)本次研究用藥有禁忌證者；(3)合并代謝性疾病者；(4)合并心、肝、腎等臟器疾病者。兩組患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。本研究已獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均對(duì)本研究知情同意。

表1 兩組患者一般資料的比較

1.2 治療方法 鼻咽癌患者接受常規(guī)放療：在CT模擬機(jī)下定位，在定位片上勾畫(huà)靶區(qū)，靶區(qū)采用面頸聯(lián)合野+下頸切線野。面頸聯(lián)合野照射至36～40 Gy后，縮野為小面頸野，推量至60 Gy，如果患者存在顱內(nèi)、顱底侵犯則進(jìn)一步縮野推量至70 Gy；下頸切線野一般照射至50 Gy。放療過(guò)程中應(yīng)用擋鉛減少放射線損害。每天治療1次，每周治療5次，共治療35次。鼻咽炎患者給予經(jīng)鼻霧化吸入治療：經(jīng)鼻吸入布地奈德混懸液(Astra Zeneca公司，批號(hào)：H20090903)，每次1 mg(2 mL)，2次/d，每側(cè)鼻腔每次吸入時(shí)間約2.5 min(0.5 mg)，共約5 min，療程5 d。

1.3 免疫組化法檢測(cè)NOX4的表達(dá)情況 兩組患者經(jīng)系統(tǒng)治療前進(jìn)行組織活檢，將取得的病變組織置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋后制作成厚度為4 μm的切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法檢測(cè)病變組織中NOX4的表達(dá)情況：將石蠟組織切片分別浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ內(nèi)各10 min，再依次浸入不同濃度酒精中水化5 min，PBS沖洗3次，3 min/次；然后置入檸檬酸鈉抗原修復(fù)緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)。在切片上滴加50 μL 3% H2O2，室溫避光孵育10 min，PBS緩沖液洗滌3次，3 min/次；擦干組織周?chē)乃?，滴?%山羊血清，于室溫下孵育10 min后甩干。NOX4一抗孵育過(guò)夜(稀釋比例為1∶5 000，上海恒斐生物科技有限公司，批號(hào)：AR133303)，TBST液洗膜3次，10 min/次，將PBS作為一抗的陰性對(duì)照，室溫下辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔多克隆二抗(稀釋比例為1∶8 000，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：A0208)孵育2 h，TBST液洗膜3次，10 min/次，二氨基聯(lián)苯胺法顯色，將組織切片用蘇木素復(fù)染15 s后用流水沖洗3 min。在尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡下(視野×200)隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè))進(jìn)行觀察，細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，取5個(gè)視野細(xì)胞數(shù)平均值，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%定義為NOX4陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥5%定義為NOX4陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-421的表達(dá)水平 兩組患者經(jīng)系統(tǒng)治療前進(jìn)行組織活檢，取適量病變組織，采用miRNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：20200513)提取組織總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,批號(hào)：K1691)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SR1110)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。miR-421上游引物序列為5′-CTCACTCACATCAACAGACATTAATT-3′，下游引物序列為5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；U6上游引物為5′-GAATCGGGCCTGCTCAAGT-3′，下游引物為5′-CGAAACGGAGACCCAGGAAA-3′。反應(yīng)體系共20 μL，包括cDNA模板2.0 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，5×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，Nuclease-free H2O 6.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-421的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 鼻咽癌臨床分期和TNM分期的評(píng)價(jià) 治療前按照中國(guó)鼻咽癌2008分期標(biāo)準(zhǔn)[11]對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行臨床分期，并采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)2010年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行TNM分期。

1.6 鼻咽癌療效評(píng)價(jià) 鼻咽癌患者于放療結(jié)束后3個(gè)月復(fù)查鼻咽纖維鏡、鼻咽部CT或MRI，根據(jù)實(shí)體瘤臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定、進(jìn)展4個(gè)等級(jí)。療效達(dá)到完全緩解和部分緩解定義為放療敏感，穩(wěn)定和進(jìn)展定義為放療不敏感。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者病變組織NOX4表達(dá)情況和miR-421表達(dá)水平的比較 病例組患者病變組織的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率和miR-421表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表2和圖1。

表2 兩組患者病變組織NOX4的表達(dá)情況和miR-421相對(duì)表達(dá)水平的比較

圖1 兩組患者病變組織中NOX4表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)

