張?jiān)?jiān)，劉付麗，董嬌嬌，葉穎超，林婷婷，蔡瑤瑤，劉 樂

0 引言

肺缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷是一種急性無菌性肺部損傷,涉及機(jī)制復(fù)雜廣泛[1-2]，可形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]、氧化應(yīng)激[4-5]、內(nèi)皮細(xì)胞屏障損傷[6]、細(xì)胞凋亡[7]等一系列病理生理過程，其中氧化應(yīng)激起著關(guān)鍵作用。醛類物質(zhì)是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物，參與氧化應(yīng)激，高劑量的醛類物質(zhì)具有細(xì)胞毒性，但是低劑量的醛類物質(zhì)對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用[8-9]。前期團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，ω-3魚油脂肪乳劑(ω-3 fish oil fat emulsion，ω-3FOFE)預(yù)處理通過產(chǎn)生低劑量的醛類物質(zhì)，刺激抗氧化酶的產(chǎn)生，從而減輕心肌I/R損傷[10]。目前尚未見醛類應(yīng)激在肺I/R損傷中的研究，因此，本項(xiàng)目通過確定ω-3FOFE預(yù)處理產(chǎn)生醛類應(yīng)激的時(shí)間，構(gòu)建大鼠在體肺I/R模型，探討ω-3FOFE對(duì)肺I/R的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重300～350 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。原位TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠多克隆Nrf2抗體 (美國(guó)Abcam公司)，兔抗大鼠多克隆HO-1抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗大鼠單克隆組蛋白H3抗體(美國(guó)Millipore公司)，兔抗大鼠單克隆β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 確定ω-3FOFE預(yù)處理產(chǎn)生醛類應(yīng)激激活抗氧化信號(hào)通路時(shí)間 ω-3FOFE 注射液劑量參考團(tuán)隊(duì)前期報(bào)道(2 ml/kg)。選擇24只 SD雄性大鼠，隨機(jī)分成4組(n=6)：NS5組(生理鹽水注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d)、FO5組(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d)、FO3組(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射3 d)、FO1組(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射1 d)。于末次給藥后24 h處死大鼠，取肺組織置于液氮保存。采用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)大鼠肺組織MDA和GSH含量；免疫印跡(Western blot，WB)法檢測(cè)核因子-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)和血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase -1,HO-1)蛋白來確定ω-3FOFE預(yù)處理產(chǎn)生醛類應(yīng)激激活抗氧化信號(hào)通路時(shí)間。本項(xiàng)目醫(yī)院倫理批件編號(hào)：(2021)第(0110)號(hào)。

1.2.2 動(dòng)物分組及構(gòu)建大鼠肺I/R模型 參考前期團(tuán)隊(duì)方法建立大鼠肺I/R模型[11]，選擇18只 SD雄性大鼠，隨機(jī)分為3組(n=6)：Sham組(假手術(shù)組)、I/R組(肺缺血再灌注組)、FO組(ω-3FOFE預(yù)處理+缺血再灌注組)。Sham組造模前生理鹽水注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d，造模開胸僅分離左肺動(dòng)脈和左支氣管，不阻斷左肺動(dòng)脈，觀察150 min活體取肺；I/R組造模前生理鹽水注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d，造模開胸阻斷左肺門30 min，再開放恢復(fù)供血和通氣120 min；FO組于造模前ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d，其余同I/R組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，取肺組織置于液氮保存。測(cè)定各組濕干重比(Wet/Dry ratio，W/D)；光學(xué)顯微鏡下蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，HE) 染色觀察肺組織病理學(xué)改變；TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡情況；試劑盒檢測(cè)GSH含量；WB檢測(cè)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)。

1.2.3 肺W/D測(cè)定 取出右上肺組織，濾紙吸凈表面水分后稱濕重(Wet，W)，然后置于75 ℃烘箱烘干24 h至恒重，稱干重(Dry，D)，兩者比值即為肺W/D值。

