賈燕青仇薪鑫張 蓉楊增岐

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院/動(dòng)物疫病防控陜西省高校工程研究中心,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)禽業(yè)的重要病原之一,其強(qiáng)毒能夠?qū)е录仪?0%以上的死亡,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。研究病毒與宿主之間的作用關(guān)系,可以有效幫助闡明病毒感染及宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系,有利于幫助新城疫防控和新疫苗研發(fā)[3-5]。高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了NDV 感染時(shí)對宿主基因變化規(guī)律的研究,本研究前期通過轉(zhuǎn)錄組測序全面深入了解NDV 感染無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)雞胚后內(nèi)臟組織mRNAs表達(dá)譜的變化,比較不同毒力NDV 毒株對雞胚組織基因表達(dá)的影響,并對NDV 感染引起的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和生物學(xué)通路分析,篩選與天然免疫反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵基因及通路[3-4]。

在干擾素(Interferon,IFN)相關(guān)差異表達(dá)基因中,選擇一些基因進(jìn)行深入研究,發(fā)現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)蛋白35(Interferon induced protein 35,IFI35)抗NDV 效果較好,因此對該分子進(jìn)行深入研究并發(fā)現(xiàn)該分子可以通過增強(qiáng)IFNs表達(dá)來發(fā)揮抗NDV 作用。然而有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),不同的基因可以通過改變細(xì)胞生長狀態(tài)來影響NDV 在細(xì)胞中的增殖[6-8],本研究通過探索IFI35基因在抗NDV 感染過程中是否還存在除了干擾素通路以外的其他途徑來抑制病毒的增殖,闡明IFI35抗NDV 感染的其他分子機(jī)制,以期為NDV 的防治提供新的靶點(diǎn)與思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 雞成纖維細(xì)胞系(DF-1)、NDV 強(qiáng)度株F48E9和弱毒株La Sota-GFP均來自于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶、高保真酶Prime STAR MAX為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒為北京GenStar公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium,DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清為GIBCO 公司產(chǎn)品;TurboFect轉(zhuǎn)染試劑盒購自Thermo Scientific公司;鼠源HA 單抗、GAPDH 單抗、羊抗鼠IgG-HRP為天津三箭生物公司產(chǎn)品;鼠源Flag單抗、兔源HA 多抗、羊抗鼠綠色熒光抗體和羊抗兔紅色熒光抗體為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;聚二偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜為美國GE 公司產(chǎn)品;凋亡檢測試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照RNAiso Plus提取細(xì)胞或組織總RNA,按照StarScript ⅡFirst-strand cDNA Synthesis Mix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)2×RealStar Green Power kit說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析,以28S 為內(nèi)參,檢測目的基因的表達(dá),引物序列見表1。反應(yīng)體系(20μL)為:cDNA 1μL,上游引物(10μmol/L)0.4μL,下游引物(10μmol/L)0.4μL,2×RealStar Green Fast Mixture 10μL,dd H2O 8.2μL;混勻后,進(jìn)行PCR 反應(yīng),反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃,2 min;95 ℃,15 s,60 ℃,30 s,45個(gè)循環(huán)。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 基因擴(kuò)增、質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)RNA-Seq測序結(jié)果及NCBI數(shù)據(jù)庫中IFI35基因的預(yù)測序列(GenBank登錄號(hào):XM_418132.5)設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞源IFI35基因片段的引物。收集F48E9感染的雞胚成纖維原代細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast,CEF),提取RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成的cDNA 用于擴(kuò)增IFI35基因片段。使用高保真酶Prime STAR MAX 進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃,預(yù)變性5 min;95 ℃15 s,55 ℃15 s,72 ℃45 s,40個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物測序正確后,連接至p CMV-3HA 載體上,構(gòu)建p CMV-3HA-IFI35 質(zhì)粒。 以同種方法成功構(gòu)建p CAGGS-Flag-IFI35等質(zhì)粒,并經(jīng)雙酶切及測序進(jìn)行驗(yàn)證。

將狀態(tài)良好的DF-1 細(xì)胞生長于24 孔板中(105/孔),待細(xì)胞生長至80%融合時(shí),進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,按照TurboFect轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h 后,收集細(xì)胞,檢測目的基因的m RNA 和蛋白表達(dá)變化。

