王 亞，王越濤，申關(guān)望，王付華，王生軒，白 濤，尹海慶

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002；2.信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，河南 信陽 464000)

稻瘟病是我國水稻主產(chǎn)區(qū)的第一大毀滅性病害，由子囊菌(Magnaporthegrisea(Hebert)Barr)引起[1]。稻瘟病在發(fā)病嚴(yán)重的年份可導(dǎo)致水稻顆粒無收，嚴(yán)重制約了我國水稻生產(chǎn)的發(fā)展[2-3]。相比使用化學(xué)農(nóng)藥，種植抗稻瘟病水稻品種更能經(jīng)濟有效地控制稻瘟病。由于稻瘟病生理小種繁多且容易變異，抗病品種經(jīng)常喪失抗性而淪為感病品種，從而造成嚴(yán)重?fù)p失，生產(chǎn)上急需廣譜持久抗稻瘟病水稻新品種。稻瘟病抗性分為完全抗性(主效R基因控制)和部分抗性(非R基因控制)2種[4]。其中，完全抗性的主效基因易于操作，在水稻育種和生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用。部分抗性的抗性水平雖然較完全抗性低，但抗性相對穩(wěn)定和持久。完全抗性與部分抗性的結(jié)合利用將是未來水稻抗稻瘟病育種的方向和趨勢[5]。源自持久抗性品種谷梅4號的顯性主效R基因Pigm是一個包含多個NBS-LRR類抗病基因的基因簇，其中只有2個具有功能的蛋白質(zhì)PigmR和PigmS。PigmR可以發(fā)揮廣譜抗病功能，但會導(dǎo)致水稻千粒質(zhì)量降低，產(chǎn)量下降；PigmS則可以提高水稻的結(jié)實率，抵消PigmR對產(chǎn)量的影響，PigmS可以通過與PigmR競爭形成異源二聚體抑制PigmR介導(dǎo)的廣譜抗病性。但由于PigmS低水平的表達使得病原菌的進化選擇壓力變小，減緩了病原菌對PigmR的致病性進化，因此，Pigm介導(dǎo)的稻瘟病抗性更持久并且不影響最終產(chǎn)量[6]。bsr-d1是從廣譜持久抗病材料地谷中克隆的非R類廣譜抗稻瘟病基因。研究表明，由于Bsr-d1基因的啟動子區(qū)域一個關(guān)鍵堿基的變異，導(dǎo)致上游MYB轉(zhuǎn)錄因子對Bsr-d1啟動子結(jié)合增強而使得Bsr-d1基因表達受到抑制，進而導(dǎo)致Bsr-d1直接調(diào)控的H2O2降解酶基因表達下調(diào)，使H2O2降解減弱，細(xì)胞內(nèi)H2O2富集，提高了水稻的免疫反應(yīng)并因此獲得稻瘟病抗性；敲除Bsr-d1在增強水稻稻瘟病抗病性的同時，對產(chǎn)量性狀和稻米品質(zhì)沒有明顯影響，因而具有十分重要的應(yīng)用價值[7]。

