伊六喜，鄔 陽，曹 彥，賈海濱，斯欽巴特爾，高鳳云，周 宇，賈霄云

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.烏蘭察布市農(nóng)林科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 集寧 012000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

亞麻(LinumusitatissimumL.)是我國特色油料作物，一般分為油用亞麻(胡麻)和纖維亞麻[1]。主要分布于我國華北、西北地區(qū)。亞麻對(duì)不同自然環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，適合種植于我國北方地區(qū)干旱寒冷的生態(tài)區(qū)域。亞麻籽富含亞麻酸、木酚素、亞麻膠、膳食纖維等豐富的營養(yǎng)成分，有益于人體健康，可以制成多種保健食品[2]。

亞麻種質(zhì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的表型鑒定及其關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記的挖掘，對(duì)亞麻高產(chǎn)育種具有重要意義。近年來，眾多學(xué)者以亞麻種質(zhì)資源為研究對(duì)象，通過表型鑒定分析了亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀的遺傳變異。歐巧明等[3]對(duì)336 份油用亞麻種質(zhì)資源的6個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)，篩選出10份株高適中，單株分莖、分枝能力強(qiáng)，單株果數(shù)多，單株生產(chǎn)力高的品種。王利民等[4]應(yīng)用主基因+多基因混合遺傳分離分析方法，研究了單株產(chǎn)量、單株果數(shù)、千粒質(zhì)量和每果粒數(shù)4個(gè)性狀的遺傳效應(yīng)，結(jié)果表明，單株產(chǎn)量、單株果數(shù)、千粒質(zhì)量的遺傳效應(yīng)相同。陳英[5]對(duì) 341 份亞麻種質(zhì)資源的 11 個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)亞麻分枝數(shù)的變異系數(shù)最大，成熟日數(shù)的變異系數(shù)最小。李秋芝等[6]通過亞麻核心種質(zhì)農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性分析，篩選出20份表現(xiàn)型較理想的資源材料。鄧欣等[7]對(duì)535份亞麻材料的表型進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，亞麻種子產(chǎn)量與分枝數(shù)、分枝習(xí)性、單株莖質(zhì)量、蒴果數(shù)、莖粗、分莖數(shù)、全生育日數(shù)、千粒質(zhì)量呈正相關(guān)，與工藝長度、出麻率及開花日數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

開發(fā)亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，對(duì)亞麻育種縮短周期、提高效率以及精準(zhǔn)選育具有重要意義。產(chǎn)量相關(guān)性狀易受環(huán)境影響，屬于數(shù)量性狀。關(guān)聯(lián)分析是快速、準(zhǔn)確定位目標(biāo)性狀基因的重要方法，是開發(fā)實(shí)用性分子標(biāo)記的主要手段。Cloutier等[8]用30份EST-SSR引物對(duì)23份亞麻種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。Wu等[9]采用簡化基因組測(cè)序技術(shù)，在亞麻中開發(fā)出1 574個(gè)SSR標(biāo)記。 Choudhary等[10]利用22個(gè)SSR標(biāo)記的270個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與130份亞麻種質(zhì)的26個(gè)表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得了95個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。這些結(jié)果對(duì)亞麻種質(zhì)SSR標(biāo)記研究提供基礎(chǔ)。

內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院胡麻課題組前期研究中通過對(duì)401份亞麻種質(zhì)的表型和SRAP標(biāo)記的評(píng)價(jià)，構(gòu)建了229份亞麻核心種質(zhì)的自然群體，在此基礎(chǔ)上，本研究利用30對(duì)SSR引物對(duì)該核心群體進(jìn)行基因型檢測(cè)，旨在挖掘產(chǎn)量相關(guān)性狀緊密關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，為亞麻遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為229份亞麻核心種質(zhì)，其中110份為國內(nèi)種質(zhì)，分別來自6個(gè)亞麻主產(chǎn)區(qū)(內(nèi)蒙古占10%、甘肅占18%、河北占6%、山西占6%、寧夏占5%、新疆占3%)，119份為國外種質(zhì)，分別來自9個(gè)國家(美國占9%、荷蘭占8%、匈牙利占8%、加拿大占7%、法國占5%、巴基斯坦占5%、阿根廷占3%、伊朗占3%、俄羅斯占3%)。

