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        石墨烯量子點(diǎn)與細(xì)胞免疫相關(guān)性研究新進(jìn)展*

        2022-11-03 09:43:04徐亞棟李志強(qiáng)
        臨床輸血與檢驗(yàn) 2022年5期
        關(guān)鍵詞:小鼠生物

        徐亞棟 李志強(qiáng)

        石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots,GQDs)是納米碳材料家族的最新成員,由PONOMARENKO等[1]在2008年被研發(fā)成功。它是一種零維石墨烯材料,為橫向尺寸小于100納米的石墨烯薄片,包含一個(gè)或多個(gè)(2~10層)石墨烯層。其具有優(yōu)異的化學(xué)、物理和生物特性,在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景,如:具有很強(qiáng)且可協(xié)調(diào)的熒光特性,可用于熒光生物成像和生物傳感;具有類芳香化合物的高負(fù)載能力,可用于小分子藥物傳遞,甚至基因傳遞;以及具有光輻射下產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的能力,可用于光熱和光動(dòng)力療法治療癌癥[2]。研究表明,石墨烯及其衍生物可影響巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化發(fā)育[3],在疫苗、免疫制劑制備方面也具有潛在用途[4]。而GQDs作為石墨烯的衍生物,有更小的體積,不僅具有石墨烯的特性[5],同時(shí)具有更高的生物相容性,故可作為治療炎性疾病的潛在藥物[6]。

        1石墨烯量子點(diǎn)的生物相容性 生物相容性的總體定義是材料不引起意外生物反應(yīng)的情況下執(zhí)行其預(yù)期功能的能力,但材料的生物相容性范圍取決于具體的應(yīng)用[7]。許多碳基納米顆粒會(huì)因?yàn)橄嗷ゾ奂a(chǎn)生毒性,這限制了其在生物體中的應(yīng)用,但GQDs表面存在-OH和-COOH等富氧基團(tuán),這些極性成分使GQDs具有優(yōu)異的水溶性[8],有利于其生物利用,而且GQDs為碳基顆粒,不用擔(dān)心金屬殘留的毒性問題。

        1.1石墨烯量子點(diǎn)具有低細(xì)胞毒性:碳基納米顆粒的生物相容性在很大程度上取決于它們的表面化學(xué)性質(zhì)[4]。GQDs主要通過小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被細(xì)胞內(nèi)化,體外研究表明,被-NH2,-COOH,-CHO-N-(CH3)2,聚乙二醇(PEG)等基團(tuán)修飾的GQDs在濃度高達(dá)200 μg/mL時(shí)顯示出低毒性,而-OH修飾的GQDs在100 μg/mL以上時(shí)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性[9-11]。GQDs還顯示出較低的遺傳毒性,以往的研究中,碳納米管[12]和氧化石墨烯(graphene oxide,GO)[13]都被發(fā)現(xiàn)在低濃度下會(huì)導(dǎo)致DNA損傷,WU等[14]研究發(fā)現(xiàn)GQDs對(duì)MCF-7和MGC803細(xì)胞的DNA有輕微的損傷,但遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于GO,GO在亞G1期便引發(fā)顯著的細(xì)胞聚集,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。

        1.2石墨烯量子點(diǎn)的血液相容性:血液不僅是靜脈注射給藥的納米顆粒的第一接觸點(diǎn),也是通過其他途徑給藥的所有納米顆粒到達(dá)其目標(biāo)組織或器官的通道。因此評(píng)估GQDs的血液細(xì)胞相容性也非常重要。對(duì)于這方面的研究較少,KIM等[15]將人血紅細(xì)胞與不同官能團(tuán)修飾的GQDs(非官能化、羥基化和羧化GQDs)共同孵育發(fā)現(xiàn),當(dāng)濃度低于500 μg/mL時(shí),紅細(xì)胞的溶血率和流變學(xué)沒有明顯改變;而當(dāng)濃度>750 μg/mL時(shí),羧基化GQDs造成了溶血,并導(dǎo)致紅細(xì)胞的變形和聚集。然而體內(nèi)血液循環(huán)中,GQDs與血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血漿蛋白直接接觸,并可能相互影響,體外單種血細(xì)胞的評(píng)估不能完全反映GQDs的血液相容性,但在小鼠模型中,短期應(yīng)用還未觀察到明顯的血栓及心血管并發(fā)癥。

