姜 鑫 ，范學(xué)偉 ，王鑒波 ，李曉娟 ，陸子秀 ，李樹東

（1.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157041；2.牡丹江市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 牡丹江 157041）

近年來，全國(guó)各地豬場(chǎng)不同程度暴發(fā)產(chǎn)房仔豬病毒性腹瀉，除產(chǎn)房新生仔豬以外其他階段豬群沒有任何臨床表現(xiàn)。新生仔豬發(fā)病主要表現(xiàn)為發(fā)病急、傳播速度快、病死率高，生產(chǎn)中2—3日齡仔豬感染發(fā)病后迅速脫水死亡，病死率100%；10日齡以上仔豬感染病死率30%～50%，給豬場(chǎng)造成的損失巨大，特別是規(guī)模化豬場(chǎng)損失更是慘重。

許多研究表明新生仔豬病毒性腹瀉感染病原主要以豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒A群（GARV）為主，分析場(chǎng)內(nèi)發(fā)病原因可能與以下因素相關(guān)：豬場(chǎng)對(duì)引進(jìn)種豬未經(jīng)隔離馴化，未對(duì)引進(jìn)豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)，直接將帶毒豬誤入生產(chǎn)場(chǎng)；場(chǎng)內(nèi)感染耐過的基礎(chǔ)母豬轉(zhuǎn)陽和場(chǎng)內(nèi)無癥狀帶毒母豬帶毒生產(chǎn)，造成病毒在場(chǎng)內(nèi)循環(huán)，導(dǎo)致母豬排放的帶毒乳汁傳給新生仔豬；另外帶毒母豬排泄糞便造成產(chǎn)房污染，工作人員對(duì)產(chǎn)房洗消不徹底，特別是產(chǎn)房的產(chǎn)床和保溫箱等生產(chǎn)設(shè)施洗消不徹底；新生仔豬沒有獲得足夠的母源抗體，在以上因素的多重作用下，新生仔豬感染發(fā)病并造成窩內(nèi)迅速感染。

本研究團(tuán)隊(duì)選擇黑龍江省暴發(fā)產(chǎn)房仔豬腹瀉豬場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查與分析，選擇發(fā)病豬場(chǎng)外引后備豬、場(chǎng)內(nèi)的基礎(chǔ)母豬和育肥豬三個(gè)群體對(duì)其分泌物進(jìn)行病原檢測(cè)追蹤，探明豬場(chǎng)內(nèi)部豬群PEDV、TGEV、GARV帶毒和排毒狀況，明確豬場(chǎng)腹瀉感染源頭和感染途徑，為豬場(chǎng)防控新生仔豬病毒性腹瀉提供參考依據(jù)。

1 豬群PEDV、TGEV、GARV調(diào)查

1.1 材料與方法

對(duì)豬場(chǎng)引進(jìn)的后備母豬、基礎(chǔ)母豬、育肥豬3個(gè)群體采集口鼻拭子、肛門拭子。

豬流行性腹瀉病毒/豬A群輪狀病毒/豬傳染性胃腸炎病毒三重聯(lián)檢實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（湖南冠牧生物科技有限公司）；病毒DNA/RNA提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）；賽默飛熒光定量PCR儀（ABI7500）。

對(duì)豬場(chǎng)后備母豬、基礎(chǔ)母豬、育肥豬3個(gè)群體分別選取50頭采集口鼻拭子、肛門拭子。將口鼻拭子、肛門拭子群內(nèi)混樣，5頭混成1個(gè)檢測(cè)樣本，每個(gè)群體制作成10份混樣，總計(jì)30份混樣。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)30份混樣進(jìn)行核酸檢測(cè)。

1.2 RNA提取

利用核酸提取試劑盒對(duì)30份樣品進(jìn)行RNA核酸提取，分別獲得50μL核酸模板；

1.3 PEDV/GARV/TGEV核酸檢測(cè)

取PEDV/GARV/TGEV檢測(cè)試劑盒，解凍，離心。

PCR-MIX 配 制：21.5μLPCR反應(yīng)液+1μL酶混合液+0.5內(nèi)標(biāo)，混勻，離心，備用。

分別向每個(gè)PCR管中加入22.5μL的PCR-MIX。

分別向反應(yīng)孔中依次加入2.5μL待檢樣品核酸模板及陰性和陽性對(duì)照。

擴(kuò)增，設(shè)置FAM檢測(cè)PEDV核酸、HEX檢測(cè)GARV核酸、CY5檢測(cè)TGEV核酸和ROX檢測(cè)內(nèi)標(biāo)，設(shè)置體系25μL。設(shè)置擴(kuò)增程序如表1。

表1 擴(kuò)增程序

結(jié)果判定：被檢測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果中FAM通道Ct值≤ 40，擴(kuò)增曲線為典型的S型擴(kuò)增曲線，且ROX內(nèi)標(biāo)通道Ct值≤35，報(bào)告PEDV核酸陽性；被檢測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果中HEX通道Ct值≤ 40，擴(kuò)增曲線為典型的S型擴(kuò)增曲線，且ROX內(nèi)標(biāo)通道Ct值≤ 35，報(bào)告GARV核酸陽性；被檢測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果中CY5通道Ct值≤ 40，擴(kuò)增曲線為典型的S型擴(kuò)增曲線，且ROX內(nèi)標(biāo)通道Ct值≤ 35，報(bào)告TGEV核酸陽性。