1.2 產(chǎn)量相關(guān)性狀的測(cè)定與分析

229份亞麻種質(zhì)分別種植于內(nèi)蒙古呼和浩特市(Hohhot，HS)、集寧區(qū)(Jining，JN)、錫林郭勒盟太仆寺旗(Ximeng，XM)、新疆伊犁州(Xinjiang，XJ)4 個(gè)亞麻主產(chǎn)區(qū)，田間播種均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)， 3次重復(fù)，每份種質(zhì)材料種植3行，行長 2. 0 m，行距0. 20 m，每行種子180粒。4個(gè)地區(qū)的地理位置、物候條件、播種和收獲時(shí)期見表1。苗期，取2.00 g新鮮嫩葉于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。亞麻生理成熟后，試?yàn)小區(qū)隨機(jī)取樣 20 株，參照《亞麻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[11]，測(cè)定株高、工藝長度、單株果數(shù)、每果粒數(shù)、單株粒質(zhì)量、種子千粒質(zhì)量、分枝數(shù)等性狀。

表1 4個(gè)種植區(qū)的地理位置、氣候條件Tab.1 Geographical location and climatic conditions of the 4 growing areas

1.3 亞麻SSR-PCR擴(kuò)增

樣品基因組DNA提取參照Stewart等[12]提出的CTAB法，檢測(cè)合格之后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用本課題組前期篩選獲得的30對(duì)SSR引物(表2)，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序與伊六喜等[13]優(yōu)化程序一致。擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒功率70 W電泳1.5 h，采用銀染法顯色[14]。DNA Marker(1500)條帶為對(duì)照標(biāo)記種質(zhì)之間基因型差異條帶，標(biāo)記為“0”或“1”，組成一個(gè)“1”和“0”的數(shù)據(jù)矩陣[15]。用POPGEN 1.32計(jì)算有效等位基因數(shù)、引物多態(tài)性信息含量[16]；用TASSEL 5.0對(duì)表型數(shù)據(jù)和SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行廣義線性模型(General linear model，GLM)和混合線性模型(MLM)的關(guān)聯(lián)分析，得出P值、表型變異解釋率、關(guān)聯(lián)位點(diǎn)以及表型效應(yīng)值數(shù)據(jù)。

表2 30對(duì)引物序列 Tab.2 Primer sequences of 30 pairs

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)分析

7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，在4個(gè)環(huán)境下，株高平均值為(56.80±6.22)cm，其中呼和浩特地區(qū)平均值最大，為(58.40±5.67)cm；工藝長度平均值為(20.93±6.53)cm，其中新疆地區(qū)的平均值最大，為(22.30±6.90)cm；分枝數(shù)平均值為(4.63±1.03)個(gè)，其中集寧地區(qū)的平均值最大，為(5.00±1.25)個(gè)；單株果數(shù)平均值為(16.31±5.04)個(gè)，其中呼和浩特地區(qū)的平均值最大，為(17.50±3.50)個(gè)；果粒數(shù)平均值為(6.22±2.07)粒，其中集寧地區(qū)的平均值最大，為(6.52±2.67)粒；千粒質(zhì)量平均值為(5.42±1.69)g，其中集寧地區(qū)的平均值最大，為(5.58±1.48)g；單株粒質(zhì)量平均值為(0.52±0.20)g，其中呼和浩特地區(qū)平均值最大(0.55±0.15)g。7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的4個(gè)環(huán)境下的平均變異系數(shù)為11.18%～18.29%，其中分枝數(shù)變異系數(shù)最小(11.18%)，單株粒質(zhì)量的變異系數(shù)最大(18.29%)。在4個(gè)環(huán)境下千粒質(zhì)量的廣義遺傳力最大(63.25%)，工藝長度的廣義遺傳力最小(48.85%)，7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的廣義遺傳力從大到小依次為千粒質(zhì)量>果粒數(shù)>單株粒質(zhì)量>株高>單株果數(shù)>分枝數(shù)>工藝長度(表3)。對(duì)7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果表明，所有性狀基本呈現(xiàn)正態(tài)分布的趨勢(shì)(圖1)，說明亞麻株高、工藝長度、單株果數(shù)、果粒數(shù)、單株粒質(zhì)量、千粒質(zhì)量、分枝數(shù)主要由基因型控制。

表3 不同環(huán)境下7個(gè)亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)分析Tab.3 Statistical analysis of 7 yield-related traits in different environments

圖1 229份亞麻品質(zhì)(系)的7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的頻率直方圖Fig.1 Frequency histogram of 7 yield-related traits in 229 flax germplasm

2.2 亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀的相關(guān)性分析

7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀之間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，除了工藝長度和千粒質(zhì)量、千粒質(zhì)量和株高之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，株高與工藝長度的相關(guān)系數(shù)最大，為0.863(表4)，說明亞麻株高和工藝長度是密切相關(guān)的2個(gè)性狀，在纖維亞麻中該特征更為明顯，此結(jié)果與前期對(duì)401份亞麻材料的表型分析結(jié)果一致[17]。亞麻單株粒質(zhì)量、單株果數(shù)、果粒數(shù)和千粒質(zhì)量是影響亞麻單株產(chǎn)量的主要性狀，本研究結(jié)果表明，亞麻單株粒質(zhì)量與分枝數(shù)、單株果數(shù)和果粒數(shù)之間呈極顯著正相關(guān)，說明單株果數(shù)、果粒數(shù)和千粒質(zhì)量的增多，可以提高單株粒質(zhì)量，其是亞麻單產(chǎn)直接相關(guān)的因素。千粒質(zhì)量與株高和工藝長度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，該結(jié)果進(jìn)一步說明了纖維亞麻和油用亞麻之間的表型差異，纖維亞麻株高較高，但種子籽粒較小，而油用亞麻株高較矮，但種子籽粒大。

