張裕堅,劉付麗,董嬌嬌,葉穎超,林婷婷,蔡瑤瑤,劉 樂
肺缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷是一種急性無菌性肺部損傷,涉及機制復雜廣泛[1-2],可形成炎癥級聯(lián)反應[3]、氧化應激[4-5]、內(nèi)皮細胞屏障損傷[6]、細胞凋亡[7]等一系列病理生理過程,其中氧化應激起著關鍵作用。醛類物質(zhì)是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物,參與氧化應激,高劑量的醛類物質(zhì)具有細胞毒性,但是低劑量的醛類物質(zhì)對機體具有保護作用[8-9]。前期團隊研究發(fā)現(xiàn),ω-3魚油脂肪乳劑(ω-3 fish oil fat emulsion,ω-3FOFE)預處理通過產(chǎn)生低劑量的醛類物質(zhì),刺激抗氧化酶的產(chǎn)生,從而減輕心肌I/R損傷[10]。目前尚未見醛類應激在肺I/R損傷中的研究,因此,本項目通過確定ω-3FOFE預處理產(chǎn)生醛類應激的時間,構建大鼠在體肺I/R模型,探討ω-3FOFE對肺I/R的保護作用。
1.1 材料 健康成年SPF級雄性SD大鼠,體重300~350 g,由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。原位TUNEL凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所);兔抗大鼠多克隆Nrf2抗體 (美國Abcam公司),兔抗大鼠多克隆HO-1抗體(美國Santa Cruz公司),兔抗大鼠單克隆組蛋白H3抗體(美國Millipore公司),兔抗大鼠單克隆β-actin抗體(美國Abcam公司)。
1.2 方法
1.2.1 確定ω-3FOFE預處理產(chǎn)生醛類應激激活抗氧化信號通路時間 ω-3FOFE 注射液劑量參考團隊前期報道(2 ml/kg)。選擇24只 SD雄性大鼠,隨機分成4組(n=6):NS5組(生理鹽水注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d)、FO5組(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d)、FO3組(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射3 d)、FO1組(ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射1 d)。于末次給藥后24 h處死大鼠,取肺組織置于液氮保存。采用相應的試劑盒檢測大鼠肺組織MDA和GSH含量;免疫印跡(Western blot,WB)法檢測核因子-E2相關因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)和血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase -1,HO-1)蛋白來確定ω-3FOFE預處理產(chǎn)生醛類應激激活抗氧化信號通路時間。本項目醫(yī)院倫理批件編號:(2021)第(0110)號。
1.2.2 動物分組及構建大鼠肺I/R模型 參考前期團隊方法建立大鼠肺I/R模型[11],選擇18只 SD雄性大鼠,隨機分為3組(n=6):Sham組(假手術組)、I/R組(肺缺血再灌注組)、FO組(ω-3FOFE預處理+缺血再灌注組)。Sham組造模前生理鹽水注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d,造模開胸僅分離左肺動脈和左支氣管,不阻斷左肺動脈,觀察150 min活體取肺;I/R組造模前生理鹽水注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d,造模開胸阻斷左肺門30 min,再開放恢復供血和通氣120 min;FO組于造模前ω-3FOFE 注射液2 ml/kg尾靜脈注射5 d,其余同I/R組。實驗結束處死大鼠,取肺組織置于液氮保存。測定各組濕干重比(Wet/Dry ratio,W/D);光學顯微鏡下蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE) 染色觀察肺組織病理學改變;TdT介導的dUTP缺口末端標記(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)法檢測肺組織細胞凋亡情況;試劑盒檢測GSH含量;WB檢測Nrf2、HO-1蛋白表達。