1.2.3 NDV 感染細(xì)胞及病毒滴度測定 對病毒增殖主要采用半數(shù)組織感染劑量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)和熒光密度進(jìn)行測定。DF-1細(xì)胞在96孔或24孔板培養(yǎng)24 h,將收集的待測病毒上清進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋,以100 μL/孔或300μL/孔依次加入96孔板或24孔板中。在病毒感染后連續(xù)5 d進(jìn)行觀察直至沒有新的病變出現(xiàn),統(tǒng)計(jì)并記錄每孔病毒的感染情況。TCID50用Reed-Muench方法進(jìn)行計(jì)算,平均每個(gè)視野下熒光強(qiáng)度計(jì)算參考文獻(xiàn)所用方法[9]。

1.2.4 蛋白免疫印跡 DF-1細(xì)胞均勻鋪于24孔細(xì)胞板中,待單層細(xì)胞生長至85%融合時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將p CMV-3HA-IFI35、p CMV-3HA、p CAGGS-Flag-IFI35 及p CAGGS 質(zhì)粒進(jìn)行單轉(zhuǎn),每種質(zhì)粒各轉(zhuǎn)1μg/孔,24 h 后收集蛋白樣品,用蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測IFI35表達(dá)量。用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered solution,PBS)將細(xì)胞洗滌3遍,在細(xì)胞中加入含苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的RIPA(Radio immunoprecipitation assay)裂解液,然后置于冰上充分裂解30 min。將細(xì)胞裂解液收集到1.5 m L 離心管中,4 ℃、12 000 r/min 離心10 min,收取上清加入5×蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min。制備濃度為12%SDS-PAGE 的分離膠,每孔加入等量蛋白,在80 V 進(jìn)行電泳30 min,當(dāng)染料跑出濃縮膠時(shí),120 V 繼續(xù)電泳,直到樣品電泳至膠底即可結(jié)束電泳。將PVDF膜在甲醇中浸泡20 s,取出電泳膠,按順序裝好轉(zhuǎn)膜夾,100 m A 恒流電泳1 h。電泳結(jié)束,將PVDF膜浸泡在濃度為10%的脫脂奶粉中,室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后,將膜放入一抗孵育液中,4 ℃過夜孵育。用TBS+Tween緩沖溶液(Tris-HCl and Tween,TBST)清洗PVDF膜5次,每次10 min。結(jié)束后,在搖床上緩慢孵育二抗1 h,用TBST 緩沖液清洗PVDF膜5次,每次10 min。洗滌結(jié)束后,在蛋白曝光儀上進(jìn)行曝光,并記錄結(jié)果。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測 待DF-1細(xì)胞生長密度達(dá)80% 左右時(shí),用Turbofect 轉(zhuǎn)染pCAGGSFlag-IFI35與Vec質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染24 h 后,一組接種0.1MOI F48E9,另一組不接毒,每組3 個(gè)重復(fù),并設(shè)置空白對照組。接毒24 h 后按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測樣品準(zhǔn)備。用不含乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)的胰酶消化細(xì)胞,1 000 g離心3 min,棄上清,用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞,重復(fù)清洗細(xì)胞兩次;用Binding Buffer重懸細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約為1×106/m L;取100μL細(xì)胞懸液,加5μL Annexin V-FITC和10μL 碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液;避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。第二象限顯示晚期凋亡細(xì)胞,第四象限顯示早期凋亡細(xì)胞。同時(shí)利用RT-qPCR 方法檢測IFI35對線粒體凋亡相關(guān)基因m RNA 水平的影響,主要包括p53、Caspase3和FasL,引物如表1所示。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),用GraphPad prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。結(jié)果采用student’sttest進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 mRNAs表達(dá)差異分析及RT-qPCR 結(jié)果驗(yàn)證

