張國(guó)軍王殿永楊艷梅陳建國(guó)暢麗芳吳 金高玉龍楚洪源柳增善張媛媛

(1.吉林大學(xué)人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130062;2.吉林大學(xué)致遠(yuǎn)有限公司,長(zhǎng)春 130012;3.河北省昌黎縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河北昌黎 066600;4.吉林和元生物工程有限公司,吉林松原 138000;5.北京大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,北京 100080)

水貂克雷伯桿菌性肺炎是水貂養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)病和多發(fā)病,常在7-10月份發(fā)生局部流行。在山東、河北、遼寧等地的水貂養(yǎng)殖場(chǎng)個(gè)別年份成年貂的發(fā)病率可達(dá)50%以上,主要癥狀為發(fā)熱,全身出現(xiàn)膿瘍,特別是頸部有許多小膿泡,肺出血、呼吸困難等臨床表現(xiàn),嚴(yán)重者呈急性死亡[1-3]。

為了更好地控制本病,2010 年至2021 年期間,初步對(duì)山東、河北、遼寧等地疑似水貂肺炎克雷伯桿菌病病例進(jìn)行病原分離與鑒定,利用分離菌對(duì)水貂的致病性、免疫原性及疫苗潛力進(jìn)行分析,現(xiàn)將有關(guān)試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2010年至2021年,先后從山東諸城、河北饒陽(yáng)、遼寧大連等地區(qū)大型水貂養(yǎng)殖場(chǎng)或養(yǎng)殖戶(hù)的水貂無(wú)菌采集肺臟、肝臟、脾臟、腎臟作為病料?；疾∷跻园l(fā)熱、全身出現(xiàn)膿瘍,特別是頸部有許多小膿泡、肺出血、呼吸困難、急性死亡為特征。

1.1.2 培養(yǎng)基及氫氧化鋁膠 普通瓊脂、馬丁瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,購(gòu)自中海生物科技有限公司。HiBio-IDTM系列微生物生化鑒定卡購(gòu)自Hi-Media公司。普通肉湯與革蘭氏染色液由實(shí)驗(yàn)室配制。氫氧化鋁膠購(gòu)自河南通商進(jìn)出口有限公司。

1.1.3 引物 16S r DNA 擴(kuò)增引物(F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 10月齡健康易感青年貂購(gòu)自遼寧省莊河市富貴養(yǎng)貂專(zhuān)業(yè)合作社,該合作社未曾接種過(guò)任何肺炎克雷伯桿菌疫苗,貂場(chǎng)也未曾發(fā)生疑似相關(guān)的呼吸道癥狀病例;新購(gòu)貂在吉林和元生物工程股份有限公司動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)14 d后,臨床表現(xiàn)健康者用于動(dòng)物回歸試驗(yàn)和毒力測(cè)定。

1.1.5 儀器 恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司,HZQ-QA/QB 型恒溫培養(yǎng)搖床購(gòu)自蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司。BX53M 正立金相顯微鏡購(gòu)自杭州全譜實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與常規(guī)生理生化鑒定 細(xì)菌分離無(wú)菌操作從病死水貂體內(nèi)采集肺臟、脾臟或肝臟及腎臟組織,劃線接種于普通瓊脂平板上,于37 ℃培養(yǎng)24～48 h,觀察菌落形態(tài)。挑取單個(gè)較大的灰白色黏稠菌落,接種于普通瓊脂平板劃線純化分離,確定純化無(wú)污染后挑取少量菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)14～18 h,凍干保存,記為F0代,其余培養(yǎng)物作鑒定用。