1.2.3 肺W/D測定 取出右上肺組織,濾紙吸凈表面水分后稱濕重(Wet,W),然后置于75 ℃烘箱烘干24 h至恒重,稱干重(Dry,D),兩者比值即為肺W/D值。
1.2.4 肺組織病理學改變 取左中肺甲醛固定,脫水透明包埋后制成石蠟切片,HE染色后脫水透明封片,置于光學顯微鏡下觀察肺泡形態(tài)、結構改變及肺間質(zhì)充血水腫等情況。
1.2.5 肺組織細胞凋亡測定 采用TUNEL法檢測細胞凋亡,根據(jù)試劑盒說明書操作。熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光即為凋亡細胞。
1.2.6 MDA含量測定 采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。按照試劑盒說明書操作上樣,在532 nm,1 cm光徑檢測各管吸光度值并根據(jù)說明書公式計算含量。
1.2.7 GSH含量測定 按照GSH檢測試劑盒說明書操作上樣檢測,405 nm處,酶標儀測定各孔吸光度值并根據(jù)說明書公式計算含量。
1.2.8 WB檢測胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白 取左肺組織約1 g,提取肺組織核蛋白測定其蛋白濃度,配置10%分離膠,5%濃縮膠,電泳轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)置聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。配置含5%脫脂奶粉的TBST封閉液,室溫封閉1 h,將膜放入相應兔抗大鼠多克隆Nrf2抗體(1∶2 000)、兔抗大鼠單克隆組蛋白H3抗體(1∶2 000)的一抗液中4 ℃孵育過夜,次日加入山羊抗兔IgG(1∶5 000)的二抗液中室溫孵育1 h,TBST洗去抗體液后,加入發(fā)光液,用凝膠成像儀顯影,系統(tǒng)導出各條帶灰度值,以組蛋白H3為內(nèi)參,計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。組間數(shù)據(jù)比較時,以NS5組或Sham組為對照組,計算其他組與對照組的比值。
1.2.9 WB檢測HO-1蛋白 提取肺組織胞漿總蛋白,如上述步驟電泳轉(zhuǎn)膜封閉,將膜放入相應兔抗大鼠多克隆HO-1抗體(1∶200)、兔抗大鼠單克隆β-actin抗體(1∶1 000)的一抗液中4 ℃孵育過夜,后續(xù)如上述測定灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。最后組間數(shù)據(jù)比較時,以NS5組或Sham組為對照組,計算其他組與對照組的比值。
2.1 確定ω-3FOFE預處理產(chǎn)生醛類應激激活抗氧化信號通路時間 如表1及圖1所示,與NS5組、FO3組和FO1組相比,F(xiàn)O5組大鼠肺組織的醛類物質(zhì)MDA含量明顯增加(P<0.05),且FO5組的Nrf2/HO-1抗氧化通路蛋白表達和抗氧化酶GSH含量也均明顯增加(P<0.05)。NS5組、FO3組、FO1組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果表明,F(xiàn)O5組產(chǎn)生醛類物質(zhì)發(fā)生醛類應激激活抗氧化信號通路,故在后續(xù)缺血再灌注實驗中,選擇ω-3FOFE 2 ml/kg連續(xù)注射5 d的預處理。
表1 各組大鼠肺組織MDA、GSH和Nrf2、HO-1蛋白表達量比較(n=6)
圖1 WB檢測各組大鼠肺組織Nrf2及HO-1蛋白
