劉思雨 郎曉猛 劉建平△ 康 欣

(1.河北省寧晉縣醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，河北 邢臺 055550；2.河北省中醫(yī)院脾胃病科，河北 石家莊 050011)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是腸道的慢性炎癥病變，以黏液膿血便反復(fù)發(fā)作為外在表現(xiàn)，亦可有腹痛、腹瀉、里急后重等伴隨癥狀，甚至伴有其他腸外表現(xiàn)。我國UC的發(fā)病率約為11.6/10萬，且近年來呈明顯上升及年輕化趨勢[1]。目前UC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，因其反復(fù)發(fā)作，日久不愈，可給患者帶來極大痛苦和負(fù)擔(dān)，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為難治性疾病之一。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，研究者逐漸認(rèn)識到UC反復(fù)發(fā)作可能與腸道菌群存在著千絲萬縷的聯(lián)系，腸道菌群失衡與恢復(fù)，進(jìn)而引起UC癥狀的加重與緩解[2]。健脾泄?jié)峤舛痉绞桥R床常用的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究發(fā)現(xiàn)其對UC治療效果顯著[3]。為進(jìn)一步研究健脾泄?jié)峤舛痉椒乐蜺C的作用，我們通過觀察健脾泄?jié)峤舛痉綄C大鼠治療后及第2次造模后糞便中腸道菌群相對含量的變化，探討健脾泄?jié)峤舛痉筋A(yù)防UC復(fù)發(fā)的作用機(jī)制，以更好地應(yīng)用與指導(dǎo)臨床。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級Wistar大鼠85只，體質(zhì)量200～220 g，飼養(yǎng)于溫度21～25℃、相對濕度50%～60%的環(huán)境，均購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號:1804033。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 健脾泄?jié)峤舛痉?藥物組成：黃芪15 g，黨參15 g，茯苓15 g，車前子15 g，魚腥草15 g，大血藤10 g，敗醬草10 g，黃芩10 g，黃連10 g，生薏苡仁15 g，葛根20 g，木香6 g。均采用廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒)；柳氮磺胺吡啶片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020557，0.25 g/片)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(美國Sigma公司)；基因組DNA抽提試劑盒 (美國Omega Bio-Tek公司)；SYBR Green熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；PE-9600基因擴(kuò)增儀(美國PE公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-PCR)分析儀(美國ABI公司)；Chemix-180全自動(dòng)生化分析儀(日本希森美康公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 第一次造模及分組 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只大鼠設(shè)為空白組，其余75只參照文獻(xiàn)[4]完成復(fù)發(fā)性UC模型的第一次造模，具體方法：①禁食不禁水24 h后，以10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射，完全麻醉后，將四肢固定在操作臺上，呈仰臥位；②將2 mm硅膠管連接2 mL注射器，按100 mg/kg抽取TNBS與50%乙醇的混合液，以石蠟油潤滑后，由肛門輕緩插入結(jié)腸8 cm處，輕輕推入；③為防止藥物溢出，使藥物與腸黏膜充分接觸，緩慢拔出后倒置大鼠，捏緊肛門15 min，再仰臥放回鼠籠，待蘇醒。期間死亡3只大鼠。正常喂養(yǎng)3 d后將剩余72只大鼠隨機(jī)分為模型組、柳氮磺胺吡啶組、健脾泄?jié)峤舛痉降蛣┝拷M及健脾泄?jié)峤舛痉礁邉┝拷M，每組18只，各組再隨機(jī)處死2只大鼠，觀察結(jié)腸組織充血、水腫、潰瘍等情況，確定造模成功。

1.4.2 給藥與糞便標(biāo)本留取 除空白組正常喂養(yǎng)外，模型組予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃，柳氮磺胺吡啶組予柳氮磺胺吡啶混懸液0.3 g/kg灌胃，健脾泄?jié)峤舛痉降?、高劑量組分別予健脾泄?jié)峤舛痉剿幰?.0、16.0 g/kg灌胃，均每日1次。灌胃14 d后，禁食不禁水24 h，空白組隨機(jī)取5只大鼠，其余各組隨機(jī)取8只大鼠，處死后留取大鼠結(jié)腸病變嚴(yán)重處糞便≥1 g，-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

