李 豐賴剛剛趙志慧張 萍朱天生

(塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院,南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團重點實驗室/南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,新疆阿拉爾 843300)

柳樹(Willow)是楊柳科(Salicaceae),柳屬(Salix)的總稱,屬喬木或灌木,全世界約520種,柳樹在中國栽培歷史悠久,全國各地均有分布,主要栽培品種250多種[1]。柳樹分布范圍廣,用途廣泛,不僅可以作為木材資源,還可用于園林綠化、防風(fēng)固沙和醫(yī)藥等領(lǐng)域,特別是對于干旱地區(qū)荒漠化治理有重要作用。此外,由于近年來全球能源短缺,柳樹生長速度快,生物量積累較多,對于一些短輪伐期速生柳來講,具有潛在的開發(fā)潛力[2]。

植原體(Phytoplasma)是一類專性寄生于植物韌皮部或半翅目昆蟲體內(nèi),目前尚難以人工體外純培養(yǎng)的原核微生物,主要由刺吸式口器昆蟲(飛虱、葉蟬等)傳播[3]。植原體已經(jīng)在全球引起1 000多種病害,中國已報道的有100多種[4],主要包括園藝作物、花卉、林業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物,嚴(yán)重威脅世界農(nóng)林業(yè)發(fā)展安全。近年來,柳樹叢枝病在我國西北部分地區(qū)普遍發(fā)生,甘肅、內(nèi)蒙和新疆已見報道。1992年王純利等[5]通過電子顯微鏡對新疆柳樹叢枝病病原進行初步觀察鑒定,認為該病原為類菌原體(Mycoplasma-like Organism,簡稱MLO)。2005 年朱天生[6]對采自塔里木大學(xué)校園內(nèi)的柳樹花變?nèi)~植原體病害進行了分子鑒定,確定了其分類地位,并將其命名為柳樹花變?nèi)~植原體(Willow phyllody phytoplasma)。李巖峰等[7]報道了甘肅酒泉柳樹也表現(xiàn)出叢枝、小葉和枝條增殖等癥狀,并對其進行防治試驗研究。Zhang等[8]對內(nèi)蒙鄂爾多斯市表現(xiàn)增殖和叢枝的柳樹進行了分子檢測和鑒定,并首次將中國柳樹植原體病害鑒定到16Sr VI組[8]。國內(nèi)報道的柳樹植原體病害除叢枝、花變?nèi)~和增殖外,Wei等[9]報道的陜西柳樹植原體病害為典型的黃化癥狀。此外,Mou等[10]在云南省元謀縣發(fā)現(xiàn)了小葉柳(Salix tetradenia)叢枝與畸形。前期通過對新疆烏魯木齊、伊犁、五家渠、阿克蘇、和田、阿拉爾、巴州和喀什等地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn),柳樹花變?nèi)~和叢枝在新疆各地州普遍發(fā)生。本研究擬通過分子生物學(xué)手段鑒定新疆柳樹花變?nèi)~病病原,利用16S r RNA 和tuf基因一致性分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹將其分類到亞組水平,并分析不同地區(qū)柳樹花變?nèi)~植原體16S r RNA 基因的差異性,以期為柳樹植原體病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采自和田市、阿拉爾市、喀什莎車縣、克州阿圖什市、巴州輪臺縣、阿克蘇溫宿縣和圖木舒克市的表現(xiàn)花變?nèi)~和叢枝癥狀的柳樹。取發(fā)病枝條韌皮部,經(jīng)滅菌水處理后,吸水紙吸干水分,自封袋分裝后置于-80 ℃冰箱,備用。陽性對照棗瘋病(‘Jujubew Witches’-broom Phytoplasma)樣品,由山東省果樹研究所高瑞副研究員提供。Taq DNA Polymerase、d NTPs(2.5 mmol/L)和10×PCR buffer購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,DNA Marker 2000、DiaSpin膠回收試劑盒及引物均購自上海生物工程有限公司。

1.2 DNA提取

取0.1～0.2 g柳樹韌皮部組織,采用CTAB法提取總DNA[11-12]。采用Thermo ND-2000微量分光光度計檢測DNA 濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性,將檢測合格的DNA 置于-20 ℃保存,備用。