1.2.4 肺組織病理學(xué)改變 取左中肺甲醛固定，脫水透明包埋后制成石蠟切片，HE染色后脫水透明封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺泡形態(tài)、結(jié)構(gòu)改變及肺間質(zhì)充血水腫等情況。

1.2.5 肺組織細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，根據(jù)試劑盒說明書操作。熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光即為凋亡細(xì)胞。

1.2.6 MDA含量測(cè)定 采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。按照試劑盒說明書操作上樣，在532 nm，1 cm光徑檢測(cè)各管吸光度值并根據(jù)說明書公式計(jì)算含量。

1.2.7 GSH含量測(cè)定 按照GSH檢測(cè)試劑盒說明書操作上樣檢測(cè)，405 nm處，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值并根據(jù)說明書公式計(jì)算含量。

1.2.8 WB檢測(cè)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白 取左肺組織約1 g，提取肺組織核蛋白測(cè)定其蛋白濃度，配置10%分離膠，5%濃縮膠，電泳轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)置聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。配置含5%脫脂奶粉的TBST封閉液，室溫封閉1 h，將膜放入相應(yīng)兔抗大鼠多克隆Nrf2抗體(1∶2 000)、兔抗大鼠單克隆組蛋白H3抗體(1∶2 000)的一抗液中4 ℃孵育過夜，次日加入山羊抗兔IgG(1∶5 000)的二抗液中室溫孵育1 h，TBST洗去抗體液后，加入發(fā)光液，用凝膠成像儀顯影，系統(tǒng)導(dǎo)出各條帶灰度值，以組蛋白H3為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。組間數(shù)據(jù)比較時(shí)，以NS5組或Sham組為對(duì)照組，計(jì)算其他組與對(duì)照組的比值。

1.2.9 WB檢測(cè)HO-1蛋白 提取肺組織胞漿總蛋白，如上述步驟電泳轉(zhuǎn)膜封閉，將膜放入相應(yīng)兔抗大鼠多克隆HO-1抗體(1∶200)、兔抗大鼠單克隆β-actin抗體(1∶1 000)的一抗液中4 ℃孵育過夜，后續(xù)如上述測(cè)定灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。最后組間數(shù)據(jù)比較時(shí)，以NS5組或Sham組為對(duì)照組，計(jì)算其他組與對(duì)照組的比值。

2 結(jié)果

2.1 確定ω-3FOFE預(yù)處理產(chǎn)生醛類應(yīng)激激活抗氧化信號(hào)通路時(shí)間 如表1及圖1所示，與NS5組、FO3組和FO1組相比，F(xiàn)O5組大鼠肺組織的醛類物質(zhì)MDA含量明顯增加(P<0.05)，且FO5組的Nrf2/HO-1抗氧化通路蛋白表達(dá)和抗氧化酶GSH含量也均明顯增加(P<0.05)。NS5組、FO3組、FO1組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)O5組產(chǎn)生醛類物質(zhì)發(fā)生醛類應(yīng)激激活抗氧化信號(hào)通路，故在后續(xù)缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中，選擇ω-3FOFE 2 ml/kg連續(xù)注射5 d的預(yù)處理。

表1 各組大鼠肺組織MDA、GSH和Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量比較(n=6)

圖1 WB檢測(cè)各組大鼠肺組織Nrf2及HO-1蛋白

2.2 ω-3FOFE抑制大鼠肺I/R損傷 在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將18只大鼠隨機(jī)分為Sham組、I/R組和FO組，檢測(cè)ω-3FOFE 對(duì)大鼠肺I/R損傷的影響。如表2所示，與Sham組相比，I/R組的肺W/D顯著升高(P<0.05)，在ω-3FOFE預(yù)處理后被抑制(P<0.05)。相應(yīng)地，與Sham組相比，I/R組大部分肺泡被破壞，腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞及水腫液聚集，肺間質(zhì)明顯水腫伴大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；與I/R組相比,FO組肺泡破壞程度明顯改善，腔內(nèi)僅有少量紅細(xì)胞滲出，如圖2所示。此外，通過熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，在ω-3FOFE預(yù)處理后被抑制，如圖3所示。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ω-3FOFE預(yù)處理抑制了肺W/D的升高，改善肺組織病理?yè)p傷和減少細(xì)胞凋亡，對(duì)肺I/R損傷有保護(hù)作用。

