劉海霞，王艷曉，王磊

（1.天津瑞普生物技術股份有限公司 天津 300308；2.天津市農業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與農產品質量檢測中心 天津 300402）

我國是畜禽養(yǎng)殖業(yè)大國，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模和數量均居全球首位，畜禽業(yè)為我們提供了豐富的畜產品。然而，動物疫病如禽流感、非洲豬瘟等對畜禽養(yǎng)殖業(yè)有著毀滅性的打擊。同時，一些畜禽疫病還是人畜共患病，不僅危害畜牧業(yè)健康發(fā)展，還對人類公共衛(wèi)生事業(yè)造成極大隱患。動物疫苗的發(fā)展極大地解決了動物疫病對畜牧業(yè)的危害。

隨著基因組測序技術、蛋白質組學等學科的發(fā)展，基因缺失技術得到飛速發(fā)展。相較傳統(tǒng)疫苗如：滅活疫苗、減毒活疫苗等而言，運用基因缺失技術研制的基因缺失疫苗有著可控、快速、高效等優(yōu)點。本文就基因缺失技術的概念、主要技術手段及動物基因缺失疫苗研發(fā)及應用等做一總結，以期對基因缺失疫苗的研究提供參考。

1 基因缺失技術的含義

1953 年DNA 雙螺旋結構被發(fā)現，人類進入分子生物學研究階段。經過近70 年發(fā)展，已從研究DNA 中堿基序列排列規(guī)律發(fā)展到研究DNA 基因片段的遺傳密碼功能階段?；蛉笔Ъ夹g正是研究DNA 基因片段的技術，就是將細胞（細菌或病毒）內的某些功能性基因片段通過DNA 同源或異源轉化、重組去掉，從而改變細胞（細菌或病毒）遺傳學特性的技術，它其實是基因工程技術中基因敲除技術的一個分支。

在動物疫苗的研制和生產中，通過基因缺失技術敲除掉動物疫病致病源（如：病毒等）DNA 序列中某些致病基因片段，構建一個缺失這些致病基因的疫苗株，而保留致病源的傳染性，從而達到免疫疫病的作用。

2 基因缺失常用技術手段

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)、TALEN 技術、ZFN 技術等基因缺失研究技術都是在近年發(fā)現DNA 基因片段特性的基礎上發(fā)展起來的。2020年，CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)獲得諾貝爾化學獎，在動物疫苗的研發(fā)中已廣泛應用。

2.1 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是規(guī)律成簇間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白（clustered regularly interspaced short palin dromic repeats-associated proteins，Cas）的簡稱。

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是由兩種蛋白組合而成，該系統(tǒng)主要通過蛋白酶將目的DNA 位點切割，可以使DNA 雙鏈斷裂。當同源序列存在時，斷裂DNA 區(qū)間可以直接進行同源重組，進而定點敲除目的基因。當雙鏈斷裂端為非同源末端時，不同源序列可重新連接DNA 游離末端，進而實現基因敲除的目的，此種情況主要發(fā)生在真核生物。因此，CRISPR-Cas9 技術特點是通過不同的sgDNA 設計對基因進行定點修飾，并且對同源和非同源DNA 均可以進行基因缺失操作。它的主要優(yōu)點是操作簡單、識別位點選擇多、試驗周期較短、成本較低、快捷高效。

2.2 類轉錄激活子蛋白（TALEN）技術

TALEN 技術主要是由類轉錄激活子（Transcription activa tor-like effector，TALE）和DNA 內切酶（FokⅠ）兩部分發(fā)揮作用。TALE 主要作用為識別并特異結合靶DNA，FokⅠ的主要作用為內切酶切割TALE 識別的DNA 位點。TALE 由四部分組成，分別是：遷移域（Translocation domain，TD）、DNA 特異識別結合域、核定位域（Nuclear localization signal，NLS）和激活結構域（Activation domain，AD）4 部分構成。其中，TALE 中部DNA 特異識別結合域是由一系列數目不定的串聯重復氨基酸單元組成。每個重復單元只能識別1 個核苷酸。TALE 識別DNA 位點后，FokⅠ將DNA 鏈切割，通過基因敲除，將目標基因缺失。TALEN 技術的發(fā)明使得基因敲除的效率明顯提高，因此，在小鼠、斑馬魚、擬南芥等基因工程研究熱門物種中得到廣泛應用。