細(xì)菌鑒定:取純培養(yǎng)的單個(gè)典型菌落作革蘭氏染色,鏡檢。純培養(yǎng)的單個(gè)菌落劃線接種于普通瓊脂、馬丁瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,置于37℃培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。取純培養(yǎng)物分別進(jìn)行吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn),甲基紅(MR)試驗(yàn),VP試驗(yàn),明膠液化試驗(yàn),氧化酶試驗(yàn)、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、鼠李糖、乳糖等糖的發(fā)酵試驗(yàn),觸酶試驗(yàn),硝酸鹽還原試驗(yàn),H2S試驗(yàn)等常規(guī)生化試驗(yàn)鑒定[4]。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)臨床特征、菌落形態(tài)、革蘭氏染色、生化及致病性特點(diǎn),選擇其中的FY2和FY3株細(xì)菌劃線純培養(yǎng),16～20 h后,取平板內(nèi)直徑不小于2 mm 的較大單菌落,全部挑入盛有100μL去離子水的1.5 m L 離心管內(nèi),沸水浴15 min。取出自然冷卻至室溫,12 000 r/min 離心5 min,取上清3 μL,用細(xì)菌的16S r RNA 引物擴(kuò)增細(xì)菌16S r RNA。PCR 體系:Pre MixrTaq(2×)25μL,10μmol/L 上下游引物各1.5μL,模板(煮沸后上清)3μL,去離子水19μL。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94 ℃3 min;94 ℃30 s,50 ℃30 s,72 ℃1 min,30 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保溫。

擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度1 400 bp,純化后送吉林庫(kù)美生物科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。按常規(guī)方法將所得序列提交NCBI網(wǎng)站的BLAST 功能網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行核酸序列比對(duì),網(wǎng)址為:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

1.2.3 動(dòng)物回歸及毒力測(cè)定試驗(yàn) 分別取6株分離細(xì)菌的單個(gè)菌落劃線接種于普通瓊脂平板上,置37 ℃培養(yǎng)18 h,刮取平板上所有菌落混于滅菌PBS(0.2 mol/L,p H 7.2)中,制成細(xì)菌懸液,無(wú)菌條件下進(jìn)行10倍梯度稀釋,將不同濃度菌液分別接種于普通瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)18 h,計(jì)數(shù),判定菌液濃度。將其濃度稀釋至1.0×106CFU/m L,以1.0 m L/只劑量肌肉注射10月齡健康易感青年貂5只,同時(shí)設(shè)立PBS注射對(duì)照組。攻毒后連續(xù)觀察14 d,每日記錄水貂的精神狀況、食欲、排便、活動(dòng)及死亡情況,死亡貂立即解剖,觀察是否有病理變化,無(wú)菌采集臟器分離細(xì)菌。依據(jù)劑量和對(duì)動(dòng)物致病結(jié)果確定菌株的毒力強(qiáng)弱。

1.2.4 強(qiáng)毒分離株對(duì)易感水貂最小完全致死量的確定 根據(jù)毒力回歸試驗(yàn)結(jié)果,取其中2個(gè)典型強(qiáng)毒分離菌株純培養(yǎng)的單菌落,劃線接種于普通瓊脂平板上,置37 ℃培養(yǎng)18 h,刮取平板上所有菌落混于滅菌PBS中制成細(xì)菌懸液,以平板培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)法確定菌數(shù),根據(jù)預(yù)試驗(yàn)初步摸索的致病劑量,將其濃度稀釋至1.0×105、2.5×105、5.0×105、1.0×106、1.5×106CFU/m L 共5組,每組以1.0 m L/只劑量肌肉注射10月齡健康易感青年貂5只,同時(shí)設(shè)立水貂(滅菌PBS注射)對(duì)照組。所獲數(shù)據(jù)以Duncan氏顯著性檢測(cè)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[5]。

攻毒后連續(xù)觀察14 d,每日記錄水貂的精神狀態(tài)、食欲、排便、活動(dòng)及死亡情況,對(duì)死亡貂立即解剖,取內(nèi)臟分離細(xì)菌。

1.2.5 強(qiáng)毒分離株的免疫原性試驗(yàn) 將確定的強(qiáng)毒分離株接種普通肉湯培養(yǎng)24 h后,收集菌體制成20%氫氧化鋁膠佐劑滅活疫苗,配苗后每毫升抗原液菌數(shù)分別為1.0×109CFU、2.0×109CFU、3.0×109CFU、4.0×109CFU,用10月齡健康易感青年貂各5只,分別皮下注射1.0 m L。同時(shí)設(shè)不接種對(duì)照5只。接種后21 d,每只免疫和對(duì)照水貂各肌肉注射“1.2.3”中確定的強(qiáng)毒分離株最小完全致死劑量的高一滴度,觀測(cè)14 d。計(jì)算疫苗的免疫保護(hù)效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

從山東、河北、遼寧等地區(qū)的水貂樣品獲得6個(gè)可疑分離菌株,在普通瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈圓形、濕潤(rùn)、光滑、稍隆起、邊緣整齊的中等大灰白色黏稠菌落。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,菌體為革蘭氏陰性粗短桿菌,呈單個(gè)或成對(duì)分布,偶爾呈鏈狀排列,無(wú)芽胞。