前期NDV 轉(zhuǎn)錄組測序研究中發(fā)現(xiàn),F48E9感染后獲得2 035個(gè)差異表達(dá)基因,其中1 190個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào),845個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào);La Sota感染后獲得1 604 個(gè)差異表達(dá)基因,其中992個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào),612個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào);La Sota感染組與F48E9 感染組比較,獲得1 028個(gè)差異表達(dá)基因,其中360 個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào),668 個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào)。利用RTqPCR 技術(shù)對隨機(jī)選取的10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證,熒光定量PCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相似,干擾素刺激基因12(Interferon-stimulated gene 12-2,ISG12-2)、IFI35、莫羅尼白血病病毒10(Moloneyleukemiavirus 10,Mov10)、遺傳和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白2基因(Laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)、干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF3)、黏病毒抵抗蛋白(Myxovirus resistance,Mx)基因、寡腺苷酸合成酶樣蛋白(Oligonucleotide synthaselike protein synthetase,OASL)基因、三重基序蛋白25(Tripartite motif-containing protein 25,TRIM25)基因、組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase type 2,TGM2)及8號(hào)染色體開放閱讀框4 抗體(Chromosome 8 open reading frame,C8ORF4)均為表達(dá)上調(diào)差異基因且在強(qiáng)弱毒株感染時(shí)有差異(圖1),這些驗(yàn)證結(jié)果表明測序結(jié)果比較可靠,可用于數(shù)據(jù)分析。

圖1 RNA-Seq測序及RT-qPCR 驗(yàn)證分析Fig.1 Analysis of RNA-Seq and RT-qPCR verification

2.2 IFI35 對NDV增殖的影響

選取部分差異表達(dá)基因,將其克隆連接至載體上,進(jìn)行NDV 感染研究,這些基因包括IFI35、ISG12-2、C2orf40、C8orf4、TCF21和TIRM25。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后接種La Sota-GFP病毒,并在接毒后12 h、24 h、36 h和48 h觀察La Sota-GFP感染細(xì)胞熒光強(qiáng)毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFI35抗NDV 效果較好(圖2),因此對該分子進(jìn)行深入研究。

圖2 基因過表達(dá)對La Sota-GFP增殖的影響Fig.2 Effect of gene overexpression on the proliferation of La Sota-GFP

構(gòu)建IFI35過表達(dá)重組質(zhì)粒,并用western bolt進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的質(zhì)?？梢杂行г黾覫FI35的表達(dá)。在DF-1細(xì)胞中過表達(dá)IFI3524 h(圖3),再感染F48E9或La Sota-GFP后,取接毒后9、12、24、36和48 h樣品檢測病毒增殖,發(fā)現(xiàn)IFI35過表達(dá)可以有效地抑制NDV 的復(fù)制,在接毒后9、12、24、36和48 h La Sota-GFP分別被抑制2.5、5.03、5.83、9.17和6.67倍,F48E9分別被抑制3.33、10、10、7.5和9.17倍,以上結(jié)果表明IFI35可有效抑制NDV 的增殖。

圖3 過表達(dá)IFI35 可抑制NDV增殖Fig.3 Overexpression of IFI35 inhibit the proliferation of NDV

2.3 IFI35 抗NDV機(jī)制研究

為了闡明IFI35抗病毒機(jī)制,在DF-1 細(xì)胞中過表達(dá)IFI3524 h后感染NDV 病毒,通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)IFI35可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,IFI35過表達(dá)時(shí)可顯著增強(qiáng)NDV 誘導(dǎo)的DF-1細(xì)胞的凋亡,早晚期凋亡細(xì)胞百分比約是對照組的2倍(圖4-A),進(jìn)一步驗(yàn)證了NDV 可引起細(xì)胞凋亡。利用RTqPCR 方法檢測m RNA 水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IFI35可促凋亡基因p53、Caspase3和Fas L顯著上調(diào),這些數(shù)據(jù)表明,過表達(dá)IFI35可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡和NDV 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,IFI35可以通過激活細(xì)胞凋亡通路來抵抗NDV 的增殖。

圖4 IFI35 過表達(dá)時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig.4 Overexpressed IFI35 could promote cell apoptosis