1.4 檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 檢測(cè)結(jié)果

1.5 分析與討論

后備豬檢測(cè)結(jié)果PEDV有效樣本10份，GARV有效樣本10份，TGEV有效樣本9份；基礎(chǔ)母豬檢測(cè)結(jié)果PEDV、GARV、TGEV有效樣本9份；育肥豬檢測(cè)結(jié)果PEDV、GARV、TGEV有效樣本9份。

豬場(chǎng)3個(gè)群體口鼻分泌物進(jìn)行PEDV、TGEV、GARV檢 測(cè)， 結(jié)果都檢測(cè)到一定比例的陽性樣本（見圖1），后備豬PEDV、TGEV、GARV陽性比例高于基礎(chǔ)母豬和育肥豬，后備豬陽性比例高，說明后備豬進(jìn)生產(chǎn)群有較大傳播風(fēng)險(xiǎn)；3個(gè) 群 體 PEDV、TGEV、GARV感染且正在通過分泌物向場(chǎng)內(nèi)排毒，造成場(chǎng)內(nèi)病毒循環(huán)；基礎(chǔ)母豬排毒造成產(chǎn)房環(huán)境污染，如果豬群PEDV、TGEV、GARV特 異 性 免疫力差，新生仔豬難以獲得母源抗體，加上新生仔豬先天性免疫力低下，母豬通過乳汁排毒和被母豬排泄物污染的產(chǎn)床雙重壓力下，勢(shì)必會(huì)造成新生仔豬直接接觸到病毒而感染。

圖1 PEDV/TGEV/GARV陽性比例

檢測(cè)數(shù)據(jù)中TGEV和GARV均檢測(cè)到較高的陽性比例，說明TGEV和GARV是造成新生仔豬腹瀉重要因素。值得注意的是許多文獻(xiàn)報(bào)道TGEV感染，造成新生仔豬表現(xiàn)腹瀉和嘔吐癥狀；GARV多引起10日齡以上的頑固性腹瀉且病死率一般30%～40%。本次檢測(cè)的豬場(chǎng)仔豬腹瀉只發(fā)生在出生后2—3日齡，未見嘔吐等癥狀，且場(chǎng)內(nèi)其他階段豬群沒有任何臨床發(fā)病表現(xiàn)，可以說明引起新生仔豬腹瀉的病原不是強(qiáng)毒，只引起先天性免疫力低的新生仔豬發(fā)病。

檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示基礎(chǔ)母豬群體帶毒且排毒的可能性非常大，這要調(diào)查豬場(chǎng)是否有過頑固性腹瀉的發(fā)病史。如果沒有發(fā)病史則后備豬引種帶來的傳播風(fēng)險(xiǎn)最大，如果豬場(chǎng)有發(fā)病史在防控體系不完善的情況下，有可能是母豬中帶毒豬排毒造成新生仔豬腹瀉。

育肥豬PEDV、TGEV未檢測(cè)到陽性樣本，在育肥豬分泌物中檢測(cè)到1份GARV陽性樣本，但是育肥豬群沒有發(fā)病癥狀，說明中大豬對(duì)GARV有較強(qiáng)的抵抗力。

2 總結(jié)

采集豬場(chǎng)引進(jìn)后備豬、場(chǎng)內(nèi)基礎(chǔ)母豬、育肥豬的30份口鼻和肛門拭子進(jìn)行PEDV、TGEV、GARV病原調(diào)查與分析，證明引進(jìn)后備豬和場(chǎng)內(nèi)基礎(chǔ)母豬兩個(gè)群體感染PEDV、TGEV、GARV且向環(huán)境中排毒，造成病毒場(chǎng)內(nèi)循環(huán)并造成產(chǎn)房環(huán)境污染；帶毒豬是豬場(chǎng)新生仔豬病毒性腹瀉的主要傳染源。加強(qiáng)管理及時(shí)篩選并淘汰帶毒豬、阻斷病毒循環(huán)、增強(qiáng)全群的特異性免疫力，是控制豬場(chǎng)新生仔豬病毒性腹瀉的重要手段。豬場(chǎng)采取以下相應(yīng)措施可以降低豬群感染和暴發(fā)病毒性腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1 常規(guī)預(yù)防措施

2.1.1 引種管理

豬場(chǎng)引種時(shí)將病毒帶到場(chǎng)內(nèi)是暴發(fā)產(chǎn)房新生仔豬腹瀉的直接原因。所以豬場(chǎng)在引種時(shí)必須要全面細(xì)致考察，不要從發(fā)生過產(chǎn)房病毒性腹瀉的陽性場(chǎng)引種。新引進(jìn)的后備豬到達(dá)新場(chǎng)后不經(jīng)隔離直接混養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致病毒攜帶豬發(fā)病，并向外傳播病毒。所以新引進(jìn)的后備豬在生產(chǎn)區(qū)外要進(jìn)行隔離，通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段進(jìn)行PEDV、TGEV、GARV檢測(cè)，對(duì)陽性豬采取必要措施。