表4 亞麻7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀間的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation coefficient among 7 agronomic traits of flax

2.3 SSR引物多態(tài)性分析

由表5可知，利用30對(duì)SSR引物在229份亞麻材料中共擴(kuò)增出365條條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出12.17條條帶，其中Lu462引物擴(kuò)增的條帶最多(19條)，多態(tài)性位點(diǎn)在5～19，有效等位基因數(shù)在1.199 1～ 1.832 0，引物多態(tài)性含量為0.248 9～0.625 7，其中Lua37引物的多態(tài)性含量最高，為0.625 7，其次為Lu422引物(0.611 7)，引物平均多態(tài)性含量為0.432 2。本試驗(yàn)使用的SSR引物多態(tài)性好、條帶清晰，以Lu661引物在29份亞麻種質(zhì)上擴(kuò)增結(jié)果為例(圖2)。

表5 30對(duì)SSR引物在229份亞麻種質(zhì)的擴(kuò)增Tab.5 Amplification of 229 flax germplasm using 30 pairs of SSR primer

2.4 遺傳多樣性分析

將229份亞麻種質(zhì)劃分為兩大類群，分別表示為A和B(圖3)，其中，A群包括116份亞麻種質(zhì)，其中國內(nèi)種質(zhì)33份，國外種質(zhì)83份。該群分為2個(gè)亞群，第1個(gè)亞群(A-Ⅰ)包括74份亞麻種質(zhì)，其中國內(nèi)種質(zhì)20份(內(nèi)蒙古9份、甘肅5份、寧夏2份、新疆2份、山西1份、河北1份)，占該亞群的27.02%；國外種質(zhì)54份，占該亞群的72.98%。第2個(gè)亞群(A-Ⅱ)包括42份亞麻種質(zhì)，其中國內(nèi)種質(zhì)13份(內(nèi)蒙古8份、甘肅3份、河北1份、新疆1份)，占亞群的30.95%；國外種質(zhì)29份，占該亞群的69.05%。B群包括113份亞麻種質(zhì)，其中國內(nèi)種質(zhì)87份，國外種質(zhì)26份。該群分為2個(gè)亞群，第1個(gè)亞群(B-Ⅰ)包括56份亞麻種質(zhì)，其中國內(nèi)種質(zhì)45份，占該亞群的80.35%；國外種質(zhì)11份(加拿大3份、美國2份、法國2份、巴基斯坦2份、西德1份、匈牙利1份)，占該亞群的19.64%。第2個(gè)亞群(B-Ⅱ)包括57份亞麻種質(zhì)，其中國內(nèi)種質(zhì)42份，占該亞群的73.68%；國外種質(zhì)15份(加拿大7份、美國3份、俄羅斯2份、匈牙利1份、法國1份、阿根廷1份)，占該亞群的26.32%。從A和B這2個(gè)大類群國內(nèi)外種質(zhì)占比來看，基本能區(qū)分開。

M.DL1500；1—29依次為29份亞麻樣品。M.DL1500；1—29 were 29 flax samples in turn.

圖3 229份亞麻種質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 229 flax germplasm

對(duì)229份亞麻種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，當(dāng)K=4時(shí)，ΔK的值出現(xiàn)顯著峰值(圖4)，因此，當(dāng)K=4時(shí)，分為4個(gè)群體，第1個(gè)群、第2個(gè)群和第4群均為56份種質(zhì)，第3群為61份種質(zhì)(圖5)。

2.5 關(guān)聯(lián)分析

使用TASSEL 5.0軟件的廣義線性模型(GLM)和混合線性模型(MLM)程序，將每份種質(zhì)的Q值作為協(xié)變量，對(duì)30個(gè)SSR標(biāo)記分別與不同環(huán)境下檢測(cè)到表型數(shù)據(jù)均值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)目標(biāo)性狀顯著(P<0.01)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。GLM和MLM的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果分別見表6，7，GLM下檢測(cè)到了36個(gè)SSR標(biāo)記，標(biāo)記對(duì)性狀表型變異的解釋率為1.15%(Lu146)～7.75%(Lu747)，平均為4.19%；MLM下檢測(cè)到了23個(gè)SSR標(biāo)記，標(biāo)記對(duì)性狀表型變異的解釋率為2.26%(Lu203a)～7.16%(Lu291)，平均為3.62%。在GLM和MLM下，單株粒質(zhì)量、單株果數(shù)和分枝數(shù)同時(shí)檢測(cè)到了Lu203a和Lua125a標(biāo)記，分別分布在第12，2號(hào)染色體上。