稻米優(yōu)質(zhì)化是水稻生產(chǎn)“供給側(cè)改革”的重要內(nèi)容，也是水稻產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的重要抓手。水晶3號是河南省優(yōu)良食味水稻的標(biāo)志性品種，但由于稻瘟病抗性差，極大限制了該品種的推廣應(yīng)用，生產(chǎn)上急需具有廣譜持久稻瘟病抗性的優(yōu)質(zhì)稻品種。通過分子育種手段直接改良現(xiàn)有優(yōu)質(zhì)水稻資源的稻瘟病抗性，是培育抗稻瘟病優(yōu)質(zhì)水稻新品種的快速有效手段。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年迅速發(fā)展起來的能夠便捷、高效、精準(zhǔn)敲除靶基因的基因編輯技術(shù)，且成本低廉[8-10]。該技術(shù)主要原理是利用 gRNA與基因組上目標(biāo)序列的特異性識別，引導(dǎo)Cas9核酸酶在靶標(biāo)位置切割DNA使之雙鏈斷裂，進而導(dǎo)致基因組DNA在修復(fù)過程中發(fā)生堿基的缺失、插入或替換等特異性突變[11]。獲得的基因編輯材料通過后代自交分離能夠剔除外源基因，不會留下轉(zhuǎn)基因痕跡[12-13]。此外，隨著DNA 測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，測序成本大大降低，分子標(biāo)記檢測技術(shù)逐漸實現(xiàn)了高通量、低成本和自動化，為育種應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。選擇綜合性狀優(yōu)良的品種，針對其突出缺點，精準(zhǔn)導(dǎo)入目標(biāo)性狀基因，利用基于基因芯片的分子標(biāo)記檢測技術(shù)進行單個分子標(biāo)記的前景選擇和高通量的背景選擇能夠靈活、高效地實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助回交育種的目標(biāo)[14]，從而實現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的統(tǒng)一。

本研究首先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對優(yōu)良食味水稻品種水晶3號中的Bsr-d1進行定點編輯，在T0獲得純合的Bsr-d1敲除材料，經(jīng)自交分離獲得去除轉(zhuǎn)基因成分的T1純合敲除材料，然后以這些材料為母本與攜帶Pigm基因的金玉1號(粳稻)雜交并連續(xù)回交3代，采用武漢雙綠源公司的水稻綠色基因芯片(GSR40K)進行Pigm基因分子標(biāo)記選擇和高通量的背景選擇，獲得同時攜帶主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1且遺傳背景基本回復(fù)的水晶3號抗稻瘟病材料，從而為水稻抗稻瘟病育種提供有重要價值的材料。

1 材料和方法

1.1 水稻材料、載體與菌株

水晶3號來自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，金玉1號(轉(zhuǎn)育并攜帶Pigm基因)由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

CRISPR/Cas9雙元表達載體pBGK032來自百格基因科技(江蘇)有限公司。大腸桿菌DH-5α和農(nóng)桿菌EHA105由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所水稻研究室保存。

1.2 CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達載體構(gòu)建

利用targetDesign(http：//skl.scau.edu.cn/targetdesign/)進行g(shù)RNA靶位點的設(shè)計。根據(jù)水稻生物學(xué)網(wǎng)站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)提供的Bsr-d1(LOC_Os03g32230)基因序列，選擇PAM(Protospacer adjacent motif)序列(NGG)上游約20 bp片段為靶位點序列(GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA)，利用 NCBI 對水稻基因組進行 Blast 以分析確認(rèn)靶位點的特異性。靶位點序列正義鏈和反義鏈設(shè)計，是在靶序列的5′端添加GTGT，靶序列互補鏈的5′端添加AAAC，使其與質(zhì)粒經(jīng)BsaⅠ酶切后形成黏性互補末端：正義鏈GTGTGGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，反義鏈AAACTCTGCGGGAAGGCCTTCGCC。2條引物65 ℃退火5 min形成互補雙鏈 DNA，直接用于后續(xù)的載體構(gòu)建。

對pBGK032雙元載體進行酶切：pBGK032質(zhì)粒2 μg，10×NEB緩沖液5 μL，BsaⅠ 10 U，加ddH2O至50 μL。酶切后用DNA純化試劑盒進行純化，然后用T4連接酶將線性化的pBGK032(10 ng)與靶序列雙鏈 DNA(0.05 mmol/L)進行過夜連接，采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α。根據(jù)載體序列信息設(shè)計上下游引物Cas9-F/Cas9-R(Cas9-F：CCATGAAGCCTTTCAGGACATGTA，Cas9-R：ACGCTGCAAACATGAGACGGAGAA)進行PCR鑒定，經(jīng)測序驗證無誤的重組表達載體命名為CRISPR-Cas9-Bsr-d1，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 EHA105中。