3 討論

本試驗(yàn)篩選了NDV 感染后的差異表達(dá)基因進(jìn)行抗病毒研究,發(fā)現(xiàn)IFI35基因在抗NDV 感染中效果較好,因此對該基因進(jìn)行了深入的分析和研究。IFI35是1994年在IFNγ處理的HeLa細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)的[10],隨后IFI35序列在鼠、牛及魚類相繼報(bào)道[11-13],到目前為止,IFI35的分子功能僅在哺乳類和甲骨魚中報(bào)道,IFI35對病毒增殖的影響研究較少,據(jù)報(bào)道IFI35可通過直接與豬流感病毒(H3N2)的病毒蛋白NS1相互作用來抑制病毒的復(fù)制,使視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)從IFI35介導(dǎo)的K48連接泛素化和降解中釋放出來,產(chǎn)生抗病毒作用,而IFI35不能與禽流感病毒(H7N9)NS1蛋白作用,導(dǎo)致在H7N9感染時(shí)發(fā)揮相反的作用[14]。IFI35可以通過保持RIG-I的磷酸化并對其進(jìn)行泛素化降解達(dá)到天然免疫反應(yīng)信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而促進(jìn)VSV病毒的復(fù)制[12]。在本研究中,過表達(dá)IFI35可以抑制F48E9和La Sota的增殖,這與抑制牛泡沫病毒(Bovine foamy virus,BFV)和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)增殖的報(bào)道相似[11,15-16]。眾所周知,在雞上缺少RIG-I分子,這可能是導(dǎo)致IFI35在VSV 和NDV 感染中有差異的原因,雖然黑色素瘤分化相關(guān)基因5(Melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)與RIG-I的部分功能相似,但是他們在對病毒應(yīng)答和降解方式上還是存在著差異[16]。IFI35是一種IFN誘導(dǎo)基因,筆者已經(jīng)證明了IFI35與IFN 之間的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)IFI35可以調(diào)節(jié)IFNs的產(chǎn)生,進(jìn)而發(fā)揮抗NDV 的作用[17]。

細(xì)胞凋亡是由多種基因調(diào)控的一種程序性細(xì)胞死亡方式,也是宿主抵抗病毒感染的一種防御策略[18]。在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)雞源IFI35過表達(dá)后,在凋亡檢測中早晚期凋亡細(xì)胞明顯增多,這表明IFI35可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,也可以促進(jìn)NDV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在從m RNA 水平進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是否有NDV 感染,都可以引起FasL表達(dá)量增加,而在NDV 感染時(shí)可促進(jìn)p53和Caspase3表達(dá)增加。FasL作為細(xì)胞膜表面分子,過表達(dá)時(shí)可觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)部凋亡程序,引起靶細(xì)胞程序性凋亡,研究發(fā)現(xiàn)NDV V 蛋白過表達(dá)可抑制該基因的表達(dá),從而抑制細(xì)胞凋亡[7]。p53基因可以抑制腫瘤發(fā)生,也能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,研究表明當(dāng)過量表達(dá)時(shí)可以抑制NDV 和IBDV 的增殖[19]。Caspase3基因是引起細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)基因,當(dāng)線粒體凋亡途徑激活后,可改變線粒體的膜通透性,導(dǎo)致Cyt c等大分子蛋白質(zhì)釋放,可以激活Caspase3/Caspase9,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生[20]。ISG12(1)過表達(dá)可以引起B(yǎng)ak、Cyt c和Caspase3/Caspase9表達(dá)增加,通過細(xì)胞凋亡方式,來抑制NDV 的增殖[21]。在HK-2細(xì)胞中,miR-146b-5p可靶向IFI35介導(dǎo)JAK1/STAT1信號(hào)抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,IFI35過表達(dá)可促進(jìn)LPS引起的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,而敲低IFI35可導(dǎo)致相反的趨勢[22]。本研究結(jié)果初步表明,IFI35可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制NDV的增殖,但是具體的激活路徑還需要進(jìn)一步再深入研究,為深入了解NDV 與宿主的相互作用提供新的見解,也為NDV 防治提供新的靶點(diǎn)。

4 小結(jié)

利用高通量測序技術(shù)對NDV 感染的雞胚內(nèi)臟組織轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行測序分析,與對照組相比,F48E9感染組和La Sota感染組分別有2 035和1 604個(gè)差異表達(dá)基因,對部分差異表達(dá)基因進(jìn)行抗NDV 增殖研究,雞源差異表達(dá)基因IFI35抗病毒效果較好,除了IFN 信號(hào)通路抑制病毒增殖以外,本研究發(fā)現(xiàn)IFI35可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加,對NDV 增殖發(fā)揮抑制作用,這些研究豐富了宿主抗NDV 的分子機(jī)制研究,也為新城疫防治和疫苗研發(fā)提供新的思路。