2.1.2 場(chǎng)內(nèi)豬群免疫與監(jiān)測(cè)

市場(chǎng)上有多種預(yù)防仔豬病毒性腹瀉的商品化疫苗，包括豬流行性腹瀉-傳染性胃腸炎二活聯(lián)苗/滅活苗、豬流行性腹瀉-傳染性胃腸炎-輪狀病毒三聯(lián)活疫苗，分為弱毒苗和滅活苗，但無論哪種疫苗，都無法做到對(duì)豬場(chǎng)豬群的保護(hù)都能達(dá)到預(yù)期的效果。對(duì)引進(jìn)種豬在隔離期間設(shè)計(jì)合理的免疫程序，最好在隔離期內(nèi)完成兩次豬流行性腹瀉-傳染性胃腸炎-輪狀病毒的疫苗免疫。生產(chǎn)群要做到豬流行性腹瀉-傳染性胃腸炎-輪狀病毒疫苗3～4次/年，將傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-輪狀病毒三聯(lián)疫苗免疫列為豬場(chǎng)常態(tài)化免疫程序，傳統(tǒng)的冬春季節(jié)性免疫對(duì)于帶毒排毒豬場(chǎng)已經(jīng)不適用。有計(jì)劃的加強(qiáng)種豬群傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-輪狀病毒疫苗免疫后血清學(xué)抗體監(jiān)測(cè)最好2次/年，確保種豬群的有較高的免疫水平；對(duì)種豬群分泌物排泄物進(jìn)行PCR病原檢測(cè)2～3次/年，考慮經(jīng)濟(jì)成本可以參照本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行混樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)帶毒和排毒陽性豬要進(jìn)行及時(shí)處理。

2.2 發(fā)病緊急處置措施

2.2.1 假定健康豬緊急接種或返飼

一旦豬場(chǎng)2—3日齡新生仔豬出現(xiàn)頑固性腹瀉，馬上采集病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)與分析，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇合適的疫苗進(jìn)行緊急接種，對(duì)妊娠母豬在有效的間隔時(shí)間內(nèi)最好能進(jìn)行兩次疫苗免疫，首次最好使用活疫苗免疫，二次免疫采用滅活疫苗加強(qiáng)免疫，這樣會(huì)取得較好的免疫效果。

很多豬場(chǎng)在出現(xiàn)產(chǎn)房仔豬腹瀉時(shí)采取返飼對(duì)母豬進(jìn)行馴化。將感染發(fā)病豬采集病料經(jīng)特殊處理后拌料，通過口服的方法，感染假定健康豬，使其產(chǎn)生免疫力并將產(chǎn)生的抗體經(jīng)乳汁或者血液傳遞給新生仔豬，使仔豬獲得高滴度母源抗體，從而使仔豬產(chǎn)生對(duì)病毒的抵抗力的過程。返飼的方法對(duì)發(fā)病場(chǎng)控制疫情能達(dá)到一定效果。返飼的具體操作：采集病料最好是發(fā)病24 h內(nèi)或者發(fā)病死亡3～4 h內(nèi)的仔豬腸道及內(nèi)容物，采集的病料勻漿磨碎后加入兩倍體積的生理鹽水混勻，向混勻后的漿液中分別加入10萬IU青霉素和1萬IU鏈霉素；再次攪拌均勻，飼喂場(chǎng)內(nèi)妊娠期不滿85 d的妊娠母豬，飼喂劑量為40～60 g/頭，每日1次，連續(xù)飼喂2～3 d。為保證被返飼母豬豬只能夠?qū)⒊缘阶懔康牟×?，返飼前最好?duì)豬禁食10～12 h。

2.2.3 清洗消毒與場(chǎng)內(nèi)人員管理

產(chǎn)房的清洗和消毒工作是清除產(chǎn)房病原的主要措施。根據(jù)豬場(chǎng)規(guī)模采取批次化生產(chǎn)，做到全進(jìn)全出，確保產(chǎn)房能夠消毒徹底，產(chǎn)床漏縫地板的拆洗、浸泡消毒。消毒液使用兩種以上，可以使用火焰消毒的地方采用火焰消毒，進(jìn)入場(chǎng)內(nèi)的物品必須做到外包裝嚴(yán)格消毒。

發(fā)生產(chǎn)房腹瀉的豬場(chǎng)禁止各棟舍間工作人員交叉接觸，杜絕物品共用，發(fā)病舍內(nèi)各窩間禁止物品或工具共用，停止仔豬寄養(yǎng)工作；最好做到舍內(nèi)工作人員單項(xiàng)流動(dòng)；保證分娩舍內(nèi)溫度與濕度，盡量做到舍內(nèi)溫度適宜、地面干燥；各棟舍除嚴(yán)格落實(shí)腳踏消毒盆每日更換消毒水，如果消毒盆內(nèi)使用3%～5%的火堿溶液做為消毒液，必須在3～4 h更換新溶液。