文/何亞鵬

為了探究添加弗氏佐劑和蜂膠佐劑后殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果，分別制備含兩種不同佐劑的殺鮭氣單胞菌滅活疫苗，免疫細(xì)鱗鮭，并設(shè)不加佐劑組和對(duì)照組，分別于免疫后不同時(shí)間采血，檢測(cè)血清抗體效價(jià)，評(píng)價(jià)相關(guān)免疫指標(biāo)和免疫保護(hù)率，以期為鮭鱒魚(yú)疥瘡病的防控和珍稀水生物種保護(hù)提供技術(shù)參考。

殺鮭氣單胞菌屬于氣單胞菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，其在淡水與海水環(huán)境中廣泛存在，該菌主要引起16種鮭鱒魚(yú)類如大馬哈魚(yú)、細(xì)鱗鮭、大西洋鮭、虹鱒和河鱒等癤瘡病及潰瘍病，導(dǎo)致幼魚(yú)死亡率高，其宿主范圍也在不斷擴(kuò)大，有引起鯉科魚(yú)類潰瘍病和紅皮炎的報(bào)道。如果任其流行，不僅會(huì)進(jìn)一步威脅珍稀鮭鱒魚(yú)物種的生存，影響救護(hù)和繁育工作，還有可能危害我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

為此，本文探究了添加弗氏佐劑和蜂膠佐劑后殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果，并總結(jié)成文。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)魚(yú)

為本中心馴養(yǎng)車間內(nèi)養(yǎng)殖的同一批次均一細(xì)鱗鮭，體長(zhǎng)平均為13cm，體重平均14g，魚(yú)外觀及活動(dòng)均正常，按習(xí)性在14℃左右水溫正常養(yǎng)殖。

（二）菌種來(lái)源

殺鮭氣單胞菌由北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心分離鑒定并保存。

（三）滅活疫苗的制備

殺鮭氣單胞菌由-80℃冰箱取出，接種于TSB肉湯培養(yǎng)基活化培養(yǎng)兩代，檢查染色特征及菌體形態(tài)，顯示正常后在TSB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，加入終濃度為0.3%的甲醛，混勻，恒溫培養(yǎng)箱37℃放置48h滅活細(xì)菌。離心取沉淀的菌體，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)洗滌菌體3次，去除殘留的培養(yǎng)基和甲醛，最后懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，接種培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測(cè)，確認(rèn)無(wú)活菌后，即制得殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗。采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌濃度為2.0×10CFU/mL，分別加入弗氏佐劑和蜂膠佐劑，混勻，完畢后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（四）免疫注射和樣品采集

取弗氏佐劑滅活疫苗、蜂膠佐劑滅活疫苗、不加佐劑滅活疫苗和生理鹽水（對(duì)照組），分別采用腹腔注射方式免疫細(xì)鱗鮭，每尾0.1mL，分別于第1d和注射后第7d、14d、21d、28d、和35d采血。每組隨機(jī)取10尾采血，收集血清。

（五）抗體效價(jià)等免疫指標(biāo)測(cè)定

抗體效價(jià)測(cè)定：采用傳統(tǒng)的試管凝集法檢測(cè)血清抗體水平，觀察細(xì)菌的凝集程度，取每組平均值作為結(jié)果。

溶菌酶（Lysozyme，LZM）是血清中決定吞噬細(xì)胞能否殺滅所吞噬的致病菌一種水解酶，酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）和巨噬細(xì)胞溶酶體活力相關(guān)，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）作為抗氧化酶可清除體內(nèi)自由基，SOD活力的變化能夠表明機(jī)體對(duì)外來(lái)物質(zhì)的清除力，它們和動(dòng)物機(jī)體的免疫力密切相關(guān)，檢測(cè)其變化有利于了解免疫后機(jī)體抗病力的變化水平。本試驗(yàn)選用檢測(cè)試劑盒，按照操作測(cè)定計(jì)算各組血清樣品平均的溶菌酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶活力。

（六）免疫保護(hù)率測(cè)定和臨床應(yīng)用

將四組生長(zhǎng)狀況一致的魚(yú)苗分別注射兩種滅活疫苗、不加佐劑滅活疫苗和生理鹽水，28d后，各組魚(yú)隨機(jī)取30尾攻毒，腹腔注射0.1mL殺鮭氣單胞菌活菌液（1.0×10CFU/mL），觀察死亡情況，計(jì)算免疫保護(hù)率。免疫保護(hù)率=［1-（免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）］×100%。