1.3 16Sr RNA和tuf 基因PCR擴增

植原體16Sr RNA 基因擴增采用Lee等[13]和Gundersen 等[14]所報道的植原體通用引物R16mF2/R16m R1和R16F2/R16R2分別進行直接PCR 和巢式PCR,tuf基因擴增采用Schneider等[15]報道的引物對f Tuf/r Tuf,引物序列如下(表1)。反應(yīng)體系均為25μL,其中10×PCR buffer 2.5 μL、10 μmol/L 引物各1 μL、10 mmol/L d NTPs 1 μL、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5μL、模板DNA 1μL。直接PCR 結(jié)束后,將PCR 產(chǎn)物稀釋30倍,取1μL 作為巢式PCR 模板。16Sr RNA 基因直接PCR 擴增反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min;共30個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min;巢式PCR 條件將退火溫度設(shè)為57 ℃,其他均與第一次擴增相同。

表1 PCR 引物Table 1 Primer of PCRs in this study

tuf基因PCR 擴增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s;55℃退火30 s,72℃延伸1 min;共35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。以健康的柳樹總DNA 為陰性對照,栆瘋病DNA 為陽性對照,無菌雙蒸水為空白對照。PCR 產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結(jié)果。

1.4 PCR產(chǎn)物純化及測序

使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒將目標(biāo)條帶進行切膠回收后,送上海生物工程有限公司進行測序。

1.5 序列比對和虛擬RFLP分析

利用DNAStar Seq Man 軟件對獲得的序列進行校正及拼接后,提交到GenBank中獲得基因序列號。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中對獲得的基因序列Blast在線比對獲得同源序列,通過MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,Boot strap重復(fù)數(shù)為1 000[16]。利用植原體在線分類工具(iPhyClassifier(https://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/reso-urce/iphyclassifier.cgi)對獲得的16S r RNA 序列進行相似性系數(shù)分析和虛擬RFLP分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病柳樹表現(xiàn)癥狀

柳樹在初春時期,枝條頂端未展開,多表現(xiàn)為叢枝癥狀(圖1-A～1-C);4 月花期,柳樹花序畸形,表現(xiàn)為花變?nèi)~,隨著其生長,后期形成不規(guī)則疙瘩形狀(圖1-D～1-F);7-8月由于高溫枝條頂部水分及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足,導(dǎo)致病部及以上部分枝條干枯(圖1-G)。

圖1 新疆柳樹花變?nèi)~和叢枝病表現(xiàn)癥狀Fig.1 Symptoms of willow phyllody and witches’-broom disease in Xinjiang

對新疆7個地區(qū)表現(xiàn)花變?nèi)~和叢枝的柳樹植株總DNA 經(jīng)PCR 擴增后,1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果表明,利用引物對R16F2/R16R2 經(jīng)巢式PCR 擴增到約為1.2 kb的16S r RNA 片段;引物對f Tuf/r Tuf經(jīng)PCR 擴增得到約800 bp特異性條帶,dd H2O 空白對照與健康對照均為擴增出特異性條帶(圖2)。

圖2 柳樹花變?nèi)~植原體16S r RNA 和tuf 基因PCR 檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection results of 16S rRNA and tuf gene of willow phyllody phytoplasma

2.2 16S r RNA序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

經(jīng)測序結(jié)果表明,來自7個地區(qū)柳樹病樣擴增得到的11條16S r RNA 基因片段長為1 235～1 240 bp,將序列提交到GenBank登錄號分別為:MW411190、MW411193～MW411201、MW390640。利用Meg Align軟件對7個地區(qū)白柳花變?nèi)~植原體16S r RNA 基因序列一致性比較發(fā)現(xiàn),G+C含量為45.6%,序列一致性為99.4%～100.0%(表2)。BLAST 分析表明,柳樹花變?nèi)~植原體16S r RNA 序列與榆樹黃化組(EY)植原體文冠果叢枝(‘Xanthoceras sorbifolia’Bunge witches’-broom phytoplasma,GenBank Accession No.KC331045)和桃黃化(‘Prunus persica’yellows phytoplasma,Accession No.KF523370)同源性為99.76%。初步確定柳樹花變?nèi)~植原體屬于16Sr V 組。系統(tǒng)進化樹顯示,柳樹花變?nèi)~植原體與榆樹黃化組(16Sr V)組植原體聚為一枝,親緣關(guān)系最近,進一步確定該植原體為16Sr V 組成員(圖3)。

圖3 基于新疆柳樹花變?nèi)~植原體16S r RNA(左)和tuf 基因(右)序列以及相關(guān)植原體株系構(gòu)建系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S r RNA(left)and tuf (right)gene sequences of willow phyllody phytoplasma from Xinjiang and other related phytoplasma