1.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及無 T-DNA元件的bsr-d1純合突變體篩選

將攜帶CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105 轉(zhuǎn)化受體水稻品種水晶3號的愈傷組織，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選有抗性的再生組培苗即T0植株。將組培苗經(jīng)過煉苗后轉(zhuǎn)移到溫室種植，采用CTAB法于四葉期提取葉片DNA，用潮霉素抗性基因特異性引物Hyg-F/Hyg-R(Hyg-F：CGAGAGCCTGACCTATTGCAT，Hyg-R：CTGCTCCATACAAGCCAACCAC)進行PCR擴增，能擴增出481 bp目標(biāo)條帶的即為陽性轉(zhuǎn)基因植株。

設(shè)計能夠擴增含有CRISPR/Cas9靶序列的特異性引物(GP-F：GAGGTCGAAGTTCCTGACGG，GP-R：GGCGATCAACAAGGAGGAGT)，以上述陽性轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板擴增目的條帶(長度約為490 bp)，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測序，以野生型水晶3號Bsr-d1基因序列為參考，采用在線分析軟件DSDecodeM(http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/)對測序結(jié)果進行比對分析，以明確突變位點的具體情況。根據(jù)測序獲得的水晶3號不同類型突變體中的編碼序列，利用BioEdit軟件翻譯成蛋白質(zhì)序列并進行多重序列比對，然后將比對結(jié)果保存為Fasta格式，利用ClustalX軟件轉(zhuǎn)換為MSF格式，然后用GeneDoc軟件分析各突變單株氨基酸序列的變化情況。

篩選得到的T0純合突變株經(jīng)自交結(jié)實后得到T1種子，將T1種子播種成苗移栽后提取葉片基因組DNA，用載體特異引物Hyg-F/Hyg-R進行PCR擴增，無法擴增出目的條帶的植株即為無T-DNA成分的T1單株。

1.4 無T-DNA元件的bsr-d1純合突變體中抗稻瘟病基因 Pigm的導(dǎo)入

2019年夏季在原陽試驗基地以無T-DNA成分的T1單株為母本，以攜帶Pigm基因的金玉1號為父本，雜交獲得F1。2019年冬單株種植于溫室，利用武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司研制的GSR40K高密度水稻基因芯片(基于Illumina芯片制造技術(shù)開發(fā)的SNP 芯片，包含了豐富的多態(tài)性標(biāo)記、重要農(nóng)藝性狀的功能基因標(biāo)記和單倍型標(biāo)記以及用于定位 QTL標(biāo)記)，篩選出攜帶Pigm基因的單株，以野生型水晶3號為輪回親本，連續(xù)回交3代，采用GSR40K基因芯片同時進行目標(biāo)基因和背景選擇，獲得BC3F1。2020年冬選擇含Pigm基因且背景回復(fù)好的重組單株自交一次，獲得BC3F2。對BC3F2進行前景及背景選擇，最終獲得抗病基因(同時攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復(fù)的水晶3號改良系。

1.5 水晶3號改良株系幼苗期的葉瘟抗性鑒定

將同時攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號改良株系及其野生型對照培養(yǎng)至五葉期，剪取5～6 cm長的水稻頂端完全伸展的葉片，用接種針在主脈間隔一定距離劃3個傷口且不穿透葉片，然后置于平皿內(nèi)保濕的濾紙上。參考徐鵬等[15]的方法，將稻瘟病菌(GUY11由福建農(nóng)林科技大學(xué)劉建平老師提供)制成分生孢子懸浮液(2×105個/mL)。用移液槍在葉片傷口處點滴15 μL的孢子液，隨即在25 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)30 h。然后將光照時間調(diào)整為14 h，溫度保持在25 ℃，濕度飽和。接種后5 d觀察病斑大小。

1.6 水晶3號改良株系接種稻瘟病菌前后的生理指標(biāo)測定

將獲得的攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號改良株系及野生型對照材料培養(yǎng)至四葉一心期，用分生孢子懸浮液活體噴霧處理，分別在接種0，2，5 d時取葉片測定各材料生理指標(biāo)。利用商業(yè)化試劑盒(蘇州科銘)結(jié)合酶標(biāo)儀對過氧化物酶(POD)活性[16]和過氧化氫(H2O2)含量[17]進行測定(具體方法參照試劑盒說明書)，以上均以未接種的材料為對照，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bsr-d1靶位點設(shè)計和CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達載體構(gòu)建