2.2 分離菌株的生化鑒定

生化鑒定結(jié)果表明,6株分離細(xì)菌的生化反應(yīng)相同,能發(fā)酵所試驗(yàn)的6種糖類(lèi),產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不產(chǎn)生硫化氫,不液化明膠,吲哚(靛基質(zhì))陰性,過(guò)氧化氫酶陰性,觸酶陽(yáng)性,VP陽(yáng)性,甲基紅(MR)陰性,還原硝酸鹽,符合肺炎克雷伯菌的基本生化反應(yīng)特征(表1),分別命名為FY1、FY2、FY3、FY4、FY5、FY6。

表1 6株分離菌主要生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 Main biochemical reaction results of 6 isolates

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

FY2和FY3菌株16S r RNA 的擴(kuò)增片段大小為1 400 bp(圖1),與預(yù)期大小一致。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析表明,2 個(gè)擴(kuò)增序列與GenBank 庫(kù)內(nèi)序列號(hào)為NR074913.1 的ATCC 標(biāo)準(zhǔn)克雷伯氏菌菌株“Klebsiellapneumoniaesub sp.pneumoniaeMGH 78578 strain ATCC 700721; MGH 78578 16S ribosomal RNA,complete sequence”一致性為100%,與GenBank公布的肺炎克雷伯桿菌的16S r RNA(登 錄 號(hào) 為 KJ803939.1、HM585430.1、AB558500.1等)的一致性為99%。表明兩個(gè)分離菌株均為肺炎克雷伯桿菌(圖2)。

圖1 分離菌FY2和FY3株的16S r RNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 16S r RNA amplification results of isolated strains FY2 and FY3

圖2 FY3株16S r RNA PCR 產(chǎn)物測(cè)序后拼接序列Fig.2 Splice sequences after sequencing of 16S r RNA PCR products of FY3 strains

2.4 動(dòng)物回歸及致病力測(cè)定試驗(yàn)

對(duì)6株分離菌株進(jìn)行動(dòng)物回歸及致病力測(cè)定試驗(yàn),將1 m L 濃度為1.0×106CFU/m L 的各分離菌株通過(guò)肌肉注射方式注入10月齡健康青年水貂的體內(nèi),在14 d內(nèi)觀察各組試驗(yàn)動(dòng)物的死亡情況和發(fā)病癥狀。結(jié)果表明,6株菌所攻毒水貂在5 d后不同時(shí)間內(nèi),感染水貂發(fā)熱、精神沉郁,體溫高達(dá)40℃以上;呼吸困難,并出現(xiàn)急性死亡,不同分離菌株導(dǎo)致水貂死亡比例不同(表2)。取肺組織涂片和肝組織印片進(jìn)行革蘭氏染色后顯微鏡下觀察,可見(jiàn)革蘭氏陰性桿菌,單個(gè)或成對(duì)存在,對(duì)其再進(jìn)行生化試驗(yàn),結(jié)果與表1鑒定結(jié)果一致,符合肺炎克雷伯桿菌特征。

表2 6株可疑肺炎克雷伯桿菌分離株動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Animal regression test results of 6 suspected Klebsiella pneumoniae isolates

以上不同強(qiáng)毒分離菌株在1.0×106CFU/m L時(shí),肌肉注射后可引起20%～100%的水貂死亡。其中FY3和FY4毒力顯著高于其他分離株。

2.5 強(qiáng)毒分離株對(duì)易感水貂最小致死量測(cè)定結(jié)果

取FY3、FY4毒株的普通肉湯培養(yǎng)液,分別稀釋成1.0×105、2.5×105、5.0×105、1.0×106、1.5×106CFU/m L并接種10月齡健康易感青年貂,在14 d內(nèi),5.0×105CFU/m L以上濃度時(shí)可引起全部接種水貂死亡(表3)。通過(guò)表3可以看出,FY3即ZC1108 株(2011 年分離自山東諸城的毒株)的最小完全致死量為5.0×105CFU/m L。