2.3 ZFN 技術

ZFN 由鋅指蛋白（ZFP）和DNA 內切酶（FokⅠ）兩部分組成。該技術的原理是：ZFP 識別并特異結合目標DNA 序列，FokⅠ切割目標DNA。細胞再通過非同源類末端接合或同源重組等方式對目標基因進行修復，改變目標DNA 序列，從而達到基因敲除的目的。ZFP 一般是由3～6 個鋅指結構域串聯組成，多個鋅指結構的優(yōu)點在于可識別較長的目標DNA 序列，而發(fā)揮切割作用至少需要兩個FokⅠ形成的二聚體，在二聚體的中間切割DNA。

ZFN 是第一代人工DNA 內切酶技術，與傳統(tǒng)的DNA 干擾技術相比，ZFN 技術提高了基因組的編輯效率，操作簡單，可以快速敲除目的基因。

2.4 Cre/LoxP 系統(tǒng)/FLP-FRT 系統(tǒng)

Cre/LoxP 系統(tǒng)由大腸桿菌噬菌體的Cre 重組酶和LoxP 位點兩部分組成。Cre 重組酶蛋白可以切除同向重復的2 個LoxP 位點內的DNA 片段。該系統(tǒng)的原理是：在Cre 基因啟動子的誘導下，Cre 重組酶蛋白得以表達，進而將LoxP 位點之間的基因切除。研究者可以通過對誘導劑誘導時間的控制，調節(jié)編碼Cre/LoxP 系統(tǒng)在轉移到動物體內后，再進行識別動物的組織細胞中LoxP 位點，實現控制該系統(tǒng)在正確的點位進行基因敲除。

FLP-FRT 系統(tǒng)[FLP 重組酶-FLP 識別目標（Flp recognition tar get，FRT）]的作用機理與Cre/loxP 系統(tǒng)的機理類似，FLP 也是位點特異的重組酶，再通過FRT 在FLP 識別位點對基因進行切割再鏈接，使目標基因得以缺失。與TALEN 技術和ZFN 技術相同，這些技術都需要特異性識別、切割蛋白系統(tǒng)。

2.5 Red 同源重組技術

Red 同源重組技術主要是在表達質粒上來實現的。在表達質粒上的含有Red 重組酶的exo、beta 和gam 這3 種基因，exo和beta 基因表達后形成兩種蛋白，它們偶聯結合形成復合物，特異性的識別外源基因并與之結合，與宿主細菌的染色體上的同源基因發(fā)生重組，而gam 的表達蛋白作用是抑制宿主細菌特異識別降解外源DNA，達到保護外源插入目的基因的目的。整合到宿主細菌后，質粒再通過同源重組將帶有宿主DNA 的片段切除，達到基因缺失的目的。

3 基因缺失動物疫苗研發(fā)及應用

3.1 豬基因缺失疫苗的研發(fā)

豬是我國畜牧業(yè)最主要的養(yǎng)殖動物。近年來，養(yǎng)豬業(yè)遭受非洲豬瘟（African swine fever，ASF）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2（porcine circovirus type 2，PCV2）等致病微生物的侵襲，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。目前，借助基因缺失技術研究豬用疫苗取得很多進展。

張艷艷等將我國首例非洲豬瘟疫情中分離的流行毒株（SY18）作為親本株，運用同源重組缺失技術篩選構建了ASF 病毒中的免疫抑制（MGF）基因和（CD2V）基因缺失的非洲豬瘟病毒基因缺失疫苗候選株，試驗結果顯示MGF 和CD2V 雙基因缺失株（ASF SY18ΔMGF／ΔCD2V）對豬安全，接種豬能夠100%抵抗親本強毒株SY18 株的攻擊，可以作為非洲豬瘟疫苗候選株。唐雯利用CRISPR/Cas9 技術結合同源重組技術對PCV2 和偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）的四個基因位點敲除后，找到TK-/gE-/gI-/Cap+重組偽狂犬病毒株，這為開發(fā)二聯PCV2/PRV二聯疫苗奠定了基礎。