表2 利用MegAlign對7個地區(qū)11條16S rRNA 序列一致性的分析Table 2 Analysis of sequence identity of eleven 16S r RNA in seven regions by use of MegAlign%

2.3 tuf 基因序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

從和田白柳、龍爪柳、阿拉爾白柳和阿克蘇龍爪柳病樣中PCR 擴增出的4個tuf基因片段經(jīng)測序得到824 bp的序列,GenBank登錄號分別為MW435399～MW435402。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的同源序列進行比對,結(jié)果表明,該序列與棗瘋病(GenBank 登錄號:GU137287)的tuf基因序列相似性為98.3%,采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹表明,柳樹花變?nèi)~植原體tuf基因序列與榆樹黃化組植原體聚為一枝,與中國櫻桃黃化致死(GenBank登錄號:KJ452549)親緣關(guān)系最近,屬于榆樹黃化組(EY)的tufV-B亞組。

2.4 16S r RNA虛擬RFLP分析

柳樹花變?nèi)~植原體16S r RNA 虛擬RFLP分析結(jié)果表明,該植原體16S r RNA 基因片段的限制性片段長度多態(tài)性與棗瘋病株系(Gen Bank登錄號:AB052876)有99.8%的相似性,虛擬RFLP模式與16Sr V-B亞組的參考模式相同,相似系數(shù)為1.00。進一步證明柳樹花變?nèi)~植原體為16Sr V-B亞組成員。

3 討論

本研究以在新疆發(fā)現(xiàn)的表現(xiàn)出叢枝和花變?nèi)~的柳樹為材料,通過16S r RNA 基因和tuf基因進行PCR 擴增、構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹以及16S r RNA 虛擬RFLP分析,結(jié)果顯示,在新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的柳樹花變?nèi)~屬于植原體病害16Sr V-B 亞組成員。

柳樹在新疆分布廣泛,品種較多。作為園林綠化和園藝觀賞樹種,對干旱地區(qū)防風(fēng)固沙和水土保持有重要作用。近年來,柳樹植原體病害在國內(nèi)外不斷被發(fā)現(xiàn)并報道,云南、陜西、內(nèi)蒙、甘肅和新疆均已見報道,分別屬于16SrΙ-B、16SrΙ-C和16Sr VI-A 組,引起癥狀有黃化、小葉、叢枝、增殖和花變?nèi)~[18-20]。伊朗和印度也發(fā)現(xiàn)該病害,研究人員報道該病害與植原體有關(guān)[21-23]。這是首次報道柳樹花變?nèi)~病害與16Sr V-B 亞組植原體有關(guān)。

1992年王純利等[5]首次報道新疆柳樹植原體病害,并將其命名為柳樹叢枝病;朱天生[6]在山東對柳樹植原體病害進行了報道,將其命名為柳樹花變?nèi)~植原體;魏婷等[18]在陜西報道的柳樹植原體病害癥狀主要表現(xiàn)為黃化;自1992以來,該病害在新疆各地區(qū)不斷被發(fā)現(xiàn),其發(fā)病不斷加重。Luan等[20]在2005 年對新疆柳樹花變?nèi)~植原體病害進行了調(diào)查,結(jié)果顯示,喀什及阿克蘇地區(qū)發(fā)病率達到60%,和田及阿拉爾地區(qū)近50%,巴州地區(qū)近10%。該病害在新疆不同地區(qū)、不同柳樹品種上發(fā)病程度有所差異,嚴(yán)重者則樹體頂枯,但尚未發(fā)現(xiàn)有整株死亡現(xiàn)象。植原體感染柳樹后,部分柳樹在不同時期癥狀表現(xiàn)也不同,如白柳,春季有花變?nèi)~、叢枝癥狀混合發(fā)生,夏秋兩季多表現(xiàn)為叢枝癥狀。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),花變?nèi)~和叢枝癥狀植原體16S r RNA 和tuf基因序列間無差異,這與植原體能引起寄主植物多種癥狀的特性相符。但這是否與其他功能基因有關(guān),仍需進一步研究。該病害自發(fā)現(xiàn)以來,一直未見其傳播介體的報道。由于其分布廣,防治困難,再考慮到柳樹的經(jīng)濟效益較低,因此,該病害的研究較為滯后,目前亟待有效控制該病害的措施,以控制該病害傳播,減少林業(yè)損失。