將制備的疫苗在中心養(yǎng)殖車間（試驗(yàn)點(diǎn)1）和玉渡山養(yǎng)殖基地（試驗(yàn)點(diǎn)2）進(jìn)行應(yīng)用，各試驗(yàn)點(diǎn)分為弗氏佐劑免疫組、蜂膠佐劑免疫組和對(duì)照組，每尾0.1mL，注射后均正常養(yǎng)殖，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)各組存活率。

二、結(jié)果

（一）抗體效價(jià)等免疫指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

采用傳統(tǒng)的試管凝集法，測(cè)得試驗(yàn)組的平均抗體效價(jià)呈上升趨勢(shì)，弗氏佐劑組和蜂膠佐劑組均在第1d～28d快速上升，第28d達(dá)到峰值，分別為1:460.8、1:508.5，隨后緩慢下降；不加佐劑組在第21d達(dá)到峰值1:281.6，隨后緩慢下降；對(duì)照組無(wú)明顯變化（見(jiàn)表1）。

表1 各組魚(yú)血清凝集抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果

血清中免疫相關(guān)的三種酶活力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，兩種滅活疫苗免疫后，免疫組血清溶菌酶、酸性磷酸酶活力和超氧化物歧化酶活力于免疫后明顯上升，高于不加佐劑組，蜂膠佐劑組優(yōu)于弗氏佐劑組，隨后活力逐漸下降，但一直保持在高于對(duì)照組的水平，對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的指標(biāo)變化不顯著。

表2 各組魚(yú)LZM、ACP和SOD活力檢測(cè)結(jié)果

（二）免疫保護(hù)率測(cè)定

攻毒試驗(yàn)記錄的四組死亡數(shù)如圖1。攻毒10d后，弗氏佐劑組、蜂膠佐劑組、不加佐劑組的死亡率分別為13.3%、10%、20%，明顯低于對(duì)照組的76.7%，蜂膠佐劑組最低；弗氏佐劑組、蜂膠佐劑、不加佐劑組的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為82.7%、87.0%、73.9%（見(jiàn)表3）。

表3 活菌攻毒后各組的死亡率和免疫保護(hù)力

圖1 活菌攻毒后各組的累計(jì)死亡數(shù)

（三）臨床應(yīng)用效果

將制備的疫苗于試驗(yàn)點(diǎn)的細(xì)鱗鮭魚(yú)苗中應(yīng)用，分弗氏佐劑免疫、蜂膠佐劑免疫組和對(duì)照組，免疫后均正常養(yǎng)殖，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)各組存活數(shù)，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，在試驗(yàn)點(diǎn)1應(yīng)用疫苗后可提高存活率10%以上，試驗(yàn)點(diǎn)2可提高存活率16%以上，可以減少該病造成的損失（見(jiàn)表4）。

表4 臨床應(yīng)用結(jié)果

三、討論

殺鮭氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中，該病原引起的疥瘡病和潰瘍病每年都會(huì)造成相關(guān)水生生物損失嚴(yán)重，對(duì)冷水魚(yú)養(yǎng)殖行業(yè)和珍稀水生動(dòng)物保護(hù)有較大的威脅。

魚(yú)類疫苗發(fā)展較畜禽疫苗晚，在生產(chǎn)中應(yīng)用較多的仍是滅活疫苗。本研究以殺鮭氣單胞菌為研究對(duì)象，制備不同佐劑的殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗，弗氏佐劑組、蜂膠佐劑組和不加佐劑組血清平均抗體效價(jià)于免疫后呈上升趨勢(shì)，蜂膠佐劑組的抗體效價(jià)更高。隨后進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明弗氏佐劑全菌滅活疫苗保護(hù)效果可達(dá)到82.7%，蜂膠佐劑全菌滅活疫苗保護(hù)效果可達(dá)到87.0%，加入佐劑后的疫苗產(chǎn)生更強(qiáng)更持久的免疫力，蜂膠佐劑全菌滅活疫苗更優(yōu)。將制備的疫苗于試驗(yàn)點(diǎn)的細(xì)鱗鮭魚(yú)苗中應(yīng)用，均可以提高其存活率，降低損失，蜂膠佐劑效果更好。本實(shí)驗(yàn)比較了兩種佐劑的免疫效果，有助于相關(guān)疫苗的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用。