        1.3石墨烯量子點(diǎn)在生物模型中的毒性:NURUNNABI等[16]單次給小鼠靜脈注射羧基GQDs,觀察其生物分布和細(xì)胞毒性以及體內(nèi)器官成像,發(fā)現(xiàn)GQDs從12 h開始被逐漸清除。并且連續(xù)給藥21 d(5或10 mg·kg-1·d-1)后沒有明顯的器官損傷或損傷。CHONG等[11]發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠靜脈和腹腔注射聚GQDs-PEG(20 mg·kg-1·d-1)14 d不會(huì)產(chǎn)生任何明顯毒性。同樣,在斑馬魚和秀麗隱桿線蟲中也未觀察到GQDs的明顯毒性[17-18]。

        1.4石墨烯量子點(diǎn)在體內(nèi)清除和降解:給小鼠靜脈和皮下注射GQDs發(fā)現(xiàn),GQDs在腎臟內(nèi)積聚,然后通過尿液排出[19]。口服時(shí),GQDs通過糞便排出,不會(huì)遷移到大腦或性器官[20]。超小尺寸的GQDs(<5 nm)可以穿過腎臟濾過屏障并通過尿液排出,但是羧基GQDs雖然大小為3~6 nm,卻不能穿過腎濾過屏障,而是分布在肝臟和脾臟[21]。另外,研究表明,GQDs可被人髓過氧化物酶(MPO)和嗜酸性過氧化物酶(EPO)降解[22]。這可能是小鼠靜脈注射羧基GQDs沒有發(fā)現(xiàn)明顯毒性的部分機(jī)制。

        總之,目前的研究顯示,GQDs具有較低的毒性,這成為了它作為治療藥物的前提。

        2石墨烯量子點(diǎn)的抗氧化性 ROS是一組由機(jī)體各種細(xì)胞產(chǎn)生的不穩(wěn)定分子,包括過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH-)、單線氧(1O2)和超氧化物(O2-)等,在機(jī)體抵抗病原體和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用,但他們?nèi)绻荒芗皶r(shí)清除并在細(xì)胞內(nèi)蓄積,會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,造成氧化損傷[23]。研究表明,GQDs在生物系統(tǒng)中既具有ROS猝滅活性,又具有產(chǎn)生活性[24-25]。在光激發(fā)下,GQDs通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平從而降低細(xì)胞活力表現(xiàn)出顯著的光毒性,而在無光激發(fā)的情況下GQDs可以有效地清除大量ROS,從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[26],如圖1。如:NILEWSKI等[27]報(bào)道了GQDs-PEG對(duì)細(xì)胞具有低毒性并且有顯著的抗氧化作用。ROSTAMZADEH等[28]發(fā)現(xiàn)在大鼠心肌埂死模型中GQDs-PEG能緩解氧化應(yīng)激反應(yīng),改善心肌梗死大鼠的心臟功能。

        圖1 在光激發(fā)下,GQDs可產(chǎn)生活ROS,而在無光激發(fā)的情況下GQDs可有效地清除ROS

        2.1GQDs的清除活性氧的機(jī)制:石墨烯的sp2雜化的碳原子蜂窩網(wǎng)絡(luò)是其他碳同素異形體的基本組成部分。簡單來說蜂窩網(wǎng)格結(jié)構(gòu)包裹形成零維富勒烯,卷起形成一維的碳納米管,堆疊形成三維的石墨,切割形成零維的GQDs,如圖2。活性氧可以結(jié)合到GQDs的sp2碳結(jié)構(gòu)域,GQDs的π-π共軛性質(zhì)和豐富的邊緣缺陷位點(diǎn)促進(jìn)了活性氧和GQDs之間的電荷轉(zhuǎn)移,從而消除活性氧。此外,GQDs表面豐富的含氧官能團(tuán)(-OH、-COOH等)促進(jìn)了GQDs中的自由電子離域化,表現(xiàn)出供氫能力,來消除ROS。

        圖2 石墨烯及其衍生物結(jié)構(gòu)示意圖

        2.2氧化程度和氧含量對(duì)石墨烯量子點(diǎn)活性氧清除能力的影響:氧化程度和氧含量會(huì)影響石墨烯基材料的加合物形成、電荷轉(zhuǎn)移和供氫能力,從而影響其活性氧清除能力。一方面,引入的氧原子可以破壞GQDs原有的結(jié)構(gòu)(電子轉(zhuǎn)移的主要場所),降低ROS清除能力。然而,另一方面,含氧官能團(tuán),例如-OH、C=O和-COOH,可以促進(jìn)ROS的吸附,并有利于ROS與石墨烯基材料之間加合物的形成和電子轉(zhuǎn)移[29]。GQDs表面含有豐富的含氧基團(tuán),研究表明GQDs表面的含氧基團(tuán)可以有效清除ROS,并且C-OH和C=O基團(tuán)比C-O-C基團(tuán)更具清除ROS的活性[30]。WANG等[31]設(shè)計(jì)了一種表面富含-OH的類酚基團(tuán)功能化GQDs具有高效的ROS清除活性,并且在急性腎損傷小鼠模型中,僅使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)十六分之一劑量就可以有效保護(hù)腎臟免受氧化損傷。