3.2 家禽基因缺失疫苗的研發(fā)

家禽養(yǎng)殖周期短，蛋和肉產品是百姓餐桌上常見的食品。但是家禽的許多疾病具有傳播快、變異快的特點。而且多種禽流感病毒還是人畜共患病的致病因素，為預防增加了難度。家禽的基因缺失疫苗在多致病病源上都取得突破。

楊森等利用雞馬立克病病毒（MDV）在疫苗株和強毒株之間具有明顯的序列差異性這一特點。運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術，以MDV 疫苗株meq 基因為靶點，設計合成gRNA，克隆構建pX459-gRNA 質粒，成功構建出1 株meq 基因缺失毒株（CVI988Δmeq-C7），為后續(xù)篩選和鑒定抗MDV 疫苗株奠定了基礎。Zou 等研制出一種同時對鴨腸炎病毒（DEV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1 均有效的新型疫苗，這項研究利用CRISPR/Cas9 介導的基因編輯系統(tǒng)，高效地獲得了同時編碼HPAIV H5N1 血凝素（HA）基因和膜前蛋白（PrM）基因以及DTMUV 包膜糖蛋白（E）基因的DEV 重組蛋白。DEV 重組蛋白對H5N1 和DTMUV 均有較強的體液免疫和細胞免疫應答，對H5N1、DTMUV 和DEV 均有較強的保護作用。此項研究首次證明CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠快速、高效地對DEV 基因組進行改造，重組缺失病毒株可以作為一種潛在的鴨傳染性胃腸炎三價疫苗來預防H5N1、DTMUV 和DEV 感染。

3.3 牛、羊基因缺失疫苗的研發(fā)

牛皰疹病毒Ⅰ型（BHV-1）可引發(fā)牛傳染性鼻氣管炎，對養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經濟損失。穆艷霞應用CRISPR/Cas9 基因編輯與同源重組技術，構建帶有增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluo rescent protein，EGFP）標記并缺失E 糖蛋白（glycoprotein E，gE）的重組BHV-1 病毒（BHV-1 gE/EGFP）。這項研究探索了利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進行BHV-1 gE 基因的缺失編輯，為構建高效的BHV-1 基因缺失毒株提供了一種思路，為今后基因缺失疫苗的研制提供依據。

羊傳染性膿皰（Contagious ecthyma，CE）是由羊傳染性膿皰病毒（Orf virus，ORFV）引起的一種急性人獸共患傳染病。周帥帥利用同源重組技術構建ORFV-SY17 株122 基因缺失病毒株（OR FV-SY17△122），經過驗證基因缺失株的復制能力得到明顯削弱，為研發(fā)ORFV 疫苗提供理論基礎。

3.4 其它養(yǎng)殖動物基因缺失疫苗的研發(fā)

水產養(yǎng)殖疫苗是近年新興的一類疫苗，區(qū)別于傳統(tǒng)的消毒劑和抗菌藥，可以減少水產品中的藥物殘留。殺魚愛德華氏菌（Ed wardsiella piscicida）是一種常見水生致病菌，它感染范圍廣，傳染能力強，對水產養(yǎng)殖業(yè)行業(yè)危害巨大。周鵬運用同源重組的基因敲除方法將該菌crp 基因敲除，獲得Δcrp 基因缺失株，試驗表明crp 基因缺失菌毒力顯著下降，具有進一步開發(fā)為減毒活疫苗的潛質。

4 展望

基因缺失技術發(fā)展到今天已經經過三代，隨著科學家對各種生物體基因組特性的深入了解，必定會找到更加先進的DNA 識別和酶切組合，目前應用較多的是CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，已經在動物疫苗的研究中廣泛應用?；蛉笔游镆呙缗c傳統(tǒng)的動物疫苗相比，該項技術可以精確地將病原基因敲除，操作簡便，成本較低。基因缺失疫苗具有免疫標識，利用缺失的基因可以進行野生型感染和疫苗免疫的診斷，已成為新型疫苗研究開發(fā)的主流。

但是，目前也有關于基因缺失疫苗返毒突變?yōu)閺姸局甑膱蟮溃S著基因缺失技術的不斷完善，基因缺失疫苗會成為研究新型動物疫苗的有效手段之一。