1.4.3 第2次造模與標(biāo)本留取 將模型組、柳氮磺胺吡啶組、健脾泄?jié)峤舛痉降蛣┝拷M及健脾泄?jié)峤舛痉礁邉┝拷M剩余大鼠按30 mg/kg予TNBS與50%乙醇的混合液進(jìn)行第2次造模灌注[4]，繼續(xù)正常喂養(yǎng)2 d后，禁食不禁水24 h，各組大鼠全部處死，糞便標(biāo)本留取同1.4.2項(xiàng)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法 比較各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后糞便標(biāo)本中乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)情況，real time-PCR法進(jìn)行檢測。①各組均準(zhǔn)確稱取200 mg 糞便樣品到2 mL離心管內(nèi)，按試劑盒說明提取總DNA；②根據(jù)腸道菌群的16S rRNA基因序列，在BLAST基因庫內(nèi)應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)菌屬的PCR引物；③采用SYBR Green染料進(jìn)行熒光信號的收集，按試劑盒說明書操作，獲得溶解曲線，應(yīng)用三步法反應(yīng)程序,預(yù)變性95 ℃ 10 min，然后40個(gè)循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后一個(gè)循環(huán)72 ℃持續(xù)2 min，分析結(jié)果；④擴(kuò)增完畢，獲得擴(kuò)增曲線后，得到各樣本各目的基因的Ct值，求所有樣本的Ct均值，采用2-△△Ct法計(jì)算樣品的DNA相對表達(dá)量。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)情況比較 與第1次造模治療后比較，柳氮磺胺吡啶組及健脾泄?jié)峤舛痉降蛣┝拷M第2次造模后乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達(dá)量均降低(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量均升高(P<0.05)，空白組、模型組及健脾泄?jié)峤舛痉礁邉┝拷M第2次造模后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第2次造模后組間比較，模型組乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達(dá)量均低于空白組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量均高于空白組(P<0.05)；健脾泄?jié)峤舛痉礁邉┝拷M乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達(dá)量均高于模型組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量均低于模型組(P<0.05)，而柳氮磺胺吡啶組及健脾泄?jié)峤舛痉降蛣┝拷M乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、3、4、5。

表2 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后乳酸桿菌相對表達(dá)量比較

表3 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后雙歧桿菌相對表達(dá)量比較

表4 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后腸桿菌相對表達(dá)量比較

表5 各組大鼠各組大鼠第1次造模治療后及第2次造模后腸球菌相對表達(dá)量比較

3 討論

腸道菌群是腸道內(nèi)寄居微生物的總稱，其種類多樣，數(shù)量龐大，也被稱作人的“第二器官”或“第二大腦”[5-6]。腸道菌群存在于人體生命的整個(gè)時(shí)期，對維持正常的生理和能量產(chǎn)生至關(guān)重要。生理狀態(tài)下腸道菌群數(shù)量與宿主及外部環(huán)境處于相對動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)態(tài)，在防御病原體侵犯、維生素合成、物質(zhì)代謝、促進(jìn)生長、抗衰老、抗癌等方面均起著關(guān)鍵的作用[6]。但如果動(dòng)態(tài)平衡被打破，則會(huì)引發(fā)各類疾病的產(chǎn)生，所以在很多疾病的預(yù)防及治療方面，腸道菌群的作用及影響因素可以為其提供參考[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)與UC的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)，腸道內(nèi)菌群紊亂，有害菌較有益菌數(shù)量占據(jù)主導(dǎo)，可導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能異常，局部微環(huán)境的改變，進(jìn)而引起腸道黏膜過度的炎性反應(yīng)，引起UC[8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，UC患者糞便中的雙歧桿菌、乳酸桿菌含量較健康人含量降低，口服雙歧桿菌膠囊后可使有益菌占據(jù)作用位點(diǎn)，促使腸道黏膜屏障得以重建，機(jī)體抗感染能力增強(qiáng)，進(jìn)而緩解UC病情，長遠(yuǎn)來看可預(yù)防UC復(fù)發(fā)[9]。