        2.3元素?fù)诫s對(duì)石墨烯量子點(diǎn)活性氧清除能力的影響:一般來說,摻雜富電子元素(如N、P、Se、S和Cl)可以提高自由基清除能力[32-33]。WANG等[34]合成了氯摻雜的GQDs(Cl-GQDs),其ROS的清除能力是未摻雜GQDs的7倍。RUIZ等[35]發(fā)現(xiàn)表面具有豐富含氮基團(tuán)(C-N和C=N)的GQDs具有極高的供氫能力和抗氧化活性。LI等[36]人報(bào)道了磷摻雜的GQDs的DPPH·清除活性(79.1%)是未摻雜GQD(35.5%)的2倍以上。BYEONGTAEK等[37]合成了硫醇化石墨烯量子點(diǎn)(SH-GQDs)能有效清除巨噬細(xì)胞內(nèi)的ROS。

        3石墨烯量子點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)性 ROS是免疫細(xì)胞中氧化應(yīng)激和氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵媒介[38],GQDs對(duì)ROS的調(diào)控可能對(duì)免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。此外,T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)的功能受到自噬的調(diào)控[39-41]。多項(xiàng)研究表明GQDs可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[10,42-44],如圖3。因此,GQDs可能通過清除ROS和誘導(dǎo)自噬兩方面作用調(diào)節(jié)免疫。

        圖3 GQDs誘導(dǎo)自噬的作用機(jī)制示意圖

        3.1石墨烯量子點(diǎn)與T細(xì)胞 T細(xì)胞作為最重要的免疫細(xì)胞之一,與多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),研究表明GQDs可影響T細(xì)胞亞群的分化發(fā)育并緩解炎癥性疾病。VOLAREVIC等[6]利用GQDs治療刀豆球蛋白A(Concanavalin A,ConA)誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎,發(fā)現(xiàn)GQDs能抑制T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化和巨噬細(xì)胞活化來緩解炎癥,并且大顆粒GQDs(寬度大于40 nm)和小顆粒GQDs(寬度5~30 nm)表現(xiàn)出相似的治療效果。TOSIC等[45]大鼠神經(jīng)炎癥模型中,發(fā)現(xiàn)GQDs能通過調(diào)節(jié)MAPK/Akt信號(hào)通路和Th1免疫應(yīng)答來緩解免疫介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

        3.2石墨烯量子點(diǎn)與巨噬細(xì)胞:巨噬細(xì)胞在具有高度功能異質(zhì)性的先天免疫應(yīng)答中起著重要作用。它是一種來源于組織中單核細(xì)胞的白細(xì)胞,能以不動(dòng)細(xì)胞或自由細(xì)胞的形式吞噬和消化死亡細(xì)胞和入侵病原體的碎片,從而激活淋巴細(xì)胞和其他類型的免疫細(xì)胞,加速其對(duì)入侵病原體作出反應(yīng)。巨噬細(xì)胞將在不同的微環(huán)境中極化,產(chǎn)生促進(jìn)炎癥的經(jīng)典M1型巨噬細(xì)胞和抑制炎癥的選擇性M2型巨噬細(xì)胞。ROS有利于誘導(dǎo)M1型促炎巨噬細(xì)胞。自噬缺陷導(dǎo)致炎癥M1型巨噬細(xì)胞過度激活[46],因此GQDs的ROS清除作用和自噬誘導(dǎo)作用可能影響巨噬細(xì)胞亞群的分化。LEE等[47]發(fā)現(xiàn)GQDs可改善右旋糖酐硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎,并在體內(nèi)外的試驗(yàn)中證明了GQDs不僅能夠直接抑制T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化,還可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞M0向M2亞型的分化,使小鼠結(jié)腸局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的浸潤增加,并間接抑制T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化。