由表3還可看出,FY3和FY4分離株的最小完全致死劑量均為5.0×105CFU/m L,但FY4致死所需時(shí)間較長(zhǎng)。另外幾個(gè)分離株因致死水貂死亡數(shù)量或時(shí)間較長(zhǎng),未進(jìn)行最小完全致死劑量研究。因此ZC1108株為所有分離株中致病力較強(qiáng)的菌株,故可能具有較好的免疫原性。

表3 分離株FY3和FY4不同感染量對(duì)易感水貂致死率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of different infection doses of isolates FY3 and FY4 on mortality of susceptible mink

2.6 強(qiáng)毒分離株的免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

將確定的ZC1108分離株做成20%氫氧化鋁膠佐劑滅活疫苗,將10月齡健康易感青年貂20只分為4 組,每組5 只,分別皮下注射疫苗1.0 m L(細(xì)菌含量分別為1.0×109CFU/m L、2.0×109CFU/m L、3.0×109CFU/m L 和4.0×109CFU/m L)。另取5只健康水貂注射同量PBS作為非免疫對(duì)照。接種21 d后,每只水貂各肌肉注射ZC1108株菌液1.0 m L(1.0×106CFU/m L),觀察14 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照水貂全部死亡,免疫水貂健活情況詳見(jiàn)表4。

從表4可以看出,ZC1108株的最小有效免疫劑量為2.0×109CFU,在該劑量下被免疫水貂即可實(shí)現(xiàn)100%的保護(hù)率,保護(hù)效果顯著優(yōu)于1.0×109CFU 免疫劑量。

表4 ZC1108分離株免疫原性及保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Immunogenicity and protective test results of ZC1108 isolate strain

3 討論

2019年中國(guó)水貂取皮1 169萬(wàn)張左右,最大省份為山東省,其次為遼寧、黑龍江、河北等省市,都具有很大的養(yǎng)殖規(guī)模。水貂養(yǎng)殖受到各種傳染病威脅,主要為病毒病和細(xì)菌病,細(xì)菌病中以綠膿桿菌為主要威脅病原[2,6-7],但近些年也有少部分受肺炎克雷伯桿菌感染威脅,或者見(jiàn)于少部分是兩種菌以上混合感染的病例[8-10]。此外,豬等家畜也有肺炎克雷伯桿菌感染的病例,相關(guān)團(tuán)隊(duì)也對(duì)該菌相關(guān)特性進(jìn)行了分析[11-12]。筆者從自然發(fā)病水貂出血性肺炎沒(méi)有銅綠假單胞菌的病例病料中分離到6株可疑肺炎克雷伯桿菌,經(jīng)系統(tǒng)的生化試驗(yàn)、基因序列、致病性等鑒定為肺炎克雷伯桿菌。從分離結(jié)果看肺炎克雷伯桿菌可能是這些水貂病例肺部感染和血液感染的主要致死原因。肺炎克雷伯桿菌在醫(yī)學(xué)臨床上也能引起人的肺炎、菌血癥、尿路感染等,屬于人獸共患病病原,其致病性越來(lái)越強(qiáng)。因此,研制針對(duì)肺炎克雷伯桿菌的疫苗非常必要,先前也有對(duì)包含克雷伯桿菌在內(nèi)的亞單位苗、聯(lián)苗進(jìn)行相關(guān)研究[13-14],筆者對(duì)水貂進(jìn)行的疫苗免疫可行性分析結(jié)果獲得了較好的預(yù)期前景。

從動(dòng)物回歸試驗(yàn)、最小致死劑量和致病力及免疫原性試驗(yàn)的結(jié)果可見(jiàn),分離的FY3(ZC1108)和FY4株致病性最強(qiáng),攻毒1 m L 濃度為1.0×105CFU/m L 的菌液均能引起水貂發(fā)病,5.0×106CFU/m L 以上均可導(dǎo)致死亡;其中采用FY3分離株制備的疫苗免疫動(dòng)物后,再用1.0×106CFU/m L攻毒后可達(dá)到5/5健活,免疫所需細(xì)菌數(shù)量為2.0×109CFU/m L 以上時(shí)就可達(dá)到很好的保護(hù)效果。因此,該毒株適合于作為肺炎克雷伯菌疫苗的候選株,可為水貂克雷伯桿菌預(yù)防提供潛在疫苗株,進(jìn)一步考慮多價(jià)苗的研發(fā),對(duì)防止動(dòng)物和人類(lèi)感染的源頭防控有積極作用。