首先對日本晴、水晶3號和地谷中Bsr-d1基因的功能位點區(qū)段進行PCR產(chǎn)物測序，發(fā)現(xiàn)地谷Bsr-d1基因啟動子功能位點的堿基為G，而水晶3號和日本晴在同一位點的堿基為A(圖1-A)，說明水晶3號不具有bsr-d1介導(dǎo)的稻瘟病抗性。然后根據(jù)日本晴中Bsr-d1基因序列設(shè)計擴增引物Bsr-d1-F/Bsr-d1-R(GCTCATCATCCATCCATCTC/GGCGACAATCAATCTTGG)，以水晶3號基因組DNA為模板進行 PCR 擴增并對擴增產(chǎn)物進行測序，發(fā)現(xiàn)水晶3號中Bsr-d1基因與數(shù)據(jù)庫中公布的日本晴Bsr-d1完全一致，整個CDS區(qū)只有1個外顯子，長度為663 bp，編碼220個氨基酸。根據(jù)CRISPR-Cas9靶位點設(shè)計原則，在Bsr-d1基因編碼區(qū)靠近ATG一端設(shè)計20 bp的gRNA靶序列GGCGAAGGCCTTCCCGCAGA，靶序列3′端為PAM序列CGG(圖1-B)。退火形成的雙鏈互補靶序列經(jīng)BsaⅠ酶切后與雙元載體pBGK032連接形成重組載體CRISPR-Cas9-Bsr-d1(圖1-B)。對重組質(zhì)粒進行 PCR 擴增，目標(biāo)片段長度約為361 bp，符合預(yù)期結(jié)果，表明CRISPR-Cas9-Bsr-d1表達載體構(gòu)建成功。選取驗證片段大小正確的菌株抽提質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證無誤后，將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105。

圖1 不同水稻品種中Bsr-d1基因啟動子的功能位點分析(A)及CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組載體信息(B)Fig.1 Functional locus of Bsr-d1 gene promoter in different rice varieties(A)and schematic information of the CRISPR-Cas9-Bsr-d1 recombinant vector(B)

2.2 T0轉(zhuǎn)基因陽性株的獲得及靶位點的突變分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建好的CRISPR-Cas9-Bsr-d1重組表達載體導(dǎo)入水晶3號愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選，共獲得34個獨立轉(zhuǎn)化體。將獲得的轉(zhuǎn)基因植株煉苗后轉(zhuǎn)移至溫室培養(yǎng)，四葉期時提取葉片DNA用潮霉素抗性基因引物Hyg-F/Hyg-R進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)34個獨立轉(zhuǎn)化體均攜帶有潮霉素抗性基因，陽性率達到100%(圖2)。為了解水晶3號中Bsr-d1基因的突變情況，以上述葉片DNA為模板用能夠擴增含有CRISPR/Cas9靶序列的特異性引物GP-F/GP-R進行PCR擴增(圖2)，并對 PCR 產(chǎn)物進行測序分析，利用在線分析軟件DSDecodeM進行序列解碼。結(jié)果表明，有21株陽性轉(zhuǎn)基因苗在靶位點處發(fā)生了突變，突變率為61.8%；突變基因型包括純合突變和雜合突變，其中有8株為純合突變，占38.1%，13株為雜合突變，占61.9%；純合突變類型包括堿基插入和缺失(圖3-A)，其中T插入占25.0%，GA缺失占37.5%，G插入及CGCA和CGCAGA堿基缺失各占12.5%。氨基酸序列比對結(jié)果表明，與野生型Bsr-d1基因的氨基酸序列相比，編輯后的Bsr-d1基因由于出現(xiàn)堿基的插入或缺失造成了移碼突變(SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2和SJ3-4)，導(dǎo)致氨基酸序列組成出現(xiàn)較大變化或翻譯提前終止；CGCAGA堿基缺失則導(dǎo)致了整碼突變，在77，78位置缺失了纈氨酸和半胱氨酸2個氨基酸，其他氨基酸則無變化(圖3-B)。以上突變體氨基酸的變化有可能造成蛋白質(zhì)功能的喪失。