2.2 ω-3FOFE抑制大鼠肺I/R損傷 在后續(xù)實驗中,將18只大鼠隨機分為Sham組、I/R組和FO組,檢測ω-3FOFE 對大鼠肺I/R損傷的影響。如表2所示,與Sham組相比,I/R組的肺W/D顯著升高(P<0.05),在ω-3FOFE預處理后被抑制(P<0.05)。相應地,與Sham組相比,I/R組大部分肺泡被破壞,腔內(nèi)有大量的紅細胞及水腫液聚集,肺間質(zhì)明顯水腫伴大量中性粒細胞浸潤;與I/R組相比,FO組肺泡破壞程度明顯改善,腔內(nèi)僅有少量紅細胞滲出,如圖2所示。此外,通過熒光顯微鏡檢測細胞凋亡情況,結果顯示,與Sham組相比,I/R組出現(xiàn)大量凋亡細胞,在ω-3FOFE預處理后被抑制,如圖3所示。本實驗結果表明,ω-3FOFE預處理抑制了肺W/D的升高,改善肺組織病理損傷和減少細胞凋亡,對肺I/R損傷有保護作用。
2.3 ω-3FOFE抑制大鼠肺I/R過氧化損傷 如表2及圖4所示,與Sham組相比,I/R組肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達和GSH含量均顯著下降(P<0.05);與I/R組相比,F(xiàn)O組肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達和GSH含量均顯著增加(P<0.05)。結果表明,在大鼠肺I/R模型中,ω-3FOFE預處理后可激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路,從而發(fā)揮肺保護作用。
表2 各組大鼠肺組織W/D、GSH含量和Nrf2、HO-1蛋白表達量比較(n=6)
圖2 各組大鼠肺HE染色病理圖(100×)
圖3 各組大鼠肺組織凋亡情況(200×)
圖4 WB檢測各組大鼠肺組織Nrf2及HO-1蛋白
本研究在大鼠肺I/R模型中檢測了ω-3FOFE預處理后對I/R損傷的影響,結果表明,與I/R組相比,F(xiàn)O組大鼠的肺組織W/D下降、肺泡損傷明顯改善、細胞凋亡數(shù)量大大減少,說明ω-3FOFE對肺I/R損傷有保護作用。這些發(fā)現(xiàn)與之前報道ω-3FOFE對不同器官I/R損傷有保護作用一致[10,12-13],表明ω-3FOFE在預防和治療肺I/R損傷中具有潛在的臨床意義。
ω-3FOFE 中的不飽和雙鍵作為脂質(zhì)過氧化的靶點可生成醛類物質(zhì),而研究表明,低水平的醛類物質(zhì)對機體存在保護作用。Zhang等[8]報道,在法洛四聯(lián)癥患兒行心臟手術中,體內(nèi)醛類表達水平較高的一組患兒術后測得肌鈣蛋白更低,所需正性肌力藥物更少,術后ICU和住院時間更短。MDA是一種醛類物質(zhì),是脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物。GSH有助于保持正常的免疫系統(tǒng)功能,并具有抗氧化作用。本研究結果顯示,注射ω-3FOFE 5 d后,大鼠肺組織中MDA表達水平顯著提高,GSH含量顯著增加,表明ω-3FOFE預處理5 d會使大鼠產(chǎn)生醛類應激產(chǎn)生抗氧化酶,與Dong等[10]的報道一致。
Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵轉(zhuǎn)錄因子,可保護細胞免受氧化應激引起的凋亡[14]。HO-1作為Nrf2下游的靶基因蛋白,是催化血紅素降解的重要限速酶,具有抗炎抗氧化的作用[15]。Dong等[10]報道,ω-3FOFE通過激活Nrf2信號通路減輕了心肌的氧化損傷。Sun等[16]在肺I/R實驗模型中證明了maresin 1具有保護作用,這種保護部分可能依賴于Nrf2/HO-1信號通路介導的抗氧化應激能力。Fan等[17]報道,激活Nrf2/HO-1通路可減少大腦I/R損傷。Qin等[18]報道,通過上調(diào) HO-1 表達可減少氧化應激從而減輕大鼠的肺缺血再灌注損傷。同樣,在本研究中,與I/R組相比,F(xiàn)O組大鼠的肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達顯著增加,表明ω-3FOFE激活Nrf2/HO-1通路,與上述報道相符合。
綜上所述,本研究首次證明了ω-3FOFE通過醛類應激激活Nrf2/HO-1抗氧化蛋白,從而減輕肺I/R損傷。這為今后的研究和治療提供了一些思路,但仍需要深入細致的研究來證實。