康 舒，厲思雅，楊蓓思，楊曉妍，崔恒林，侯 靖

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

我國(guó)新疆、西藏、內(nèi)蒙古和青海等地天然鹽(堿)湖以及東部沿海地區(qū)鹽場(chǎng)中嗜鹽古菌的多樣性得到了系統(tǒng)而深入的研究[4-8]。雖然有研究表明食用鹽中含有豐富的嗜鹽古菌[9-11]，但是只有少量的研究報(bào)道涉及食用鹽中嗜鹽古菌的多樣性[12-13]。

我國(guó)是食用鹽生產(chǎn)大國(guó)，原料來(lái)源多樣，包括海水、地下鹽礦和內(nèi)陸鹽湖。在鹽的生產(chǎn)過程中，原料中的大部分嗜鹽古菌被捕獲在鹽晶體中并且能夠長(zhǎng)期存活。本研究以我國(guó)不同產(chǎn)地、不同來(lái)源的腌制鹽為研究對(duì)象，采用高鹽培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，基于16S rRNA基因序列判斷菌株分類學(xué)地位，并對(duì)不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)選取五種不同產(chǎn)地的腌制鹽，樣品基本信息如表1所示。

表1 腌制鹽樣品基本信息

DNA引物：北京諾賽基因組研究中心有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA marker：寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；高壓滅菌器：日本Hirayama公司；超凈臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離培養(yǎng)

菌株分離采用NHM(neutral haloarchaeal medium)培養(yǎng)基[14]。NHM培養(yǎng)基配方如下：酵母提取物(Oxoid)0.05 g/L，魚蛋白胨0.25 g/L，丙酮酸鈉1.0 g/L，KCl 5.4 g/L，CaCl20.29 g/L，NH4Cl 0.27 g/L，MgSO4·7H2O 26.8 g/L，MgCl2·6H2O 23.0 g/L，NaCl 184.0 g/L，K2HPO40.3 g/L，pH 7.0～7.2。培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min，固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂。

無(wú)菌條件下稱取適量樣品，溶解于一定體積的150 g/L NaCl溶液中，使NaCl溶液質(zhì)量濃度為300 g/L。吸取0.5 mL樣品于4.5 mL無(wú)菌NaCl溶液中，混勻，此為10-1稀釋梯度。重復(fù)上述過程2次，得到10-3稀釋梯度樣品。分別吸取每個(gè)稀釋梯度樣品0.2 mL，均勻涂布于NHM平板，用保鮮膜包好平板，于37 ℃倒置培養(yǎng)一個(gè)月。做三組平行實(shí)驗(yàn)。待平板上菌落生長(zhǎng)后，選擇菌落數(shù)在25～250的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，進(jìn)行2～3次平板劃線分離，獲得單菌落純培養(yǎng)物。

（3）研究結(jié)果驗(yàn)證了融資約束的擴(kuò)大振幅的作用，因此企業(yè)的融資約束程度需要控制在合理范圍內(nèi)，不能盲目地緩解企業(yè)融資約束。同時(shí)，實(shí)證結(jié)果顯示代理成本的作用機(jī)制較為突出，企業(yè)應(yīng)該完善內(nèi)部治理機(jī)制，降低雙重委托代理問題對(duì)海外直接投資經(jīng)濟(jì)后果的負(fù)向影響 （謝偉峰和陳省宏，2016）［15］。只有在公司治理和內(nèi)部控制初見成效后解決融資約束問題，才是企業(yè)持續(xù)健康發(fā)展之根本。由于債權(quán)融資本質(zhì)上也是借貸關(guān)系，對(duì)于降低企業(yè)杠桿率沒有幫助，在企業(yè)杠桿率高企的當(dāng)下，我國(guó)需要大力發(fā)展股權(quán)融資這一直接融資渠道，發(fā)揮股權(quán)融資在公司治理機(jī)制中的作用。

1.3.2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

采用菌落PCR的方法擴(kuò)增嗜鹽古菌16S rRNA基因。具體方法如下：取少量菌體于50 μL無(wú)菌雙蒸水中，沸水浴10 min裂解細(xì)胞，裂解液作為PCR模板。嗜鹽古菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增的特異性引物為20F(5′-ATTCCGGTTGATCCTGCCGG-3′)和1452R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3′)。采用PCR擴(kuò)增試劑盒配制PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.3 16S rRNA基因序列比對(duì)