Marker.2000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；+.Hyg基因的陽性對照；-.雙蒸水；1—34.34個T0 獨立轉(zhuǎn)化體。Marker.2000 bp DNA Marker；+.Positive control of Hyg；-.ddH2O；1—34.34 independent transformants in T0 generation.

2.3 無T-DNA元件的bsr-d1純合突變體篩選及抗稻瘟病基因 Pigm的導(dǎo)入

為快速獲得不包含T-DNA元件的bsr-d1純合突變株用于后續(xù)研究，將T0的5種類型的純合突變株系自交，結(jié)實后得到T1種子，將T1種子播種，成苗后提取葉片基因組DNA，用載體特異引物Hyg-F/Hyg-R進行PCR擴增，無法擴增出481 bp目的條帶的植株即為無轉(zhuǎn)基因成分的bsr-d1純合突變體(圖4)。以無轉(zhuǎn)基因成分的bsr-d1純合突變體基因組DNA為模板，利用靶點檢測特異性引物GP-F/GP-R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物測序表明無轉(zhuǎn)基因成分的bsr-d1純合突變體靶位點突變情況與T0是一致的，說明這5種Bsr-d1單基因突變類型在剔除Cas9載體骨架后能夠穩(wěn)定遺傳。

A．T0轉(zhuǎn)基因水晶3號的5 種純合突變體類型；B．Bsr-d1基因野生型及5種純合突變類型的氨基酸序列分析:SJ3.野生型,SJ3+T.T堿基插入,SJ3+G.G堿基插入,SJ3-2.GA堿基缺失,SJ3-4.CGCA堿基缺失,SJ3-6.CGCAGA堿基缺失。A.Five types of homozygous mutants of Shuijing 3 in T0 generation；B.Bsr-d1 gene amino acid sequences in the wild type and five homozygous mutant lines:SJ3.Wild type,SJ3+T.T base insertion,SJ3+G.G base insertion,SJ3-2.GA bases deletion,SJ3-4.CGCA bases deletion,SJ3-6.CGCAGA bases deletion.

Marker.2000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1—24.24個T1 單株。Marker.2000 bp DNA Marker；1—24.24 independent plants in T1 generation.

以無T-DNA成分的T1bsr-d1純合突變體為母本，以攜帶Pigm基因的金玉1號為父本，雜交獲得F1，利用GSR40K基因芯片篩選出攜帶Pigm基因的F1單株，以水晶3號為輪回親本，連續(xù)回交3代獲得BC3F1，根據(jù)芯片檢測結(jié)果選擇含Pigm基因且背景回復(fù)好的重組單株自交一次，獲得BC3F2，并篩選獲得抗病基因(同時攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復(fù)的水晶3號改良植株(圖5，以T堿基插入突變體為例)。攜帶Pigm基因的水晶3號bsr-d1純合突變體SJ3+T、SJ3+G、SJ3-2、SJ3-4、SJ3-6的背景回復(fù)率分別為97.86%，96.71%，97.39%，97.52%，96.79%，將以上水晶3號改良系依次命名為SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。

藍色.雜合基因位點；紅色.純合Pigm基因位點。Blue.Heterozygous gene locus；Red.Homozygous Pigm locus.