        3.3石墨烯量子點(diǎn)與DC細(xì)胞:抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)和T淋巴細(xì)胞之間的相互作用是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。DC是最重要的APC,能夠感知微環(huán)境并遷移到淋巴結(jié),從而激活抗原特異性T細(xì)胞[48]。除了誘導(dǎo)針對(duì)入侵病原體的有效免疫反應(yīng)外,DC還表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能,以維持中樞和外周的免疫耐受。耐受性DC與其未成熟表型相關(guān),表面含有少量共刺激分子,并分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β,促使T細(xì)胞分化為抗炎的Treg[49]。DC和T細(xì)胞的功能都受自噬調(diào)節(jié),并與其他信號(hào)通路發(fā)生復(fù)雜的相互作用[50]。自噬可以限制DCs的成熟及其分泌促炎細(xì)胞因子的能力[51-53]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,mTOR)是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[54],在DC分化發(fā)育中也起著關(guān)鍵作用。SAID等[52]發(fā)現(xiàn)了GQDs誘導(dǎo)耐受性DC細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫功能的機(jī)制。GQDs被DC細(xì)胞攝取后可通過mTOR依賴的自噬誘導(dǎo)機(jī)制抑制人單核細(xì)胞源性DC的發(fā)育和功能,使其分化為耐受性DC。從而抑制T細(xì)胞向Th1和Th17細(xì)胞分化,使其向Th2和Treg細(xì)胞的分化。此外,研究還發(fā)現(xiàn)GQDs不僅降低了DC中活性氧的產(chǎn)生,而且還減少了NF-kB的核轉(zhuǎn)位,推測可能是對(duì)產(chǎn)生耐受性DC細(xì)胞起到了積極的作用。但在此研究中并未發(fā)現(xiàn)GQDs對(duì)T細(xì)胞分化的直接影響,這與LEE等[47]的研究結(jié)果有出入。

        總的來說,GQDs除了能直接影響T細(xì)胞的分化發(fā)育之外,還能通過作用于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞這些具有抗原遞呈作用的細(xì)胞間接影響T細(xì)胞的分化發(fā)育來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,如圖4。

        圖4 GQDs調(diào)節(jié)免疫作用示意圖

        4總結(jié)與展望 GQDs作為一種碳基納米材料,在藥物輸送、生物傳感、生物成像和光化學(xué)治療的應(yīng)用中得到了廣泛研究,但它的物理化學(xué)及生物學(xué)特性使它本身成為一種具有治療活性的藥物。GQDs的高水溶性、低毒性、抗氧化性以及免疫調(diào)節(jié)活性,使它具有治療炎性疾病的潛力。由于炎性疾病的主要治療目標(biāo)是改善過度的免疫反應(yīng),注射的顆粒需要不對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生額外的刺激,GQDs的表面結(jié)構(gòu)使其帶有負(fù)電荷,許多研究表明帶負(fù)電荷的納米顆粒具有低免疫原性[53]。另外,GQDs具有較大的比表面積以及特殊的理化結(jié)構(gòu)(可以與各種官能團(tuán)、靶向配體和生物活性分子進(jìn)行結(jié)合),是藥物靶向輸送的理想納米載體[2],有利于提高藥物療效和減少免疫抑制藥物的全身不良反應(yīng)。例如:KHODADADEI等[57]報(bào)道了負(fù)載甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)的氮摻雜GQDs納米載體能夠作為有效的抗癌藥物傳遞系統(tǒng),能夠有效傳遞抗癌藥物至靶細(xì)胞,并減少對(duì)正常細(xì)胞的傷害。目前GQDs的藥物運(yùn)輸研究主要是腫瘤化療藥物運(yùn)輸及基因治療,未來GQDs可負(fù)載抗體及免疫調(diào)節(jié)藥物在炎性疾病的治療方面具有巨大的潛力。除此之外,GQDs還具有多種治療活性,抗菌活性、抗阿爾茨海默病、抗帕金森病和抗糖尿病活性也有報(bào)道。

        需要注意的是GQDs是一種相對(duì)較新的材料,目前對(duì)于影響GQDs免疫調(diào)節(jié)影響因素(結(jié)構(gòu)、大小、官能基團(tuán)等)的研究較少,各個(gè)研究的GQDs表征數(shù)據(jù)存在差異,如QIN等[43]報(bào)道的GQDs在THP-1人單核細(xì)胞系中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和促炎癥反應(yīng)。與前文所述諸多報(bào)道:GQDs具有清除ROS和免疫抑制作用不吻合。這可能是由于單一細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)的特殊性或者GQDs的物理化學(xué)特征差異造成的。另一方面,短期的體外和生物模型的毒性試驗(yàn)還遠(yuǎn)不足以證明GQDs在哺乳動(dòng)物甚至人體中的安全性,需要更廣泛和長期的毒理性研究,才確保GQDs更安全更可靠地應(yīng)用。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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