測(cè)得16S rRNA基因序列采用Seqman軟件處理后，與Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net)數(shù)據(jù)庫(kù)[15]中16S rRNA基因進(jìn)行一致性對(duì)比，以確定菌株分類學(xué)地位。

1.3.4 物種多樣性分析

通常認(rèn)定與已發(fā)表菌株16S rDNA相似性小于98.65 %為疑似新種[16]，相似性小于95 %為疑似新屬[17]。根據(jù)基于16S rRNA基因序列確定的菌株分類地位，計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)(H′)、Margalef豐富度指數(shù)(DMg)、Shannon均勻度指數(shù)(E)和Berger-Parker優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(d)[18]，分析不同腌制鹽樣品中嗜鹽古菌多樣性差異。

1.3.5 群落組成差異分析

采用OmicShare Tools的動(dòng)態(tài)PCoA工具分析不同腌制鹽樣品的群落結(jié)構(gòu)差異，計(jì)算Bray-Curtis距離，獲得距離關(guān)系熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌總數(shù)

五種不同產(chǎn)地的腌制鹽樣品經(jīng)稀釋涂布培養(yǎng)，均獲得了較多菌落，表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分離培養(yǎng)方法對(duì)腌制鹽中嗜鹽古菌的分離是有效的。不同腌制鹽樣品中嗜鹽古菌總數(shù)如表2所示。中鹽樣品的嗜鹽古菌總數(shù)最多，達(dá)1.88×106CFU/g，其次是小伙子、茶卡樣品，嗜鹽古菌總數(shù)分別為1.70×104和2.85×103CFU/g。嗜鹽古菌總數(shù)最少的是雪天和海灣樣品，分別為4.11×102和2.21×102CFU/g。雪天和海灣樣品均為加碘(KIO3)鹽，因此推測(cè)KIO3可能對(duì)菌落形成有一定影響。

表2 不同腌制鹽中嗜鹽古菌總數(shù)

2.2 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌鑒定

經(jīng)多次劃線分離獲得單菌落純培養(yǎng)物，通過16S rDNA測(cè)序鑒定其分類學(xué)地位。相對(duì)豐度大于10%的定義為優(yōu)勢(shì)類群。表3和表4總結(jié)了不同腌制鹽樣品可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落構(gòu)成及疑似新類群。海灣樣品共分離出48株嗜鹽古菌，分屬于4個(gè)屬的10個(gè)分類單元，另有4株疑似新種，其中Haloarculamarismortui、Natronomonasmoolapensis、Halobacteriumrubrum為優(yōu)勢(shì)類群，占比分別為37.5%、16.7%、12.5%。中鹽樣品共分離出48株嗜鹽古菌，分屬于5個(gè)屬的7個(gè)分類單元，另有12株疑似新種和12株疑似新屬，其中Natronomonasmoolapensis為優(yōu)勢(shì)類群，占比為22.9%。小伙子樣品共分離出93株嗜鹽古菌，分屬于12個(gè)屬的23個(gè)分類單元，另有14株疑似新種和5株疑似新屬，其中Halolaminasediminis、Halobacteriumrubrum為優(yōu)勢(shì)類群，占比分別為21.5%和20.4%。雪天樣品共分離出38株嗜鹽古菌，分屬于2個(gè)屬的3個(gè)分類單元，另有1株疑似新種，其中Halobacteriumrubrum、Halobacteriumnoricense為優(yōu)勢(shì)類群，占比分別為60.5%和31.6%。茶卡樣品共分離出115株嗜鹽古菌，分屬于6個(gè)屬的12個(gè)分類單元，另有14株疑似新種和2株疑似新屬，其中Halobacteriumnoricense、Halobacteriumrubrum為優(yōu)勢(shì)類群，占比分別為34.8%和20.0%。小伙子樣品分離得到的類群最多，雪天樣品分離得到的類群最少。Halobacteriumrubrum在4種腌制鹽樣品中均為優(yōu)勢(shì)類群。雪天和茶卡樣品的優(yōu)勢(shì)類群一樣，可能是因?yàn)閮煞N鹽同為湖鹽。5種腌制鹽樣品中均分離得到嗜鹽古菌新類群，尤其是中鹽、小伙子和茶卡樣品，暗示著我國(guó)腌制鹽樣品中存在大量的嗜鹽古菌新物種。