2.4 水晶3號改良株系幼苗期的葉瘟抗性鑒定

采用離體水稻葉片劃傷接種稻瘟病菌方法鑒定不同類型水晶3號改良株系幼苗期對稻瘟病菌的抗性，接種5 d后對病斑葉片進行拍照 (圖6)。從圖6可以看出，野生型水晶3號葉片感病比較嚴(yán)重，病斑面積明顯大于水晶3號各改良株系。以上結(jié)果表明，同時攜帶bsr-d1和Pigm基因的水晶3號各改良株系在幼苗期對稻瘟病菌生理小種GUY11引起的葉瘟抗性均明顯提高。但是否對其他稻瘟病菌生理小種產(chǎn)生抗性及穗頸瘟抗性如何，仍需進一步接種鑒定。

圖6 水晶3號改良株系及其野生型對照的稻瘟病菌接種鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of improved strains of Shuijing 3 and the wild-type control after inoculation with M.coryza

2.5 水晶3號改良株系接種稻瘟病菌前后的生理指標(biāo)測定

水稻幼苗未接種稻瘟病菌時，SJ3-G1、SJ3-G3株系葉片中POD活性與對照相比顯著降低，SJ3-G2、SJ3-G4、SJ3-G5株系葉片中POD活性則與對照無顯著差異；接種稻瘟病菌2，5 d后，水晶3號改良系葉片中POD活性均顯著低于對照(圖7-A)。未接種稻瘟病菌時，各改良株系葉片中H2O2含量與對照無顯著差異；接種稻瘟病菌2，5 d后，水晶3號改良系葉片中H2O2含量均顯著高于對照(圖7-B)。不論對照還是改良系，葉片中H2O2含量均隨著接種時間的增加而呈增加趨勢，POD活性變化不明顯。

柱上不同小寫字母表示野生型和各改良株系在接種后同一時期0.05水平上差異顯著(t測試)。Different lowercase letters above the bars indicate significant difference between the wild type and the improved lines at the 0.05 levels by t-test at the same stage.

3 結(jié)論與討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于具有精準(zhǔn)、便捷、高效、成本低廉等優(yōu)點，已經(jīng)在水稻稻瘟病抗性遺傳改良中得到了廣泛應(yīng)用。Wang等[18]利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)定向編輯水稻稻瘟病負(fù)調(diào)控基因OsERF922，從50株陽性轉(zhuǎn)化體中鑒定到21株T0突變株，經(jīng)過自交分離，最終獲得6個稻瘟病抗性明顯增強且無外源基因成分的T2純合突變株系，CRISPR/Cas9技術(shù)可以在不影響其他農(nóng)藝性狀的前提下實現(xiàn)對水稻抗病性的改良。楊海河等[19]利用CRISPR-Cas9技術(shù)對水稻稻瘟病感病品種日本晴pi21基因進行定點突變，最終獲得了21株不含T-DNA轉(zhuǎn)基因序列的pi21純合突變體，對其中1個pi21突變株系進行稻瘟病菌孢子噴霧接種，發(fā)現(xiàn)突變株系的抗病性顯著高于野生型日本晴。徐鵬等[15]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對長粒粳稻恢復(fù)系L1014中Pita、Pi21和ERF922進行定點編輯，獲得了Pi21單突變株系和Pita、Pi21、ERF922三突變株系，接種鑒定結(jié)果表明，突變株系的稻瘟病抗性比野生型顯著提高。

編碼 C2H2 類轉(zhuǎn)錄因子的Bsr-d1基因是從廣譜抗稻瘟病品種地谷中鑒定出來的，由于該基因通過RNAi或CRISPR/Cas9技術(shù)被敲除后，水稻品種TP309的稻瘟病抗性明顯提高，因此，bsr-d1被認(rèn)為是一個調(diào)控水稻稻瘟病廣譜抗性的新的遺傳位點[7，20]。bsr-d1為轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)的稻瘟病抗性屬于非R類部分抗性，抗性相對穩(wěn)定和持久。bsr-d1主要分布在秈型水稻資源中，在粳型資源中幾乎不存在[21]。因此，為了快速獲得具有廣譜持久稻瘟病抗性的水晶3號，本研究首先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向編輯Bsr-d1基因，并通過自交分離獲得了不含T-DNA轉(zhuǎn)基因成分的水晶3號bsr-d1純合突變株系，包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5種類型，突變類型較為豐富。34個T0轉(zhuǎn)基因植株中Bsr-d1基因的突變率為61.8%，其中有8株為純合突變體。純合變變類型中GA缺失型最多，占全部純合突變體的37.5%，其次為T插入占25.0%，G插入及CGCA和CGCAGA堿基缺失則各占12.5%。氨基酸序列分析結(jié)果表明，以上5種突變類型均導(dǎo)致了Bsr-d1氨基酸序列組成的變化或翻譯提前終止，很有可能造成蛋白質(zhì)功能的喪失，從而使得水晶3號獲得稻瘟病抗性。