2.3 ω-3FOFE抑制大鼠肺I/R過氧化損傷 如表2及圖4所示，與Sham組相比，I/R組肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)和GSH含量均顯著下降(P<0.05)；與I/R組相比，F(xiàn)O組肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)和GSH含量均顯著增加(P<0.05)。結(jié)果表明，在大鼠肺I/R模型中，ω-3FOFE預(yù)處理后可激活Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路，從而發(fā)揮肺保護(hù)作用。

表2 各組大鼠肺組織W/D、GSH含量和Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量比較(n=6)

圖2 各組大鼠肺HE染色病理圖(100×)

圖3 各組大鼠肺組織凋亡情況(200×)

圖4 WB檢測(cè)各組大鼠肺組織Nrf2及HO-1蛋白

3 討論

本研究在大鼠肺I/R模型中檢測(cè)了ω-3FOFE預(yù)處理后對(duì)I/R損傷的影響，結(jié)果表明，與I/R組相比，F(xiàn)O組大鼠的肺組織W/D下降、肺泡損傷明顯改善、細(xì)胞凋亡數(shù)量大大減少，說明ω-3FOFE對(duì)肺I/R損傷有保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)與之前報(bào)道ω-3FOFE對(duì)不同器官I/R損傷有保護(hù)作用一致[10,12-13]，表明ω-3FOFE在預(yù)防和治療肺I/R損傷中具有潛在的臨床意義。

ω-3FOFE 中的不飽和雙鍵作為脂質(zhì)過氧化的靶點(diǎn)可生成醛類物質(zhì)，而研究表明，低水平的醛類物質(zhì)對(duì)機(jī)體存在保護(hù)作用。Zhang等[8]報(bào)道，在法洛四聯(lián)癥患兒行心臟手術(shù)中，體內(nèi)醛類表達(dá)水平較高的一組患兒術(shù)后測(cè)得肌鈣蛋白更低，所需正性肌力藥物更少，術(shù)后ICU和住院時(shí)間更短。MDA是一種醛類物質(zhì),是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物。GSH有助于保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示，注射ω-3FOFE 5 d后，大鼠肺組織中MDA表達(dá)水平顯著提高，GSH含量顯著增加，表明ω-3FOFE預(yù)處理5 d會(huì)使大鼠產(chǎn)生醛類應(yīng)激產(chǎn)生抗氧化酶，與Dong等[10]的報(bào)道一致。

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激引起的凋亡[14]。HO-1作為Nrf2下游的靶基因蛋白，是催化血紅素降解的重要限速酶，具有抗炎抗氧化的作用[15]。Dong等[10]報(bào)道，ω-3FOFE通過激活Nrf2信號(hào)通路減輕了心肌的氧化損傷。Sun等[16]在肺I/R實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶C明了maresin 1具有保護(hù)作用，這種保護(hù)部分可能依賴于Nrf2/HO-1信號(hào)通路介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激能力。Fan等[17]報(bào)道，激活Nrf2/HO-1通路可減少大腦I/R損傷。Qin等[18]報(bào)道，通過上調(diào) HO-1 表達(dá)可減少氧化應(yīng)激從而減輕大鼠的肺缺血再灌注損傷。同樣，在本研究中，與I/R組相比，F(xiàn)O組大鼠的肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)顯著增加，表明ω-3FOFE激活Nrf2/HO-1通路，與上述報(bào)道相符合。

綜上所述，本研究首次證明了ω-3FOFE通過醛類應(yīng)激激活Nrf2/HO-1抗氧化蛋白，從而減輕肺I/R損傷。這為今后的研究和治療提供了一些思路，但仍需要深入細(xì)致的研究來證實(shí)。