表3 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落構(gòu)成

表4 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌疑似新類群

續(xù)表4:

2.3 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌多樣性分析

腌制鹽樣品中嗜鹽古菌屬水平相對(duì)豐度如圖1所示。海灣樣品優(yōu)勢(shì)屬為Haloarcula、Natronomonas和Halobacterium，中鹽樣品優(yōu)勢(shì)屬為Natronomonas和Halorientalis，小伙子樣品優(yōu)勢(shì)屬為Halobacterium和Halolamina，雪天樣品優(yōu)勢(shì)屬為Halobacterium，茶卡樣品優(yōu)勢(shì)屬為Halobacterium和Halolamina。比利時(shí)學(xué)者對(duì)26種食用鹽中嗜鹽古菌多樣性進(jìn)行研究，得出Haloarcula、Halobacterium和Halorubrum是食用鹽中的優(yōu)勢(shì)類群。本研究中，Haloarcula為海灣樣品中的優(yōu)勢(shì)屬，Halobacterium在4種樣品中均為優(yōu)勢(shì)屬。Halorubrum在本研究的5種腌制鹽樣品中均不是優(yōu)勢(shì)類群。這些結(jié)果表明，不同的食用鹽中嗜鹽古菌群落組成不盡相同。Haloarcula和Halobacterium屬的嗜鹽古菌在腌制食品中也廣泛存在[19]。隨著腸道菌群研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Halobacterium和Halorubrum屬的嗜鹽古菌存在于人體腸道內(nèi)，可能是通過食用鹽或腌制食品攝入，但是嗜鹽古菌對(duì)人類健康的影響尚未明確。

基于16S rRNA基因序列分析獲得菌株分類地位，對(duì)不同腌制鹽樣品物種多樣性水平進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表5所示。小伙子樣品和中鹽樣品的Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高，雪天樣品的Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最低，表明小伙子樣品和中鹽樣品具有較高的物種多樣性，雪天樣品物種分布較單一。雪天樣品的Berger-Parker優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最高，表明其優(yōu)勢(shì)物種的優(yōu)勢(shì)地位最明顯，這與優(yōu)勢(shì)類群分析結(jié)果一致。雪天樣品兩個(gè)優(yōu)勢(shì)類群總占比高達(dá)92.1%，遠(yuǎn)高于其他4個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)類群總占比。多樣性分析結(jié)果表明，由于原料來(lái)源及加工方式等不同，不同腌制鹽形成了各自獨(dú)特的嗜鹽古菌群落結(jié)構(gòu)。

圖1 腌制鹽樣品中嗜鹽古菌屬水平相對(duì)豐度

表5 不同腌制鹽樣品中可培養(yǎng)嗜鹽古菌多樣性指數(shù)

2.4 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落組成差異分析

計(jì)算腌制鹽樣品Bray-Curtis距離，關(guān)系熱圖如圖2所示。雪天和茶卡樣品群落組成結(jié)構(gòu)最相似，推測(cè)因?yàn)檠┨禧}和茶卡鹽同為湖鹽。茶卡和小伙子樣品群落組成較相似，其他樣品群落組成結(jié)構(gòu)存在較大差異。雪天和中鹽樣品群落組成差異最大。

圖2 腌制鹽樣品Bray-Curtis距離關(guān)系熱圖

3 結(jié)論

我國(guó)是食用鹽生產(chǎn)大國(guó)，對(duì)腌制鹽中嗜鹽古菌多樣性的研究能夠豐富和完善嗜鹽古菌物種資源，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，不同腌制鹽中均蘊(yùn)藏著豐富的嗜鹽古菌資源，尤其是較高比例的新類群，但是群落組成結(jié)構(gòu)不盡相同。小伙子樣品和中鹽樣品具有較高的物種多樣性，雪天樣品物種分布較單一。群落組成差異分析表明兩種湖鹽群落組成結(jié)構(gòu)最相似。在后期研究中，將結(jié)合高通量測(cè)序和培養(yǎng)條件優(yōu)化，進(jìn)一步系統(tǒng)深入地探究我國(guó)腌制鹽中嗜鹽古菌的多樣性。