研究認(rèn)為，完全抗性與部分抗性結(jié)合利用在抗稻瘟病育種中有重要的應(yīng)用價值[5]。作為公認(rèn)的持久廣譜抗稻瘟病基因，Pigm目前在河南沿黃粳稻育種中還沒有得到充分利用[22]，因此，本研究在獲得Bsr-d1純合突變株系的基礎(chǔ)上，經(jīng)雜交、回交、自交并采用武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司的GSR40K高密度水稻基因芯片進行前景和背景選擇，大大縮短了育種周期，只經(jīng)過4代就將粳稻金玉1號中的Pigm基因?qū)胍陨贤蛔冎晗抵校⒆罱K獲得抗病基因(同時攜帶bsr-d1和Pigm基因)純合，且背景基本回復(fù)(背景回復(fù)率均在96%以上)的水晶3號改良植株即SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5。稻瘟病菌接種鑒定結(jié)果表明，與野生型水晶3號相比，改良株系葉片上的病斑面積明顯變小，稻瘟病抗性明顯提高。

研究表明，適度提高H2O2含量能夠增強水稻稻瘟病抗性[23]。bsr-d1通過調(diào)控過氧化氫酶基因的表達調(diào)節(jié)H2O2的積累，從而影響水稻的稻瘟病抗性。敲除Bsr-d1基因能夠顯著降低過氧化物酶基因的表達量，進而減弱其對H2O2的降解引起細(xì)胞內(nèi)H2O2的富集，從而提高水稻植株抗病性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種稻瘟病菌后，水晶3號改良株系葉片中POD活性顯著低于其野生型對照，H2O2含量則正好相反，改良株系葉片中H2O2含量顯著高于其野生型對照。這與以前的研究結(jié)果是一致的，證明稻瘟病抗性與H2O2含量存在一定正相關(guān)關(guān)系，而與POD活性則存在一定負(fù)相關(guān)關(guān)系，很有可能是因為Bsr-d1基因被敲除后，引起活性氧清除相關(guān)酶類基因的表達下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)H2O2在一定程度上得以富集從而使水稻植株獲得了稻瘟病抗性，至于Pigm在這種調(diào)節(jié)機制中的具體作用還需要深入研究。

本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇獲得了同時攜帶bsr-d1和Pigm基因且無外源轉(zhuǎn)基因成分的水晶3號改良株系，并證實這些改良株系在苗期由于POD活性的降低和H2O2含量的增加一定程度上提高了對稻瘟病生理小種GUY11的抗性，但對其他稻瘟病生理小種是否具有抗性、穗頸瘟抗性如何、主效R基因和非R基因結(jié)合產(chǎn)生的抗性能否持久穩(wěn)定、bsr-d1和Pigm基因之間存在何種關(guān)系，這些都還需要進一步研究。本研究為培育具有廣譜持久稻瘟病抗性的優(yōu)質(zhì)水稻新品種提供了重要的資源。在此基礎(chǔ)上，利用多種稻瘟病菌生理小種研究水晶3號改良系的抗性譜，開展多年多生態(tài)點抗性鑒定尤其是穗頸瘟抗性鑒定以明確抗性是否持久，同時開展產(chǎn)量、品質(zhì)等其他農(nóng)藝性狀鑒定，并利用這些材料改良其他骨干水稻親本的稻瘟病抗性，將是未來研究的重點方向。