黃曉偉 王雙雙 鄭佳露 陳 雷 彭 驍 陳錦芳 安紅梅 胡 兵△

(1．上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)腫瘤研究所，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200032； 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技處，上海 200032)

中醫(yī)藥在大腸癌的治療中發(fā)揮了重要作用，根據(jù)大腸癌的臨床表現(xiàn)，將其歸為中醫(yī)學(xué)積聚、臟毒、腸覃等范疇。我們?cè)谂R床實(shí)踐基礎(chǔ)上，以解毒、利濕、健脾立法，研發(fā)了治療大腸癌的抗癌中藥復(fù)方藤龍補(bǔ)中湯(專(zhuān)利號(hào)：ZL200910197565)，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，藤龍補(bǔ)中湯可調(diào)控多基因表達(dá)，抑制大腸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并改善患者免疫功能[1-7]。我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察藤龍補(bǔ)中湯提取物對(duì)大腸癌荷瘤小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠30只，6周齡，體質(zhì)量(18±2)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房(倫理號(hào)：202112025Z)，所有小鼠自由飲水。

1.2 主要試劑 小鼠大腸癌CT26細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；復(fù)方斑蝥膠囊(貴州益佰制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z52020238)；無(wú)菌水溶解藤龍補(bǔ)中湯提取物(上海中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備[8])；干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素12(IL-12)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(英國(guó)Abcam公司)；小鼠CD3、CD4、CD8、自然殺傷(NK)細(xì)胞1.1及其同型抗體(美國(guó)BD生物科學(xué)公司)；紅細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；磷酸緩沖液(瑞典Medicago公司)。

1.3 皮下移植瘤模型制備及干預(yù) 所有小鼠飼養(yǎng)1周后進(jìn)行CT26細(xì)胞皮下注射。CT26細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化、計(jì)數(shù)，用磷酸緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液，無(wú)菌操作于每只小鼠皮下注射細(xì)胞懸液0.1 mL，待腫瘤生長(zhǎng)至可測(cè)量范圍時(shí)，即為造模成功。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、復(fù)方斑蝥膠囊組和藤龍補(bǔ)中湯組，每組10只，分別予無(wú)菌水、復(fù)方斑蝥膠囊195 mg/kg和無(wú)菌水溶解藤龍補(bǔ)中湯提取物2.56 g/kg灌胃，每次0.2 mL，每日1次，共15 d。均予飼料，自由飲用無(wú)菌水，灌胃結(jié)束后取血、處死小鼠，稱(chēng)量脾、胸腺質(zhì)量，按公式計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×10。

1.4 免疫細(xì)胞檢測(cè) 小鼠處死前，每組取3只小鼠，通過(guò)眼眶取血，取150 μL抗凝血至離心管中，加入2%牛血清白蛋白溶液10 μL，混勻，室溫封閉10 min，同型對(duì)照組加入CD3、CD4、CD8同型抗體20 μL或NK1.1同型抗體2 μL，待測(cè)樣品加入CD3、CD4、CD8抗體20 μL或NK細(xì)胞1.1抗體2 μL，室溫孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液1.2 mL，室溫避光裂解2 min，至澄清透明，將上樣管以1600 r/min離心6 min，棄上清液，然后再加入磷酸緩沖液2 mL，輕微震蕩混勻，離心6 min，棄上清，重復(fù)洗2次，加入0.9%氯化鈉注射300 μL中，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(DxFLEX型，Beckman)上機(jī)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 小鼠處死前，每組取4只，小鼠取100 μL血清加入冰浴上的酶標(biāo)包被板孔里，4 ℃輕搖過(guò)夜，倒出液體，1 × 洗滌液洗滌4次，加1×檢測(cè)抗體100 μL，室溫輕搖1 h，倒出液體，1 × 洗滌液洗滌4次，加1 × 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素100 μL,室溫輕搖45 min，倒出液體，1 × 洗滌液洗滌4次，加底物100 μL，室溫避光孵育30 min，加終止液50 μL，酶標(biāo)儀(Synergy HTX型，BioTek)450 nm檢測(cè)輔助型T淋巴細(xì)胞1(Th1)型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12光密度，結(jié)果以對(duì)照組倍數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 3組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較 復(fù)方斑蝥膠囊組、藤龍補(bǔ)中湯組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均高于對(duì)照組(P<0.05)；藤龍補(bǔ)中湯組胸腺指數(shù)高于復(fù)方斑蝥膠囊組(P<0.05)；復(fù)方斑蝥膠囊組與藤龍補(bǔ)中湯組脾指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較

2.2 3組免疫細(xì)胞比較 復(fù)方斑蝥膠囊組、藤龍補(bǔ)中湯組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞均高于對(duì)照組(P<0.05)；藤龍補(bǔ)中湯組CD4+T淋巴細(xì)胞低于復(fù)方斑蝥膠囊組(P<0.05)，藤龍補(bǔ)中湯組CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞均高于復(fù)方斑蝥膠囊組(P<0.05)；復(fù)方斑蝥膠囊組與藤龍補(bǔ)中湯組CD3+T淋巴細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組免疫細(xì)胞比較

2.3 3組Th1型細(xì)胞因子比較 復(fù)方斑蝥膠囊組、藤龍補(bǔ)中湯組IFN-γ、IL-12均高于對(duì)照組(P<0.05)；藤龍補(bǔ)中湯組IFN-γ、IL-12均高于復(fù)方斑蝥膠囊組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組Th1型細(xì)胞因子比較

3 討論

藤龍補(bǔ)中湯由藤梨根、龍葵、蛇莓、白術(shù)、茯苓、薏苡仁、半枝蓮、槲寄生組成，其中藤梨根、龍葵解毒利濕，蛇莓解毒抗癌，白術(shù)、茯苓、薏苡仁健脾利濕，半枝蓮、槲寄生協(xié)同抗癌，全方共奏解毒、利濕、健脾功效。前期研究顯示，藤龍補(bǔ)中湯可抑制大腸癌腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡，調(diào)節(jié)免疫功能[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，龍葵多糖可提高荷瘤小鼠胸腺指數(shù)，升高IFN-γ，增加T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腫瘤組織的浸潤(rùn)[9-10]。白術(shù)多糖可激活T淋巴細(xì)胞[11]，升高CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞[12]。茯苓可升高IL-2和IFN-γ，調(diào)節(jié)免疫功能[13-14]。薏苡仁可升高IFN-γ、IL-2，提高CD4+T淋巴細(xì)胞，改善細(xì)胞免疫功能[15-16]。

參與抗腫瘤免疫的T淋巴細(xì)胞主要包括CD4+和CD8+。CD4+由胸腺來(lái)源Th0 細(xì)胞在IL-12的作用下分化為T(mén)h1細(xì)胞，進(jìn)而分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，激活CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)執(zhí)行抗腫瘤免疫；也可在IL-4作用下分化為T(mén)h2細(xì)胞，分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，參與體液免疫調(diào)控[17]。NK細(xì)胞是抗腫瘤固有免疫的主要細(xì)胞群體，可非特異殺傷腫瘤細(xì)胞，是腫瘤免疫治療的重要細(xì)胞[18-19]。

本研究結(jié)果顯示，藤龍補(bǔ)中湯可升高大腸癌荷瘤小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)，提高外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，同時(shí)升高IL-12、IFN-γ水平，提示藤龍補(bǔ)中湯可改善大腸癌荷瘤小鼠免疫功能，激發(fā)Th1型免疫反應(yīng)。