2.2 NOX4、miR-421表達(dá)情況與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系 T3～4期鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率及miR-421表達(dá)水平高于T1～2期患者(P<0.05)；N2～3期鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率及miR-421表達(dá)水平高于N0～1期患者(P<0.05)；M1期鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率和miR-421表達(dá)水平均高于M0期患者(P<0.05)；臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率及miR-421表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 NOX4、miR-421表達(dá)情況與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NOX4、miR-421表達(dá)情況與鼻咽癌患者放療敏感性的關(guān)系 根據(jù)實(shí)體瘤臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將患者分為放療敏感組22例與放療不敏感組28例。放療敏感組鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率、miR-421表達(dá)水平均低于放療不敏感組鼻咽癌患者(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 NOX4、miR-421表達(dá)情況與鼻咽癌患者放療敏感性的關(guān)系

3 討 論

放療是鼻咽癌的主要治療手段，但不同患者體質(zhì)存在差異，放療敏感性也參差不齊，放療敏感性較好的患者在放療后癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移得到有效控制，病情緩解，預(yù)后得以改善，而放療敏感性較差的鼻咽癌患者在放療后仍存在癌細(xì)胞殘留、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、病情復(fù)發(fā)等情況。NOX4是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成員之一，在多種腫瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、甲狀腺癌等中呈高表達(dá)水平[14]。研究表明，結(jié)腸癌病灶中NOX4的表達(dá)水平升高與患者臨床特征和預(yù)后密切相關(guān)[15]；NOX4過(guò)表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)切除病灶后預(yù)后較差的影響因素[16]。miR-421是與多種惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的miRNA，其在肺癌、乳腺癌、胃癌中均呈高表達(dá)水平[17-19]。目前，NOX4、miR-421在鼻咽癌中的作用機(jī)制尚不完全明確，故本研究探討鼻咽癌組織中NOX4、miR-421的表達(dá)水平及其與鼻咽癌患者臨床病理特征和放療敏感性的相關(guān)性。本研究對(duì)兩組研究對(duì)象的病變組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NOX4主要定位于細(xì)胞核，并且病例組患者病變組織中的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示病例組病變組織中的miR-421表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，這說(shuō)明NOX4陽(yáng)性表達(dá)及miR-421高表達(dá)水平與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，T3～4期、N2～3期、M1期、Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌患者病變組織中的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率和miR-421表達(dá)水平均分別高于T1～2期、N0～1期、M0期、Ⅰ～Ⅱ期患者(均P<0.05)，說(shuō)明鼻咽癌患者病變組織中的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率及miR-421的表達(dá)水平與其臨床病理特征密切相關(guān)，這提示NOX4、miR-421可能參與了鼻咽癌的進(jìn)展，兩者或許可作為評(píng)估鼻咽癌患者病情的標(biāo)志物。

研究表明，鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性與患者的預(yù)后密切相關(guān)[20-21]。目前臨床上尚缺乏可以反映鼻咽癌放療敏感性的敏感指標(biāo)[22]。病理特征可以在一定程度上判斷鼻咽癌的惡性程度，但其對(duì)放療敏感性的預(yù)測(cè)價(jià)值有限[23-24]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NOX4能夠抑制腫瘤對(duì)放療的敏感性[25]。有研究顯示，NOX4的表達(dá)下調(diào)可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、侵襲及腫瘤相關(guān)血管生成，提高其體外放射的敏感性[14]，使用 NOX4 抑制劑處理人類(lèi)腎癌細(xì)胞可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[9]。本研究在放療后對(duì)鼻咽癌患者放療敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并分析NOX4、miR-421與患者放療敏感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，放療敏感的鼻咽癌患者病變組織的NOX4陽(yáng)性表達(dá)率、miR-421表達(dá)水平均低于放療不敏感的鼻咽癌患者(均P<0.05)，表明鼻咽癌患者病變組織中的NOX4及miR-421的表達(dá)情況與鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性具有相關(guān)性。

綜上所述，鼻咽癌患者癌組織中NOX4、miR-421表達(dá)水平升高，NOX4、miR-421表達(dá)水平與鼻咽癌患者的臨床病理特征、放療敏感性密切相關(guān)。因此，靶向調(diào)控NOX4、miR-421表達(dá)水平或有可能改善鼻咽癌患者對(duì)放療的敏感性，進(jìn)而減少放療后腫瘤的殘留和復(fù)發(fā)，改善鼻咽癌患者的生存預(yù)后。