前期我們研究已經(jīng)證實(shí)，通過結(jié)腸灌注TNBS與50%乙醇的混合液成功復(fù)制UC模型后，大鼠糞便中乳酸桿菌及雙歧桿菌的相對含量可明顯減少，腸桿菌及腸球菌的相對含量可明顯升高，說明大鼠在UC狀態(tài)下存在腸道菌群失衡狀態(tài)[21]。經(jīng)相應(yīng)干預(yù)治療后，UC大鼠病情可得到明顯控制，癥狀減輕，糞便中乳酸桿菌及雙歧桿菌相對含量升高，腸桿菌及腸球菌相對含量降低，處于緩解期。繼而本研究又給予第2次造模刺激，與第1次造模治療后比較，柳氮磺胺吡啶組及健脾泄?jié)峤舛痉降蛣┝拷M第2次造模后乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達(dá)量均降低(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量均升高(P<0.05)，提示柳氮磺胺吡啶組及健脾泄?jié)峤舛痉降蛣┝拷M大鼠經(jīng)第2次造模刺激出現(xiàn)了UC復(fù)發(fā)的情況，腸道內(nèi)微環(huán)境相對不穩(wěn)定，在適宜情況下有害菌定植的可能性大大增加；而健脾泄?jié)峤舛痉礁邉┝拷M第2次造模后乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量較第1次造模治療后無明顯變化(P>0.05)，提示高劑量的健脾泄?jié)峤舛痉侥苡行ьA(yù)防和阻止第2次造模刺激導(dǎo)致的UC復(fù)發(fā)，穩(wěn)定腸道菌群平衡，具有持久效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌通過與腸上皮表面相關(guān)受體相結(jié)合而形成腸道菌膜屏障，其是維持腸道微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的重要菌屬，亦可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)腸道黏膜的抗感染作用，而被破壞的腸道黏液層可以被雙歧桿菌修復(fù)，從而阻止細(xì)菌的黏附，使腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)得以維持，適宜的內(nèi)環(huán)境能促進(jìn)其他有益菌的生長，又進(jìn)一步提高了腸道屏障的防御能力，也從側(cè)面解釋了健脾泄?jié)峤舛痉蒋熜艹志玫脑騕22]。第2次造模后組間比較，模型組乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達(dá)量均低于空白組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量均高于空白組(P<0.05)，再次證明了UC大鼠存在腸道菌群失衡狀態(tài)；健脾泄?jié)峤舛痉礁邉┝拷M乳酸桿菌及雙歧桿菌相對表達(dá)量均高于模型組(P<0.05)，腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量均低于模型組(P<0.05)，而柳氮磺胺吡啶組及健脾泄?jié)峤舛痉降蛣┝拷M乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及腸球菌相對表達(dá)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，也再次證實(shí)高劑量健脾泄?jié)峤舛痉骄哂辛己玫倪h(yuǎn)期療效，能有效持久的穩(wěn)定腸道菌群平衡，預(yù)防UC的復(fù)發(fā)，而柳氮磺胺吡啶及低劑量健脾泄?jié)峤舛痉降倪h(yuǎn)期療效較差，不能預(yù)防UC的復(fù)發(fā)。

綜上所述，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”，高劑量健脾泄?jié)峤舛痉侥芤阅c道菌群為作用靶點(diǎn)，通過提高乳酸桿菌、雙歧桿菌相對含量，降低腸桿菌、腸球菌相對含量，使有益菌較有害菌數(shù)量占據(jù)主導(dǎo)，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂狀態(tài)，進(jìn)而維持腸道微環(huán)境的長久穩(wěn)態(tài)，保持機(jī)體健康，有效預(yù)防UC復(fù)發(fā)。