圖4 ΔK隨K值的變化曲線Fig.4 ΔK with the change of K values

圖5 229份亞麻種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of population structure of 229 flax germplasm

表6 亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀的GLM關(guān)聯(lián)分析Tab.6 GLM correlation analysis of flax yield related traits

表6(續(xù))

表7 亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀的MLM關(guān)聯(lián)分析Tab.7 MLM correlation analysis of flax yield related traits

3 結(jié)論與討論

亞麻是一種高度自花授粉作物，在高產(chǎn)育種技術(shù)上，仍沿用常規(guī)育種手段，能用的分子標(biāo)記較少，導(dǎo)致育種周期長，選擇效率低，品種更新?lián)Q代緩慢。因此，通過亞麻種質(zhì)資源產(chǎn)量相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析，挖掘?qū)嵱眯苑肿訕?biāo)記對(duì)亞麻遺傳改良具有重要意義。關(guān)聯(lián)分析研究中，種質(zhì)資源的表型鑒定評(píng)價(jià)是最關(guān)鍵的一步，利用本課題組前期構(gòu)建的229份亞麻核心種質(zhì)材料[18]，通過4個(gè)環(huán)境的表型鑒定分析結(jié)果表明，在呼和浩特地區(qū)種植的亞麻種質(zhì)株高((58.40±5.67)cm)、單株果數(shù)((17.50±3.50)個(gè))和單株粒質(zhì)量((0.55±0.15)g)指標(biāo)表現(xiàn)為最大；在集寧地區(qū)種植的亞麻種質(zhì)分枝數(shù)((5.00±1.25)個(gè))、果粒數(shù)((6.52±2.67)粒)和千粒質(zhì)量((5.58±1.48)g)的指標(biāo)表現(xiàn)為最大，說明不同種植環(huán)境對(duì)亞麻產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響較大。7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀的變異系數(shù)為11.18%～18.29%，除千粒質(zhì)量與株高和工藝長度呈極顯著負(fù)相關(guān)外，其他性狀之間相關(guān)性均為正相關(guān)。廣義遺傳力從大到小依次為千粒質(zhì)量>果粒數(shù)>單株粒質(zhì)量>株高>單株果數(shù)>分枝數(shù)>工藝度?；赟SR標(biāo)記的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，229份亞麻種質(zhì)分為2個(gè)大群，國內(nèi)外種質(zhì)基本能區(qū)分開。此結(jié)果為亞麻種質(zhì)資源收集保存和種質(zhì)創(chuàng)新提供重要的參考信息。然而為了更好地服務(wù)亞麻育種，這些試驗(yàn)結(jié)果還需要多年多點(diǎn)的大田試驗(yàn)來進(jìn)一步鑒定與評(píng)估。

近幾年，亞麻SSR標(biāo)記開發(fā)研究報(bào)道較多[19-20]，但是這些成千上萬標(biāo)記真正應(yīng)用于亞麻育種當(dāng)中的寥寥無幾，因此，亞麻種業(yè)發(fā)展需要更多種質(zhì)資源的表型和基因型鑒定評(píng)價(jià)，并挖掘?qū)嵱眯苑肿訕?biāo)記。本研究篩選出30對(duì)SSR多態(tài)性引物，共擴(kuò)增出365條條帶，與亞麻7個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，GLM下檢測(cè)到了36個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，MLM下檢測(cè)到了23個(gè)SSR標(biāo)記。其中Lu203a和Lua125a標(biāo)記在2種模型下均關(guān)聯(lián)到單株粒質(zhì)量、單株果數(shù)和分枝數(shù)。通過亞麻參考基因組(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore?LinkName)的比對(duì)，Lu203a(CCTTTTCACGCAGAGCTACC/GCTTCCGTAATCCTCTTCCA)標(biāo)記分布在12號(hào)染色體上，Lua125a(GCCTTTGGAGGGCTTAACTT/ACAATCCCAACATTCCCAAA)標(biāo)記分布在2號(hào)染色體上。前人對(duì)亞麻種質(zhì)的SSR標(biāo)記研究中大量使用了這2個(gè)標(biāo)記[21-24]，說明后期可以利用Lu203a和Lua125a標(biāo)記輔助選擇對(duì)應(yīng)的目標(biāo)性狀，對(duì)亞麻遺傳改良提供便利。